嗎啡預處理對H9c2心肌細胞缺氧／復氧時microRNA表達的影響

韓正怡，何淑芳，程 潔，許士進，楊 婉，張 野

（安徽醫(yī)科大學第二附屬醫(yī)院麻醉科，安徽合肥 230601）

嗎啡預處理對H9c2心肌細胞缺氧／復氧時microRNA表達的影響

韓正怡，何淑芳，程 潔，許士進，楊 婉，張 野

（安徽醫(yī)科大學第二附屬醫(yī)院麻醉科，安徽合肥 230601）

中國圖書分類號：R-332；R322．11；R329．25；R342.2；R542.2；R845.22；R971.2

摘要：目的 探討嗎啡預處理（morphine preconditioning，MPC）對H9c2心肌細胞缺氧／復氧（hypoxia reoxygenation，H／R）時microRNA（miRNA）表達的影響，為明確其機制提供參考。方法 培養(yǎng)H9c2心肌細胞，隨機分為3組（n＝4）：①正常對照組（CON）：H9c2心肌細胞置于DMEM／F12細胞培養(yǎng)液常規(guī)培養(yǎng)；②缺氧／復氧組（H／R）：對心肌細胞行缺氧5 h／復氧1 h處理；③嗎啡預處理組（MPC＋H／R）：在H／R前，應用1 μmol·L－1嗎啡預處理10 min。處理結(jié)束后，采用CCK-8法檢測細胞增殖、化學比色法檢測細胞培養(yǎng)液中乳酸脫氫酶（LDH）活性、Annexin-V-FITC／PI雙染法檢測細胞凋亡、Western blot法檢測細胞內(nèi)Fas蛋白表達、熒光定量RT-PCR法檢測細胞miRNA表達水平。結(jié)果 與CON組比，H／R組細胞活力降低，LDH活性升高，細胞凋亡率增加，F(xiàn)as蛋白水平升高（P＜0.01）；MPC可明顯提高細胞活力，降低LDH活性，抑制細胞凋亡，降低Fas蛋白水平（P＜0.01）。qRT-PCR結(jié)果顯示，與CON組相比，H／R組miR-133a-5p、miR-133b-5p、miR-664-1-5p、miR-6216和let-7e-5p表達明顯下調(diào)，而MPC能明顯地抑制H／R對這些miRNA表達的下調(diào)作用（P＜0.01）。結(jié)論 嗎啡預處理減輕H9c2心肌細胞缺氧／復氧損傷可能與調(diào)控miR-133a-5p、miR-133b-5p、miR-664-1-5p、miR-6216和let7e-5p等miRNA表達有關(guān)。

關(guān)鍵詞：嗎啡預處理；H9c2心肌細胞；缺氧／復氧；凋亡；Fas；微小RNA

網(wǎng)絡出版時間：2015－10－16 9：52 網(wǎng)絡出版地址：http：／／www．cnki．net／kcms／detail／34．1086．R．20151016．0952．030．html

心肌缺血／再灌注損傷（ischemia reperfusion in-jury，IRI）常發(fā)生于急性心肌梗死溶栓治療后、冠狀動脈成形或搭橋術(shù)后，以及體外循環(huán)手術(shù)過程中等，嚴重影響缺血后心臟功能的恢復，威脅患者的生命安全。缺血預處理（ischemic preconditioning，IPC）是迄今為止最有效的內(nèi)源性心肌保護方法［1］。本課題組前期研究表明，阿片類藥物如嗎啡、瑞芬太尼預處理可模擬IPC發(fā)揮心肌保護效應［2－4］。然而，阿片預處理（opioid preconditioning，OPC）的心肌保護機制可能涉及多種信號通路和分子，其確切分子機制尚不明確。

