基于硝基苯類光扳機兩親性嵌段共聚物的合成及其光響應(yīng)性質(zhì)研究

張葉葉，林秋寧，盧光照，朱麟勇，鐘延強，鄒 豪＊

（1.第二軍醫(yī)大學 藥學院 藥劑學教研室，上海 200433；2.華東理工大學 化學與分子工程學院 結(jié)構(gòu)可控先進功能材料及其制備教育部重點實驗室，上海 200237）

在過去幾十年里，許多功能化的聚合物膠束在藥物傳遞中應(yīng)用十分廣泛。其中，用于控制藥物釋放的環(huán)境響應(yīng)型（包括對溫度、pH、光等刺激的響應(yīng)）載體吸引了許多研究者的注意力［1，2］。而在眾多的響應(yīng)載體中，光響應(yīng)載體具有“潔凈、無創(chuàng)、高效”和“定時、定點、定速”的優(yōu)點［3］。并且，相對于其他響應(yīng)，光反應(yīng)不需要任何特定化學環(huán)境的變化［4］，只需要開啟或關(guān)閉光源就可以控制光反應(yīng)過程。

構(gòu)建光響應(yīng)膠束主要有兩種策略：（1）光照使光扳機發(fā)生可逆的結(jié)構(gòu)變化［5-7］。常用螺吡喃、偶氮苯等構(gòu)建此類膠束。這些基團光異構(gòu)化的可逆性不僅能使膠束解組裝，也可使膠束重新組裝；（2）光照誘發(fā)光扳機不可逆的斷裂［8-10］。構(gòu)建此類膠束體系的光扳機包括鄰硝基芐基類、香豆素類等。光照使得光扳機離去，從而膠束解組裝。這兩種膠束體系相比，前者對親疏水平衡改變較弱，光響應(yīng)動力學慢，每個光照周期，膠束體系很難恢復(fù)至初始狀態(tài)，因此應(yīng)用受到很大限制。

光響應(yīng)型膠束的結(jié)構(gòu)通常由一條親水性主鏈及連有疏水性的光扳機側(cè)鏈組成［11］。光照后，疏水段的極性發(fā)生變化，從而導(dǎo)致膠束解組裝。例如Liu等合成的S-（o-硝基芐酯）-L-半胱氨酸和PEG組成的嵌段共聚物，光照誘發(fā)o-硝基芐基斷裂，疏水作用減弱，釋放藥物［12］。除了作為疏水側(cè)鏈，光扳機也可插入主鏈重復(fù)單元中。光照導(dǎo)致主鏈斷裂，膠束內(nèi)核快速降解，伴隨藥物“暴釋”。例如Zhao合成的主鏈疏水段含有硝基苯類重復(fù)單元的兩親性三嵌段共聚物PEO-b-PUNB-b-PEO，光照下疏水段快速降解為小分子，膠束疏水核快速瓦解，釋放藥物［13］。還有一類膠束是以單個光扳機作為膠束殼與核的連接部分，光照使膠束核內(nèi)疏水鏈釋放出來，疏水鏈發(fā)生聚集并沉淀，膠束解組裝釋放藥物。

光響應(yīng)膠束的優(yōu)勢在于控制藥物釋放可以降低藥物的泄露，減少不良反應(yīng)的發(fā)生，因此本文制備了一個光響應(yīng)的聚合物釋藥載體。作為藥物運輸載體，光響應(yīng)膠束必須具有良好的生物相容性和生物可降解性。因此，我們選取了生物相容性好、具有“隱形”作用的PEG作為親水鏈，選用了目前研究最為廣泛的硝基苯類光扳機。而光扳機種類的不同，以及光扳機在聚合物結(jié)構(gòu)中位置的不同，會直接影響載體瓦解的速率，進而影響藥物釋放的快慢。所以，與已有報道的o-硝基芐基光響應(yīng)型共聚物不同，本課題以香草醛（vanilin）為起始原料，通過對光扳機進行結(jié)構(gòu)修飾，在光扳機的苯環(huán)上引入甲氧基，使得該光扳機的吸收波長紅移，光解量子效率提高，本課題首次將該類型的光扳機作為親疏水段的連接點，制備快速光響應(yīng)型的控制釋藥聚合物膠束，具有潛在的生物醫(yī)學應(yīng)用的可能性。

