組織工程牙髓再生的研究進(jìn)展

王冠華

天津市口腔醫(yī)院暨南開大學(xué)口腔醫(yī)院中心實(shí)驗(yàn)室　300041

組織工程牙髓再生的研究進(jìn)展

王冠華

天津市口腔醫(yī)院暨南開大學(xué)口腔醫(yī)院中心實(shí)驗(yàn)室300041

摘要齲病、牙髓病是普遍危害人類健康的疾病，目前臨床主要采用樹脂充填或根管治療方法。盡管上述治療方法均能一定程度的恢復(fù)牙齒解剖形態(tài)及功能，但是無法替代有正常功能的牙髓組織，導(dǎo)致牙齒失去營(yíng)養(yǎng)容易變脆劈裂，最終造成牙齒的缺失。隨著組織工程技術(shù)的廣泛應(yīng)用，組織工程牙髓再生逐漸得到發(fā)展和重視。本文系統(tǒng)回顧了牙髓組織工程研究進(jìn)展，包括種子細(xì)胞、生長(zhǎng)因子及用于牙髓組織工程的常用支架材料等內(nèi)容。

關(guān)鍵詞組織工程牙髓干細(xì)胞牙髓再生

齲病是人類發(fā)病率最高的疾病之一，如果未得到有效的治療，就會(huì)發(fā)展為牙髓病以及根尖周疾病。目前對(duì)于牙髓和根尖周疾病主要的治療方法是根管治療。雖然根管充填材料具有良好的生物相容性，但是依然無法替代有正常功能的牙髓組織，無法對(duì)牙齒起到滋養(yǎng)、修復(fù)等作用[1]。失去牙髓的牙齒更容易發(fā)生再感染和牙齒劈裂，從而進(jìn)一步造成牙齒缺失[2]，因此，需要有新的治療手段避免牙齒的喪失。隨著組織工程技術(shù)的廣泛應(yīng)用，牙髓再生成為新的治療手段，它能夠替代損傷的牙髓組織行使功能[3]。

1種子細(xì)胞

干細(xì)胞是一類具有自我復(fù)制和多向分化潛能的細(xì)胞，它在不同環(huán)境的作用種子細(xì)胞、理想的支架材料以及相應(yīng)的生長(zhǎng)因子是牙髓組織工程現(xiàn)代理念中的三大關(guān)鍵要素[4]，本文就上述關(guān)鍵因素進(jìn)行介紹。牙髓干細(xì)胞(Dental pulp stem cells,DPSCs)是一種存在于牙髓組織中的成體干細(xì)胞，由Gronthos 首次提出，主要是從牙髓細(xì)胞中分離得到的間充質(zhì)干細(xì)胞[1]。Gronthos 利用酶消化法，從健康的人第三磨牙牙髓中分離得到牙髓干細(xì)胞[5]，它的免疫表型與間充質(zhì)干細(xì)胞相似。牙髓干細(xì)胞的形態(tài)類似人骨髓成纖維細(xì)胞，大多數(shù)細(xì)胞呈長(zhǎng)梭形，體積較小[6]。而乳牙牙髓干細(xì)胞是分離培養(yǎng)自脫落乳牙的干細(xì)胞[7]，其形態(tài)呈多形性，大部分呈梭形，體積較小，輪廓清楚[8]，由此可見成人牙髓干細(xì)胞與乳牙牙髓干細(xì)胞形態(tài)有很多相似之處。

牙髓干細(xì)胞具有多種生物學(xué)特性。Couble 等將從健康人牙髓中分離提取的牙髓細(xì)胞中加入磷酸甘油進(jìn)行誘導(dǎo)分化后形成復(fù)合體，這些細(xì)胞還能夠分泌富含Ⅰ型膠原的基質(zhì)并礦化[9]，這些都能證實(shí)了牙髓干細(xì)胞具有成牙本質(zhì)分化能力。有文章指出牙髓干細(xì)胞的表面標(biāo)記物與間充質(zhì)干細(xì)胞相似，包括Stro-1、CD29、CD44、CD73、CD90、CD105、CD146和CD166等的表達(dá)都與間充質(zhì)干細(xì)胞相似[10]。另外它作為干細(xì)胞同樣具有多向分化潛能，在培養(yǎng)過程中添加一定的誘導(dǎo)劑后，具有向成骨、神經(jīng)、肌肉、脂肪等細(xì)胞分化的能力。同時(shí)，體外培養(yǎng)的牙髓干細(xì)胞比骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞具有更高的克隆形成能力，它的增殖速度是骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的30～50倍[11]。這些都充分說明了牙髓干細(xì)胞作為組織工程種子細(xì)胞具有很多優(yōu)越性，因此它在牙髓組織工程再生中具有良好的應(yīng)用前景。乳牙牙髓干細(xì)胞作為干細(xì)胞也同樣具有成骨、神經(jīng)、肌肉、脂肪等細(xì)胞分化的能力[12]。研究還證實(shí)乳牙牙髓干細(xì)胞在陽(yáng)性表達(dá)和多向分化性方面與牙髓干細(xì)胞相似，如成骨性和成脂性[13]。另外有文章指出流式細(xì)胞儀檢測(cè)顯示乳牙牙髓干細(xì)胞CD29、CD73和CD146呈陽(yáng)性表達(dá)[14]。這在很大程度上說明了牙髓干細(xì)胞和乳牙牙髓干細(xì)胞具有很多相同的生物學(xué)特性，它們均能作為種子細(xì)胞用于牙髓組織工程再生。但從組織來源上看，與成人牙髓干細(xì)胞相比，脫落乳牙來源容易而且無創(chuàng)傷，且組織來源更加年輕，細(xì)胞活性更加良好。因此它更加適合作為組織工程牙髓再生的種子細(xì)胞。