microRNA（miRNA）是近年來新發(fā)現(xiàn)的內(nèi)源性、單鏈、非編碼小RNA。已知miRNA參與調(diào)控心肌細胞凋亡，在心肌缺血、再灌注以及預處理過程中均發(fā)揮重要作用［5］。最近研究表明，miRNA還參與阿片相關(guān)的多種生物學過程，如藥物成癮與耐受、鎮(zhèn)痛、免疫調(diào)節(jié)、病毒感染以及阿片受體調(diào)節(jié)等［6］。但OPC是否通過miRNA來調(diào)控相應的靶基因和信號通路發(fā)揮心肌保護作用，目前尚未見報道。本課題組前期利用miRNA芯片技術(shù)研究發(fā)現(xiàn)，嗎啡預處理（morphine preconditioning，MPC）可誘導大鼠心肌細胞miRNA表達譜發(fā)生明顯改變。在此基礎上，本研究擬進一步探討MPC對H9c2心肌細胞缺氧／復氧（hypoxia reoxygenation，H／R）時miR-133a-5p、miR-133b-5p、miR-664-1-5p、miR-6216和let-7e-5p表達的影響，為OPC的心肌保護作用機制研究提供新的理論依據(jù)。

1　材料與方法

1．1材料

1．1．1細胞株 大鼠H9c2（2-1）胚胎心肌細胞株

（中科院上海細胞庫）。

1．1．2藥物與試劑 鹽酸嗎啡注射液1 mL：10 mg（東北制藥集團沈陽第一制藥有限公司，批號：121206-2）。DMEM／F12細胞培養(yǎng)液購自美國Hy-clone公司；胎牛血清、0.25%胰酶消化液購自加拿大Wisent公司；TRIzol購自美國Invitrogen公司；細胞增殖檢驗試劑盒（cell counting kit-8，CCK-8）購自日本同仁化學研究所；乳酸脫氫酶（lactic acid dehy-drogenase，LDH）試劑盒購自南京建成生物工程研究所；Annexin-V-FITC／PI雙染凋亡試劑盒購自美國鉑優(yōu)公司；PVDF膜購自美國Bio-Rad公司；鼠抗β-actin單克隆抗體、兔抗Fas多克隆抗體購自美國Santa Cruz生物技術(shù)公司；HRP標記羊抗兔、羊抗鼠抗體購自北京中杉生物技術(shù)公司；ECL發(fā)光試劑盒購自美國Pierce公司；All-in-OneTMmiRNA qRT-PCR Detection Kit及miRNA引物均購自廣州復能基因有限公司。

1．1．3儀器 細胞培養(yǎng)箱（美國Thermo公司）；缺氧小室（加拿大Stem Cell公司）；KHB ST-360酶標儀（中國上?？迫A實驗系統(tǒng)有限公司）；Cytomics FC 500流式細胞儀（美國Beckman公司）；CXY-6C型電泳儀（北京六一儀器廠）；Tanon Fine Do X6全自動化學發(fā)光圖像分析系統(tǒng)（上海天能科技有公司）；熒光定量PCR儀（美國ABI公司）。

1．2方法

1．2．1細胞培養(yǎng) 大鼠H9c2（2-1）胚胎心肌細胞株置于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱（95%空氣）中，含10%胎牛血清的DMEM／F12完全培養(yǎng)液培養(yǎng)。細胞貼壁80%～90%時，用0.25%胰酶0.02%EDTA消化，計數(shù)，以1∶3的比例傳代，每2～3天傳代1次。取對數(shù)生長期的細胞用于后續(xù)實驗。

1．2．2心肌缺氧／復氧損傷模型的建立 參照文獻［7］并加以改良進行。心肌細胞生長達90%后，棄去含10%胎牛血清的DMEM／F12培養(yǎng)液，加入無血清無糖的缺氧液，并將細胞置于缺氧小室，通入95%N2＋5%CO2的混合氣飽和5 min，驅(qū)除氧氣。置于37℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)5 h實施缺氧，用含10%胎牛血清的DMEM／F12正常培養(yǎng)1 h模擬復氧。

1．2．3實驗分組及處理 依據(jù)不同的實驗要求，對細胞進行如下分組處理：對照組（CON）細胞正常培養(yǎng)；缺氧／復氧組（H／R）細胞行缺氧5 h／復氧1 h處理；嗎啡預處理組（MPC＋H／R）細胞參照前期及預實驗結(jié)果，以含嗎啡（終濃度為1 μmol·L－1）的無血清DMEM／F12孵育細胞10 min，再進行H／R處理。每組4個復孔（n＝4）。