1 實驗部分

1.1 主要的試劑與原料

香草醛（阿拉丁試劑有限公司）、溴代十二烷（阿拉丁試劑有限公司）、硼氫化鈉（上海天蓮化工科技有限公司）、4-二甲氨基吡啶（上海薩恩化學技術(shù)有限公司）、PEG1000-NH2（嘉興博美有限公司）、六氟磷酸苯并三唑-1-基-氧基三吡咯烷基磷（Py-Bop）（上海泰坦化學有限公司）、硝酸、乙酸酐、丁二酸酐、碳酸鉀均從上海凌峰化學試劑有限公司購置。

1.2 兩親性嵌段共聚物的制備

1.2.1 光扳機S-（o-硝基-m-甲氧基-p-十二烷氧基芐醇）（VND）的合成

VND的合成路線如圖1所示。

（1）化合物1的合成：將香草醛（3.0g，19.7 mmol）、溴十二烷（9.8g，39.4mmol）、碳酸鉀（8.2g，59.1mmol）、100mL 乙 腈 一 并 加 入250mL的單口圓底燒瓶中，混合物在攪拌下加熱至70℃，TLC監(jiān)測反應(yīng)進程直至反應(yīng)完全。反應(yīng)結(jié)束后，過濾、減壓蒸除乙腈、過硅膠柱進行純化，洗脫劑為石油醚∶二氯甲烷＝1∶1，得白色固體，產(chǎn)率為70.6%。

（2）化合物2的合成：在50mL圓底燒瓶中加入10mL濃硝酸，磁力攪拌下，于冰浴中緩慢滴加5mL乙酸酐。滴加完畢后，繼續(xù)攪拌30min得A液。在100mL圓底燒瓶中加入化合物1和5mL乙酸酐，超聲下，固體原料溶解得B液。磁力攪拌下，緩慢滴加A液于B液中，滴加完畢后，室溫反應(yīng)2h。反應(yīng)結(jié)束后，將上述反應(yīng)液傾入冰水中，過濾得沉淀并溶于二氯甲烷，以無水硫酸鈉干燥后，過濾、減壓蒸除溶劑二氯甲烷得粗品。將上述粗品于乙醇中重結(jié)晶即得黃色固體產(chǎn)物，產(chǎn)率為82%。

圖1 光扳機VND的分子結(jié)構(gòu)和合成路線圖The structure and schematic presentation of the synthetic route of phototrigger VND

（3）VND的合成：在100mL的圓底燒瓶中加入化合物2（3.48g，9.5mmol）和200mL甲醇，超聲溶解。緩慢加入硼氫化鈉（0.72g，19.0 mmol），室溫反應(yīng)1h，TLC監(jiān)測反應(yīng)進程。反應(yīng)結(jié)束后，滴加入1mol/L鹽酸溶液中和。減壓蒸除溶劑，二氯甲烷萃取所得水溶液，無水硫酸鈉干燥有機相。過濾、減壓蒸除溶劑二氯甲烷得粗品。粗品以二氯甲烷為洗脫液，經(jīng)硅膠柱分離純化后得微黃色固體產(chǎn)物，產(chǎn)率為85.9%。

1.2.2 光響應(yīng)型兩親性嵌段共聚物聚乙二醇-S-（o-硝 基-m-甲 氧 基-p-十 二 烷 氧 基 芐 酯）（PEGVND）的制備

PEG-VND的合成路線見圖2。

（1）化合物3的合成：將 VND（3.01g，8.15 mmol）、丁二酸酐（1.63g，16.3mmol）、10mL吡啶和4-二甲氨基吡啶一并加入50mL圓底燒瓶中，將混合物加熱至50℃，攪拌下反應(yīng)24h。減壓蒸除吡啶，以二氯甲烷∶甲醇＝100∶1為洗脫液，經(jīng)硅膠柱分離純化后得到微黃色固體（2.52 g），產(chǎn)率為54.3%。

