羅氟司特類似物的合成及抑酶活性

李紅妍，王國成，楊 慧，劉文崢

(1.內(nèi)蒙古醫(yī)科大學(xué)研究生學(xué)院，呼和浩特 010110； 2. 天士力控股集團研究院化學(xué)藥物研究所，天津 300400)

7a:R,R,R,R=H,R=F,X=C 7b:R,R,R=H,R,R=F,X=C 7c:R,R,R,R=H,R=F,X=C7 d:R,R=F,R,R,R=H,X=C 7 e:R=CI,R,R,R=H,R=F,X=C 7 f:R,R,R=H,R,R=F,X=C7 g:R,R,R=H,R=CI,R=F,X=C 7 h:R,R,R=H,R=CF,R=F,X=C 7 I:R,R,R,R=F,X=N

?

實驗研究

羅氟司特類似物的合成及抑酶活性

李紅妍1，王國成2，楊 慧1，劉文崢2

(1.內(nèi)蒙古醫(yī)科大學(xué)研究生學(xué)院，呼和浩特 010110； 2. 天士力控股集團研究院化學(xué)藥物研究所，天津 300400)

目的：為了尋找活性更好的磷酸二酯酶Ⅳ(PDE Ⅳ)抑制劑，對羅氟司特進行結(jié)構(gòu)改造。方法：保留環(huán)丙基甲氧基和二氟甲氧基的結(jié)構(gòu)，以2-氨基-5-硝基苯酚(1)為起始原料，制備關(guān)鍵中間體3-環(huán)丙基甲氧基-4-二氟甲氧基苯胺(4)，設(shè)計合成一系列新型羅氟司特類似物。通過1H NMR、MS對化合物進行表征，并對合成的目標化合物進行了初步的抑酶活性測試。結(jié)果：9種目標化和物質(zhì)譜均發(fā)現(xiàn)分子離子峰，目標化合物7i和7e的IC50小于1.5，顯示出了一定的抑酶活性。結(jié)論：為進一步為探索新型PDE Ⅳ抑制劑提供了一定的理論依據(jù)。

磷酸二酯酶Ⅳ，羅氟司特，抑酶活性

羅氟司特(roflumilast)，化學(xué)名為3-環(huán)丙基甲氧基-N-(3, 5-二氯吡啶-4-基)-4-(二氟甲氧基)苯甲酰胺(結(jié)構(gòu)見圖1)，于1993年由Altana Pharma公司研發(fā)。歐盟已于2010年7月批準Nycomed公司，首次在德國上市，用于治療慢性阻塞性肺病(COPD)，美國FDA 于2011 年2 月28 日批準上市，該藥是一種選擇性PDE IV抑制劑，在哮喘和COPD的臨床治療中顯示了不凡的功效,因此有人預(yù)言其將取代類皮質(zhì)甾體和β2腎上腺素受體激動劑,成為新一代抗炎藥物[1-3]。

圖1 羅氟司特的結(jié)構(gòu)

1 合成路線

本研究對羅氟司特結(jié)構(gòu)進行改造，首先合成中間體3-環(huán)丙基甲氧基-4-二氟甲氧基苯胺(4)，共四步反應(yīng)。以2-氨基-5-硝基苯酚(1)為起始原料與環(huán)丙基溴甲烷反應(yīng)得到2-環(huán)丙基甲氧基-4-硝基苯胺(2)，再用20% KOH溶液加熱回流，將氨基變成羥基，得到2-環(huán)丙基甲氧基-4-硝基苯酚(3)，3與1-氯-1, 1-二氟乙酸甲酯在N,N-二甲基甲酰胺(DMF)中反應(yīng)得到2-環(huán)丙基甲氧基-1, 1-二氟甲氧基-4-硝基苯(4)，最終4經(jīng)過硝基還原成氨基得到5。羅氟司特類似物的合成，使用了9種不同的原料(6a-6i)與5反應(yīng)得到終產(chǎn)物7a-7i[4]。合成路線見圖2。