牙髓干細(xì)胞和乳牙牙髓干細(xì)胞的分離方法比較簡(jiǎn)單，目前通常應(yīng)用組織塊法和酶消化法獲得牙髓干細(xì)胞和脫落乳牙干細(xì)胞。采用免疫磁珠分選系統(tǒng)分離得到干細(xì)胞，具體原理是通過應(yīng)用包被抗小鼠IgM MicroBeads的免疫磁珠，將牙髓干細(xì)胞的磁性標(biāo)記分選柱移出磁場(chǎng)后，洗脫滯留柱內(nèi)的細(xì)胞，從而獲得牙髓干細(xì)胞[15]。由于乳牙牙髓干細(xì)胞與成人牙髓干細(xì)胞具有很多相似的生物學(xué)特性因此可以采用相同的方法得到脫落乳牙的牙髓干細(xì)胞。另外也可以應(yīng)用流式細(xì)胞儀進(jìn)行干細(xì)胞的分選，但相較于免疫磁珠分選系統(tǒng)，流式細(xì)胞儀分選得到的干細(xì)胞量相對(duì)較少。

2生長(zhǎng)因子

信號(hào)因子的主要作用是誘導(dǎo)干細(xì)胞分化，目前促干細(xì)胞生長(zhǎng)的信號(hào)因子主要是骨形態(tài)發(fā)生蛋白(Bone morphogenetic proteins,BMP)、轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子(Transforming growth factor,TGF-β)、堿性成纖維生長(zhǎng)因子(basic fibroblast growth factor,b-FGF)以及白細(xì)胞介素等。作為干細(xì)胞中的一種牙髓干細(xì)胞同樣也受到信號(hào)因子的影響。有學(xué)者向牙髓干細(xì)胞中轉(zhuǎn)入BMP-7基因，并在無礦化誘導(dǎo)的情況下進(jìn)行細(xì)胞培養(yǎng)，結(jié)果證明加入人類BMP-7基因的牙髓干細(xì)胞有向成牙本質(zhì)細(xì)胞分化的能力和較強(qiáng)的硬組織形成能力[16]。另外也有文章指出基因重組人粒細(xì)胞-巨噬細(xì)胞集落刺激因子G-CSF能夠促進(jìn)牙髓干細(xì)胞進(jìn)行牙髓重建[17]。b-FGF是成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子家族中的一員,在體外能刺激細(xì)胞增殖、遷移，且對(duì)細(xì)胞有絲分裂和增殖具有較強(qiáng)促進(jìn)作用，同時(shí)也能夠參與調(diào)控組織血管化、組織損傷修復(fù)等。有研究報(bào)道顯示b-FGF可以明顯促進(jìn)牙髓干細(xì)胞的體外擴(kuò)增速率、克隆形成能力及細(xì)胞遷移能力[16]，充分說明了在牙髓干細(xì)胞增殖和分化的過程中BMP和b-FGF都起到了非常重要的作用。另外巨噬細(xì)胞集落刺激因子G-CSF也對(duì)牙髓干細(xì)胞增殖具有促進(jìn)作用，在進(jìn)行牙髓干細(xì)胞培養(yǎng)和牙髓組織工程再生的過程中可以適當(dāng)添加相應(yīng)的生長(zhǎng)因子，促進(jìn)細(xì)胞生長(zhǎng)和組織再生。另外還有一些其他的細(xì)胞因子對(duì)牙髓干細(xì)胞增殖有影響，如早期炎癥相關(guān)細(xì)胞因子：腫瘤壞死因子-α(Tumor necrosisfactor-α，TNF-α)、白細(xì)胞介素(IL-1β、IL-6、IL-10)等都對(duì)牙髓干細(xì)胞的增殖分化有一定的影響。有學(xué)者從炎癥牙髓中檢測(cè)出TNF-α高表達(dá)，證實(shí)其直接參與并加重牙髓炎的進(jìn)展。也有研究發(fā)現(xiàn)TNF-α可以促進(jìn)牙髓干細(xì)胞向成牙細(xì)胞分化[16]。目前關(guān)于牙髓干細(xì)胞生物學(xué)性能影響因素的研究很多，有很多生長(zhǎng)因子都參與到牙髓干細(xì)胞的增殖和分化的過程中，這需要進(jìn)一步的研究探討尋找更適合DPSCs生長(zhǎng)的環(huán)境。