圖2 PEG-VND的分子結(jié)構(gòu)和合成路線圖The structure and schematic presentation of the synthetic route of PEG-VND

（2）PEG-VND的合成：在50mL的圓底燒瓶中，加入PEG-NH2、化合物3、PyBop和10mL二氯甲烷，室溫攪拌30min。反應(yīng)結(jié)束后，蒸除二氯甲烷，以二氯甲烷∶甲醇＝100∶1為洗脫液，經(jīng)硅膠柱分離純化得到微黃色蠟狀固體，即為光刺激響應(yīng)的聚合物PEG-VND。

1.3 結(jié)構(gòu)表征和樣品性能表征

各產(chǎn)物用CDCl3溶解，1HNMR由Bruker 400MHz核磁共振儀測試得到。FT-IR是通過KBr壓片，由Nexus 670型傅里葉變換紅外光譜儀測得。光照通過CHF-XM-500W型氙燈光源，365nm窄通道濾光片實現(xiàn)。采用馬爾文Zetasizer Nano ZS型納米粒度分析儀測定膠束粒徑、PDI、Zeta。膠束形貌 用JEOL JEM-1400透射電鏡進行觀察。Shimadzu UV-2550紫外可見光譜儀測定光照下其吸收光譜的變化。用Varian Cary Eclipses熒光分光光度計測定聚合物膠束的臨界膠束濃度以及光控釋放尼羅紅的性質(zhì)。

1.4 膠束的制備及載入模型藥物尼羅紅

采用直接法制備空白膠束溶液：稱取4mg PEG-VND溶于2mL去離子水中，超聲，得到濃度為2.0mg/mL的膠束溶液。用馬爾文粒徑儀測定聚合物膠束的粒徑、PDI和Zeta電位。TEM測空白膠束的形貌。

制備載尼羅紅膠束溶液：稱取一定量的尼羅紅溶于四氫呋喃，配制成濃度為1.0×10-3mol/L的溶液，取10μL，在攪拌條件下滴入空白膠束溶液中。蒸除四氫呋喃，即得到載尼羅紅的膠束溶液。

1.5 測定臨界膠束濃度和光響應(yīng)行為

臨界膠束濃度（CMC）的測定：配制一系列濃度（5.0×10-4、1.0×10-3、2.5×10-3、5.0×10-3、1.0×10-2、2.5×10-2、5.0×10-2、0.1、0.25、0.5、1.0mg/mL）的空白膠束溶液各1mL，向其中加入10μL尼羅紅的四氫呋喃溶液。超聲30min后，測I633處熒光強度。以I633對LogC作圖，采用origin 8.0進行線性模擬，曲線的交界處即為聚合物的臨界膠束濃度。

聚合物膠束光響應(yīng)性質(zhì)紫外測試：配制聚合物濃度為0.5mg/mL的二氯甲烷溶液。用365 nm，15mW/cm2的強度光照，隔一定的時間用紫外分光光度計掃描聚合物溶液的250～500nm的光譜，跟蹤光反應(yīng)過程。

聚合物膠束包載釋放尼羅紅測試：配制2.0 mg/mL的空白膠束溶液，按上述方法載入尼羅紅。取其中1mL加入至比色皿中，用365nm、15 mW/cm2的強度光照，隔一定時間用熒光分光光度計（激發(fā)波長530nm，發(fā)射波長633nm）測熒光強度。

2 結(jié)果與討論

2.1 結(jié)構(gòu)的表征

PEG-VND結(jié)構(gòu)如圖3所示。1HNMR：PEGVND（400MHz，CDCl3）：7.71（Ha），7.07（Hb），6.47（Hc），5.54（Hd），4.08（He），4.02（Hf），3.70（Hg），3.38（Hh），3.15（Hi），2.80（Hj），2.58（Hk），1.89（Hl），0.88（Hm）。在化學位移1.2～1.5處為疏水鏈十二烷基的質(zhì)子峰。圖4清晰表明了所合成的聚合物即為目標產(chǎn)物。