2 方法和結(jié)果

2.1 合成實驗

2.1.1 儀器與試劑 YRT-3型藥物熔點儀(天津天大天發(fā)科技有限公司)。Bruker AV 400 型核磁共振儀,以CDCl3或DMSO-d6為溶劑,TMS為內(nèi)標。MS：采用Agilent 1100 LC-MSD-Trap-SL質(zhì)譜儀。柱層析采用柱層析硅膠(200～300目)(青島海洋化工廠)。所用試劑均為市售分析純。

7a:R,R,R,R=H,R=F,X=C 7b:R,R,R=H,R,R=F,X=C 7c:R,R,R,R=H,R=F,X=C
7 d:R,R=F,R,R,R=H,X=C 7 e:R=CI,R,R,R=H,R=F,X=C 7 f:R,R,R=H,R,R=F,X=C
7 g:R,R,R=H,R=CI,R=F,X=C 7 h:R,R,R=H,R=CF,R=F,X=C 7 I:R,R,R,R=F,X=N

圖2 目標化合物7a-7i合成路線

2.1.2 合成

2.1.2.1 2-環(huán)丙基甲氧基-4-硝基苯胺(2) 將2-氨基-5-硝基苯酚(1)18 g (0.12 mol)、碳酸鉀21.6 g (0.156 mol)和N,N-二甲基甲酰胺150 ml加入反應(yīng)瓶中。氮氣保護下，攪拌加熱至55 ℃。滴加環(huán)丙基溴甲烷14.0 ml (110 mmol)DMF溶液。TLC(展開劑：石油醚-乙酸乙酯=3∶2)監(jiān)測反應(yīng)進程。反應(yīng)畢，將反應(yīng)液冷卻至室溫，倒入250 ml冰水中，乙酸乙酯(130 ml×3次)萃取，合并有機層，飽和氯化鈉溶液(60 ml×3次)洗滌，有機層無水Na2SO4干燥，過濾，濃縮。粗產(chǎn)品柱層析(洗脫劑：石油醚-乙酸乙酯=3∶2)分離純化，得純品約20.78 g，橙黃色結(jié)晶，產(chǎn)率85%。

2.1.2.2 2-環(huán)丙基甲氧基-4-硝基苯酚(3) 將(2) 15 g (0.072 mol)和20% KOH溶液250 ml加入反應(yīng)瓶中，加熱回流，TLC監(jiān)測反應(yīng)進程(展開劑：石油醚-乙酸乙酯=1∶1)。反應(yīng)畢，冷卻至室溫，用稀硫酸將濾液的pH調(diào)至4～5，待有固體析出，過濾，干燥，得乳白色粉末14 g，產(chǎn)率92%。

2.1.2.3 2-環(huán)丙基甲氧基-1,1-二氟甲氧基-4-硝基苯(4) 將(3) 11.10 g (53 mmol)、碳酸鉀25.7 g (10.186 mol)和DMF 200 ml加入反應(yīng)瓶中，攪拌，加熱至75 ℃，滴加1-氯-1，1-二氟乙酸甲酯9.66 ml (0.093 mol)的DMF溶液。TLC監(jiān)測反應(yīng)進程(展開劑：石油醚-乙酸乙酯=1∶2)，反應(yīng)畢，過濾，乙酸乙酯(150 ml×3次)萃取，飽和氯化鈉溶液(50 ml×3次)洗滌，無水MgSO4干燥，濃縮。粗產(chǎn)品柱層析(洗脫劑：石油醚-乙酸乙酯=10∶1)分離純化，得淺黃色粉末11.78 g，產(chǎn)率78%。

2.1.2.4 3-環(huán)丙基甲氧基-4-二氟甲氧基苯胺(5) 將鐵粉6.5 g(0.12 mol)和NH4Cl 0.4 mol/L, 250 ml溶液加入反應(yīng)瓶中，攪拌，加熱至70 ℃。滴加(4) 10 g (0.39 mol)的乙醇溶液，加熱，回流。TLC監(jiān)測反應(yīng)進程(展開劑：石油醚-乙酸乙酯=1∶1)，反應(yīng)完全后，濾去反應(yīng)液中的不溶固體，乙酸乙酯(150 ml×3次)萃取濾液，飽和氯化鈉溶液洗滌，無水Na2SO4干燥，濃縮。粗產(chǎn)品柱層析(洗脫劑：石油醚-乙酸乙酯=10∶1)分離純化，得棕色油狀物8 g，產(chǎn)率90%。