3支架材料

作為組織工程牙髓的三大關(guān)鍵要素之一，支架材料在牙髓再生中也發(fā)揮著非常重要的作用。隨著口腔組織工程再生的逐漸發(fā)展，應(yīng)用于口腔組織的工程材料也隨之發(fā)展。作為支架材料需要具有以下基本特點(diǎn)：無毒性，任何組織工程材料應(yīng)用的最終目的都是植入人體，因此不能有毒性；有良好的生物相容性，不能引起周圍組織發(fā)生嚴(yán)重的炎性反應(yīng)而影響細(xì)胞增殖；可降解性，植入機(jī)體內(nèi)的支架材料應(yīng)能被周圍組織吸收而其降解率宜與再生組織的形成速率保持一致；有合適的孔隙率，以利于細(xì)胞生長(zhǎng)并傳遞營(yíng)養(yǎng)和代謝產(chǎn)物等[18]?？傊M織工程支架材料都必須符合人體的生長(zhǎng)環(huán)境，以便其在功能上能夠代替正常的人體組織。

目前應(yīng)用于牙髓組織工程的材料包括聚乳酸、聚羥基乙酸和二者共聚物、藻酸鹽、膠原、羥基磷灰石、磷酸三鈣、自組裝多肽等。國(guó)內(nèi)有學(xué)者將殼聚糖與磷酸三鈣組合成一種新的三維多孔結(jié)構(gòu)復(fù)合材料, 使其具有良好的機(jī)械強(qiáng)度及韌性,且磷酸三鈣降解產(chǎn)物呈堿性能夠中和殼聚糖所產(chǎn)生的酸性物質(zhì),因此能夠減輕炎癥反應(yīng)[19]。李景輝等將牙髓細(xì)胞與明膠材料復(fù)合培養(yǎng)并植入裸鼠體內(nèi)4周后，有骨組織形成[20]。另外，血小板自身含有生長(zhǎng)因子，目前富血小板血漿(Platelet-rich plasma，PRP)已經(jīng)是非常重要的組織工程材料。PRP臨床上廣泛用于促進(jìn)骨組織再生、創(chuàng)傷修復(fù)、牙周組織再生以及牙種植體骨愈合等多個(gè)領(lǐng)域[21]。隨著對(duì)PRP研究的不斷深入，它的應(yīng)用也越來越廣泛，國(guó)內(nèi)有學(xué)者將小型豬的牙髓細(xì)胞與提取的不同濃度的PRP進(jìn)行復(fù)合培養(yǎng)，結(jié)果顯示10% PRP凝膠具有良好的可塑性以及富含生長(zhǎng)因子的特性[22]。劉中寧等將PRP和第4代DPSCs復(fù)合激活后，植入雌性裸鼠背部皮下， 4周、8周后觀察到裸鼠皮下有白色生成物，單獨(dú)植入DPCs或PRP組未見生成物[23]。由此可見PRP作為牙髓組織工程的材料具有良好的應(yīng)用前景，PRP不僅對(duì)牙髓細(xì)胞的增殖有促進(jìn)作用，而且來源容易，可以應(yīng)用患者本人外周血進(jìn)行分離提取，從而降低了植入后的不良反應(yīng)和組織排異。文軍等將改良的PRP按照不同濃度加入到培養(yǎng)的牙髓細(xì)胞中，2%改良富血小板血漿可以促進(jìn)乳牙牙髓干細(xì)胞的增殖[24]，這在PRP濃度選擇上給了我們一些啟示?？傊鲜鱿嚓P(guān)研究都為PRP作為牙髓組織工程材料的研究奠定了工作基礎(chǔ)，且由于PRP其自身的特點(diǎn)其進(jìn)一步應(yīng)用于臨床也有很大的希望。

雖然，目前臨床治療牙體牙髓疾病的手段不斷更新，但仍然無法治療所有的疾病，有很多患者最終仍然喪失了牙齒。組織工程牙髓再生為解決這一難題提供了新的思路，但由于組織工程牙髓再生還處于發(fā)展階段，因此仍然有很多需要解決的問題，包括如何獲取穩(wěn)定可靠的種子細(xì)胞，如何選擇和研發(fā)適合組織工程牙髓的支架材料以及促進(jìn)細(xì)胞增殖的生長(zhǎng)因子的研究等。但隨著組織工程學(xué)科的逐步發(fā)展，上述問題都能夠得到解決，因此組織工程牙髓再生在治療牙體牙髓疾病的應(yīng)用中將會(huì)有良好的前景。

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收稿日期2015-05-20

中圖分類號(hào)：R783

文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A

文章編號(hào)：1001-7585(2015)20-2750-03