圖5為PEG-NH2和PEG-VND的 FT-IR譜圖：1739cm-1為羰基（C O）的伸縮振動特征峰；1523cm-1處為苯環(huán)的特征吸收峰；921cm-1處顯現(xiàn)出硝基基團的伸縮振動峰。這些數(shù)據(jù)都證明了PEG-VND的成功制備。

圖3 PEG-VND的分子結(jié)構(gòu)The structure of PEG-VND

圖4 PEG-VND的1 HNMR譜圖The 1 HNMR spectrum of PEG-VND

2.2 聚合物膠束的表征

聚合物PEG-VND空白膠束的粒徑分布和透射電鏡圖像如圖6所示，PEG-VND在水溶液中能形成分布良好的納米級膠束，平均粒徑為55.7nm，粒徑分布指數(shù)為0.144，Zeta為8.7mV。TEM可清晰的顯示膠束為球形，分散良好，粒徑約為40nm。

在測臨界膠束濃度實驗中，以I633對Logc作圖，得到兩條有交點的直線，如圖7所示，此交點即為聚合物膠束的CMC值。CMC值為2.8×10-2mg/mL。

圖5 PEG-NH2和PEG-VND的FT-IR譜圖The FT-IR spectrum of PEG-NH2and PEG-VND

圖6 PEG-VND的膠束粒徑分布圖和透射電鏡圖The size distribution and TEM of PEG-VND

圖7 PEG-VND的臨界膠束濃度圖The CMC of PEG-VND

2.3 膠束的光響應(yīng)行為研究

我們設(shè)計合成了光響應(yīng)的聚合物膠束載體，該載體最特殊的性能就是具備光響應(yīng)性。首先，用紫外吸收光譜測試該聚合物在光照條件下的光化學變化。如圖8所示，隨著光照時間的增加，聚合物在290nm處的紫外吸收逐漸下降，350nm處的紫外吸收逐漸紅移至380nm，這說明聚合物在光照下發(fā)生了光化學反應(yīng)。

圖8 365nm光照（光強15mW/cm2）PEG-VND的紫外-可見光吸收光譜的變化Evolution of the UV-Vis absorption spectrum of PEG-VND under irradiation at 365nm （15mW/cm2）

如引言所述，我們合成的是一個光響應(yīng)藥物載體，其通過自組裝形成載藥納米膠束，在到達病灶部位后，光照下釋放藥物。因此，選用了疏水染料尼羅紅作為模型藥物來研究膠束的光響應(yīng)釋放行為。首先，對載尼羅紅膠束的水溶液檢測其熒光發(fā)射強度。尼羅紅自身的疏水結(jié)構(gòu)決定了其在水中沒有熒光發(fā)射，在疏水環(huán)境中才具有熒光發(fā)射。因此，用550nm波長激發(fā)時，發(fā)現(xiàn)體系有較強的尼羅紅熒光發(fā)射，說明尼羅紅已載入膠束中。然后，對上述體系進行光照，隨光照時間的推移，膠束內(nèi)尼羅紅熒光發(fā)射強度越來越弱，如圖9所示。這是因為聚合物膠束隨光照的進行逐漸降解，膠束解組裝，尼羅紅被釋放到水中，從而熒光發(fā)射強度逐漸降低。圖9a是載尼羅紅光響應(yīng)膠束的熒光發(fā)射光譜隨光照時間的變化情況。圖9a中插圖為光照前后載尼羅紅光響應(yīng)膠束水溶液的顏色變化對比，說明尼羅紅釋放到水溶液中。圖9b是光照與非光照條件下，以及光響應(yīng)膠束（PEG-VND）與非光響應(yīng)膠束（PEG-PLA）的尼羅紅在633nm處歸一化熒光發(fā)射強度變化。對比非光響應(yīng)載尼羅紅膠束的熒光變化曲線（圖9b紅線），說明尼羅紅的熒光下降不是光漂白現(xiàn)象，而是光照膠束解組裝釋放尼羅紅的結(jié)果。從圖9b可以看出，在365nm，15mW/cm2的光強下，膠束快速解組裝，釋放尼羅紅，7min內(nèi)尼羅紅熒光強度下降了約80%。