2.1.2.5 目標化合物7a的合成 將鄰氟苯乙酸200 mg(1.29 mmol)、二環(huán)己基碳二亞胺(DCC)500 mg及10 ml二氯甲烷加入反應(yīng)瓶中，攪拌。2 h后，加入(5) 274 mg(1.29 mmol)和50 mg的4-二甲氨基吡啶(DMAP)。反應(yīng)畢，過濾，濃縮，柱層析(洗脫劑：石油醚-乙酸乙酯=7∶2)分離純化，得純品白色粉末約395 mg，產(chǎn)率為85%。7b-7i的合成過程與7a類似,只是將鄰氟苯乙酸取代基進行不同的變換。

2.1.3 目標化合物7a-7i的合成結(jié)果

①N-[3-(環(huán)丙基甲氧基)-4-(二氟甲氧基)苯基]-2-(2-氟苯基)乙酰胺(7a): 白色粉,產(chǎn)率85%，mp 116.7～117.6 ℃;1H NMR (400 MHz,CDCl3) δ: 7.56 (d,J=2.4 Hz, 1H), 7.34 (td,J=10.6, 7.1, 4.6 Hz, 3H), 7.28 (, 1H), 7.22～7.11 (m, 2H), 7.07 (d,J=8.6 Hz, 1H), 6.68 (dd,J=8.6, 2.4 Hz, 1H), 5.31 (, 1H), 3.88 (d,J=7.0 Hz, 2H), 3.75 (, 2H), 1.6 (d,J=12.0 Hz, 1H), 1.37～1.19 (m, 1H), 0.7～0.56 (m, 1H), 0.41～0.27 (m, 1H); MS m/z (%): 388.1 [M+Na]+, 400.5 [M+Cl]-。

②N-[3-(環(huán)丙基甲氧基)-4-(二氟甲氧基)苯基]-2-(2, 5-二氟苯基)乙酰胺 (7b): 白色粉末,產(chǎn)率87%，mp 85.5～85.8 ℃;1H NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ: 10.29 (, 1H), 7.53 (d,J=2.2 Hz, 1H), 7.29～7.20 (m, 2H), 7.19～7.12 (m, 1H), 7.11 (d,J=8.7 Hz, 1H), 7.06 (dd,J=8.7,2.2 Hz, 1H), 3.82 (d,J=6.9 Hz, 2H), 3.74 (, 2H), 1.23 (ddd,J=9.2, 3.9, 2.3 Hz, 1H), 0.56 (dd,J=8.1, 1.8 Hz, 2H), 0.34 (dd,J=4.7, 1.5 Hz, 2H); MS m/z (%): 382.0 [M-H]-, 418.0 [M+Cl]+。

③N-[3-(環(huán)丙基甲氧基)-4-(二氟甲氧基)苯基]-2-(3-氟苯基)乙酰胺(7c): 白色粉末，產(chǎn)率90%，mp 92.5～94.0 ℃;1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ: 7.53 (d,J=2.2 Hz, 1H), 7.36 (dd,J=14.6, 7.6 Hz, 1H), 7.19 (, 1H), 7.10 (d,J=7.7 Hz, 1H), 7.04 (t,J=8.3 Hz, 3H), 6.64 (dd,J=8.6, 2.3 Hz, 1H), 3.84 (d,J=6.9 Hz, 2H), 3.70 (, 2H), 1.27 (d,J=8.5 Hz, 1H), 0.62 (q,J=5.8 Hz, 2H), 0.32 (q,J=4.9 Hz, 2H); MS m/z (%) 388.1 [M-Na]+, 400.4 [M+H]+。

④N-[3-(環(huán)丙基甲氧基)-4-(二氟甲氧基)苯基]-2-(2, 6-二氟苯基)乙酰胺(7d): 白色粉末，產(chǎn)率92%，mp 104.0～105.3 ℃;1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ: 9.81 (, 1H), 7.71 (t,J=6.7 Hz, 1H), 7.25 (dt,J=15.2, 7.6 Hz, 1H), 7.07～7.00 (m, 1H), 6.96～6.86 (m, 3H), 6.80～6.35 (m, 1H), 3.83 (t,J=5.8 Hz, 2H),3.78 (, 2H), 1.32～1.21 (m, 1H), 0.68～0.53 (m, 2H), 0.38～0.26 (m, 2H), MS m/z (%): 406.1 [M+Na]+, 419.9 [M+Cl]-。

⑤2-(2-氯-6-氟苯基)-N-[3-(環(huán)丙基甲氧基)-4-(二氟甲氧基)苯基]乙酰胺(7e): 白色粉末， 產(chǎn)率91%， mp130.9～131.9 ℃;1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ: 7.62 (d,J=2.1 Hz, 1H), 7.43 (, 1H), 7.30～7.21 (m, 2H), 7.12～7.04 (m, 2H), 6.67 (dd,J=8.6, 2.2 Hz, 1H), 4.33 (t,J=6.7 Hz, 1H), 3.92 (d,J=1.3 Hz, 2H), 3.85 (d,J=6.9 Hz, 2H), 0.99 (d,J=14.7, 7.2 Hz, 1H), 0.63 (q,J=5.8 Hz, 2H), 0.33 (q,J=4.9 Hz, 2H); MS m/z(%): 433.9 [M+Cl]-。

⑥N-[3-(環(huán)丙基甲氧基)-4-(二氟甲氧基)苯基]-2-(2, 4-二氟苯基)乙酰胺(7f): 白色粉末, 產(chǎn)率89%， mp 127.4～128.9 ℃;1H NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ: 9.09 (, 1H), 8.49 (d,J=1.8 Hz, 1H), 7.40 (d,J=2.4 Hz, 1H), 7.12～6.99 (m, 2H), 6.87 (dd,J=8.7, 2.4 Hz, 1H)，3.85(t，J=8.8 Hz, 2H), 3.34 (, 2H), 2.51 (dt,J=3.6, 1.8 Hz, 2H), 1.28～1.19 (m, 1H), 0.62～0.51 (m, 2H), 0.40～0.31 (m, 2H); MS m/z (%): 406.2 [M+Na]+,384.2 [M+H]+。

⑦2-(3-氯-2-氟苯基)-N-[3-(環(huán)丙基甲氧基)-4-(二氟甲氧基)苯基]乙酰胺(7g): 白色粉末，產(chǎn)率94%， mp 108.3～109.8 ℃;1H NMR (400 MHz,DMSO-d6) δ: 10.33 (, 1H), 7.59～7.44 (m, 2H), 7.37 (dd,J=10.4, 3.9 Hz, 1H), 7.10 (, 1H), 7.08 (dt,J=8.7, 5.4 Hz, 2H), 6.98 (, 1H), 3.86～3.76 (m, 4H), 1.27～1.18 (m, 1H), 0.59～0.51 (m, 2H), 0.38～0.30 (m, 2H); MS m/z (%): 400.1[M+H]+, 398.0[M-H]-。

⑧N-[3-(環(huán)丙基甲氧基)-4-(二氟甲氧基)苯基]-2-[2-氟-5-(三氟甲基)苯基]乙酰胺(7h)： 白色粉末，產(chǎn)率90%， mp 140.2～140.9 ℃;1H NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ: 10.35 (, 1H), 7.84 (dd,J=6.6, 2.0 Hz, 1H), 7.78～7.70 (m, 1H), 7.53 (d,J=2.2 Hz, 1H), 7.44 (t,J=9.0 Hz, 1H), 7.12～7.03 (m, 2H), 6.98 (, 1H), 3.33 (, 4H), 1.30～1.15 (m, 1H), 0.60～0.50 (m, 2H), 0.36～0.28 (m, 2H); MS m/z (%): 434.2 [M+H]+, 456.2 [M+Na]+。