3 結(jié)論

圖9 （a）載尼羅紅光響應(yīng)膠束的熒光發(fā)射光譜隨光照時間的變化，插圖：載尼羅紅光響應(yīng)膠束在光照前后的熒光成像圖；（b）各條件下，尼羅紅在633nm處歸一化的熒光發(fā)射強度（a）Evolution of the Fluorescence emission spectrum of PEG-VND with the increased irradiation time，inset：fluorescence photographs before（left）and after（right）irradiation.（b）Normalized fluorescence emission intensity of NR at 633nm in different conditions

通過疏水鏈修飾的硝基苯類光扳機與親水鏈PEG高分子的成功鍵連，我們合成了一個具有光響應(yīng)性的AB型兩親性嵌段共聚物PEG-VND，在光扳機的苯環(huán)上引入甲氧基使得該光扳機的吸收波長紅移，光解量子效率提高，將此類光扳機作為親疏水段的連接點，制備的膠束具有響應(yīng)迅速、釋藥可控的前景。該兩親性嵌段共聚物可以在水溶液中自組裝成形態(tài)均勻、分布良好的聚合物膠束。用馬爾文粒徑儀和TEM對其粒徑和形貌進行了檢測。通過紫外可見光照實驗說明該聚合物具有光刺激響應(yīng)性。模型藥物尼羅紅的成功載入和光照釋放進一步證實了PEG-VND在藥物光響應(yīng)釋放中的應(yīng)用潛力。

［1］ Chaterji S，Kwon I K，Park K.Smart polymeric gels：redefining the limits of biomedical devices［J］.Progress in Polymer Science，2007，32（8-9）：1083-1122.

［2］ Yamato M，Akiyama Y，Kobayashi J，Yang J，Kikuchi A，Okano T.Temperature-responsive cell culture surfaces for regenerative medicine with cell sheet engineering［J］.Progress in Polymer Science，2007，32（8-9）：1123-1133.

［3］ Alvarez-Lorenzo C，Bromberg L，Concheiro A.Light-sensitive intelligent drug delivery systems［J］.Photochem Photobiol，2009，85（4）：848-860.

［4］ Li M H，Keller P.Stimuli-responsive polymer vesicles［J］.Soft Matter，2009，5（5）：927-937.

［5］ Han D，Tong X，Zhao Y.Block copolymer micelles with a dual-stimuli-responsive core for fast or slow degradation［J］.Langmuir，2012，28（5）：2327-2331.

［6］ Cabane E，Malinova V，Meier W.Synthesis of photocleavable amphiphilic block copolymers：toward the design of photosensitive nanocarriers［J］.Macromolecular Chemistry and Physics，2010，211（17）：1847-1856.

［7］ Yang H，Jia L，Wang Z F，Di-Cicco Aurélie，Lévy Daniel，Keller Patrick.Novel photolabile diblock copolymers bearing truxillic acid derivative junctions［J］.Macromolecules，2011，44（1）：159-165.

［8］ Schumers J M，Gohy J F，F(xiàn)ustin C A.A versatile strategy for the synthesis of block copolymers bearing aphotocleavable junction［J］.Polymer Chemistry，2010，1（2）：161-163.

［9］ Katz J S，Zhong S，Ricart B G，Pochan D J，Hammer D A，Burdick J A.Modular synthesis of biodegradable diblock copolymers for designing functional polymersomes［J］.Journal of the American Chemical Society，2010，132（11）：3654-3655.

［10］ Cabane E，Malinova V，Menon S，Palivana C G ，Meier W.Photoresponsive polymersomes as smart，triggerable nanocarriers［J］.Soft Matter，2011，7（19）：9167-9176.

［11］ Zhao Y.Light-responsive block copolymer micelles［J］.Macromolecules，2012，45（9）：3647-3657.

［12］ Liu G，Dong C M.Photoresponsive poly（S-（o-nitrobenzyl）-L-cysteine）-b-PEO from aL-cysteineN-carboxyanhydride monomer：synthesis，self-assembly，and phototriggered drug release［J］.Biomacromolecules，2012，13（5）：1573-1583.

［13］ Han D H，Tong X，Zhao Y.Fast photodegradable block copolymer micelles for burst release［J］.Macromolecules，2011，44（3）：437-439.