⑨N-[3-(環(huán)丙基甲氧基)-4-(二氟甲氧基)苯基]-2-(四氟吡啶-4-基)乙酰胺(7i): 白色粉末，產(chǎn)率95%， mp 132.1～133.3 ℃;1H NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ: 10.52 (, 1H), 7.48 (d,J=2.3 Hz, 1H), 7.13 (d,J=8.6 Hz, 1H), 7.04 (dd,J=8.7, 2.3 Hz, 1H), 4.04 (d,J=12.0 Hz, 2H), 3.83 (t,J=10.2 Hz, 2H), 1.31～1.16 (m, 1H), 0.62～0.51 (m, 2H), 0.42～0.27 (m, 2H); MS m/z (%): 418.9 [M-H]-, 454.9 [M+Cl]-。

2.2 抑酶活性測試

2.2.1 實驗板的準備 將最終得到的抑制劑用DMSO稀釋100倍，在96孔板中加入稀釋后溶液100 μl，連續(xù)稀釋化合物溶液到10個濃度梯度，記為A1～A10，并在該板中向兩個空板加入只有DMSO的溶液100 μl,記為A11～A12。從該96孔板中分別吸取5 μl溶液到一個新的96空板并向其分別加緩沖液95 μl，振搖混合均勻，作為媒介板記為B1～B12。從媒介板B1分別轉(zhuǎn)移5 μl到384孔板的C1、C2，B2轉(zhuǎn)移到384孔板的C3、C4，以此類推，得到最終的實驗板。

2.2.2 底物與PDE酶的準備 用緩沖液將酶稀釋2.5倍，分別向?qū)嶒灠逯屑尤? μl(空白組只有DMSO,對照組只有酶控制不加化合物),充分振搖。同理底物也用緩沖液稀釋2.5倍，分別向?qū)嶒灠寮? μl,充分振搖。蓋住實驗板室溫下培育60 min[5,6]。

2.2.3 反應(yīng)檢測 制備抗體熒光標記溶液，分別向每個實驗板中加入5 μl并培育60 min。在儀器上可以看到結(jié)果。從儀器上將RFU(相對熒光單位)曲線復(fù)制下來，將RFU曲線轉(zhuǎn)變成百分濃度抑制曲線。按公式計算百分濃度抑制率：百分濃度抑制率=(樣品的RFU-最小值)/(最大值-最小值)，“最小值”表示沒有酶控制組的RFU值，“最大值”表示空白組的RFU值。根據(jù)化合物濃度與相應(yīng)抑制率用MicroSoft excel制作散點圖，添加趨勢線，計算斜率求出IC50值。

2.2.4 抑酶活性測試結(jié)果 對合成出來的9種化合物進行了抑酶活性測試，采用熒光標記抗體方法，測定各個實驗組化合物的相對熒光單位，并轉(zhuǎn)化成百分濃度抑制率，利用MicroSoft excel 計算出IC50值，見表1。從表1可以看出，7a、7c、7g的IC50值均大于10 nmol/L, 7i和7e的IC50值均小于1.5 nmol/L。

表1 目標化合物的IC50值

3 討論

通過多步反應(yīng)合成了一系列新型羅氟司特類似物物。羅氟司特的合成有6條途徑，其中通過關(guān)鍵中間體3-環(huán)丙基甲氧基-4-二氟甲氧基苯甲酸制備羅氟司特有三條途徑，本試驗合成的類似物將制備關(guān)鍵中間體的起始原料用3-硝基-4-羥基苯甲酸甲酯替換為2-氨基-5-硝基苯酚(1)，經(jīng)4步反應(yīng)得到3-環(huán)丙基甲氧基-4-二氟甲氧基苯胺(5)，(5)分別與6a～6i反應(yīng)得到目標化合物。

合成的9種化合物初步的抑酶活性測試結(jié)果表明,目標化合物7i和7e具有一定的抑酶活性,為探索新型PDE Ⅳ抑制劑提供了一定的理論依據(jù)。

1 Kodimuthali A，Jabaris L，Pal M.Recent advances on phosphodiesterase 4 inhibitors for the treatment of asthma and chronic obstructive pulmonary disease[J]. J Med Chem，2008,51(18):5471-5489

2 馮桂山,宋寧,段爭,等.羅氟司特治療慢性阻塞性肺疾病藥理作用的臨床前研究現(xiàn)狀[J].臨床薈萃，2011,26(4):363-366

3 Wunder F,Quednau R,Geerts A,etal.Characterization of the cellular activity of PDE 4 inhibitors using two novel PDE 4 reporter cell lines[J].Molecular Pharmaceutics,2013,10(10):3687-3705

4 楊展雄,孫煥亮,蔡開明.羅氟司特的合成路線圖解[J].華西藥學(xué)雜志，2014,29(2):222-223

5 Soto F J,Hanania N. A selective phosphodicsterase-4 inhibitors in chronic obstructive lung disease[J].Curr in Pulm Med，2005,11(2):129-134

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《天津藥學(xué)》雜志投稿規(guī)范

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期刊：作者.文題[J].期刊名，出版年，卷(期)：起-止頁

注意：3名以內(nèi)的需全部列出，超過3名的只列前3名后加“等”或“etal”，作者之間用“，”號分隔。

例1 秦永平，黃英，梁茂植，等.血清中羅紅霉素的高效液相色法測定[J].藥物分析雜志，1997，17(4)：249-250

例2 Delatour F,Le Guludec D,Caron F,etal.Effect of a single oral dose of two erythromycin ethylsuccinate formulations on gastric emptying in healthy Volunteers:a scintigraphic study[J].Fundam Clin Pharmacol,1998,12(3):292

書籍：編著者.書名[M].版次.出版地：出版者，年：起-止頁

例1 陳新謙，金有豫.新編藥物學(xué)[M].第14版.北京：人民衛(wèi)生出版社，1997：243-245

注意：著錄參考文獻除要求項目齊全外，每項后標點符號使用也應(yīng)按示例進行標點。

2.表示量和單位依照GB3000～3102《量和單位》系列標準執(zhí)行。法定單位用符號表示，不宜用中文書寫(如用ml、mg、min分別表示毫升、毫克、分等)。

禁止使用非法定計量單位(包括臨床實驗室檢查項目的單位)，如“N”(當量濃度)、“M”(克分子濃度)、“ppm”(百萬分之一)，應(yīng)當改寫成“mol/L”和“10-6”。但血壓單位恢復(fù)使用“mmHg”。

藥品質(zhì)量與檢驗

Synthesis and enzyme Inhibiting activity of roflumilast analogs

Li Hongyan1,Wang Guocheng2，Yang,Hui1，Liu Wenzheng2

(1. School of Inner Mongolia Medical University, Hohhot 010110；2. Institution of Chem-Pharm R&D of Tasly,Tianjin 300400)

Objective: To get better phosphodiesterase IV (PDE IV) inhibitors by a series of modifications of the structure of roflumilast. Method:A numberof noval roflumilast analogues were designed and synthized through the preparation of 3-cyclopropyl-methoxy-4-difluoromethoxy aniline(4),a key intermediate with 2-amino-5-nitrophenol (1) as a starting material, while the structures of cyclopropyl methoxy and difluoromethoxy groups being reserved. The resulting compounds were characterized by1H NMR and MS. The inhibiting activity of the target compounds on enzymes were preliminarily tested.Results: Molecular ion peaks were found in nine substances by MS,and compounds 7i and 7e showed a certain capability of inhibiting activity with both IC50being less than 1.5.Conclusion: The study set a theoretical basis for developing more novel PDE Ⅳ inhibitors.

phosphodiesterase Ⅳ，roflumilast，enzyme inhibitory activity

2015-07-01

TQ460

A

1006-5687(2015)05-0001-04