1．2．4CCK-8法檢測細胞增殖 取對數(shù)生長期心肌細胞，接種于96孔培養(yǎng)板內(nèi)，每孔4×103個細胞，置于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)。按上述方法進行分組及處理，結(jié)束后每孔加入10 μL CCK-8溶液（加入的體積為原來培養(yǎng)體積的10%），細胞培養(yǎng)箱內(nèi)繼續(xù)孵育4 h，置于酶標儀上450 nm測定各組吸光度。在不含細胞的培養(yǎng)液中加入等量CCK-8溶液，按相同方法測定吸光度作為空白對照孔。細胞增殖活力＝測定的吸光度－空白對照孔吸光度，并計算平均值。實驗獨立重復4次。

1．2．5乳酸脫氫酶（LDH）活性的測定 接種于96孔培養(yǎng)板的心肌細胞，于H／R結(jié)束后，每組各取40 μL培養(yǎng)液，嚴格按照LDH試劑盒說明書操作，利用化學比色法檢測LDH活性。實驗獨立重復4次。

1．2．6Annexin-V-FITC／PI雙染法檢測細胞凋亡取對數(shù)生長期的H9c2心肌細胞，調(diào)整細胞濃度為每孔2×106個細胞，接種到6孔板中，置于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)。按上述方法進行分組及處理，H／R結(jié)束后，用不含EDTA的胰酶消化并收集細胞，1 500 r·min－1離心（離心半徑16 cm）5 min，PBS漂洗2次，收集細胞。用500 μL的Annex-in-V Binding Buffer重懸細胞，每組加入5 μL的An-nexin-V-FITC混勻，再加入5 μL的PI混勻。室溫下避光孵育10 min，轉(zhuǎn)移入流式管中，采用流式細胞儀測定細胞凋亡率。以未染色細胞調(diào)零，以Annex-in-V-FITC單染管和PI單染管作為基準參照，測定每個上樣管數(shù)據(jù)，每個樣本均獲取10 000個細胞，用FCS Express V 3．0軟件進行分析。實驗獨立重復4次。

1．2．7Western blot法檢測Fas蛋白水平 接種于6孔培養(yǎng)板的心肌細胞，H／R結(jié)束后，棄培養(yǎng)液。4℃預冷PBS清洗細胞，培養(yǎng)板中加入蛋白裂解液充分裂解細胞，15 000 r·min－14℃離心10 min，吸取上清，BCA法測定樣品蛋白含量后分裝保存。每組取10 μg蛋白行聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS-PAGE），電泳后將蛋白轉(zhuǎn)移至PVDF膜。將PVDF膜在封閉液（含5%脫脂牛奶的TBST溶液）中室溫孵育1 h，隨后置于兔抗Fas多克隆抗體或鼠抗β-actin單克隆抗體中，4℃搖床孵育過夜，TBST洗膜3次；再將膜置入辣根過氧化物酶（HRP）標記二抗中室溫孵育1 h，TBST洗膜3次；采用ECL發(fā)光試劑盒，在Tanon全自動凝膠成像系統(tǒng)中自動曝光采集圖像，并進行條帶光密度分析。

1．2．8熒光定量RT-PCR檢測心肌細胞miRNAs表達水平 接種于6孔培養(yǎng)板的心肌細胞，H／R結(jié)

束后，棄培養(yǎng)液收集細胞。按照RNA提取試劑TR-Izol的說明書進行操作，每孔加1 mL TRIzol置于冰上裂解15 min，提取細胞總RNA。經(jīng)氯仿萃取，異丙醇法沉淀，75%無水乙醇洗滌法濃縮，DEPC水溶解后，用紫外分光光度計檢測總RNA的濃度和純度，制成RNA樣品。按照All-in-OneTMmiRNA qRT-PCR Detection Kit試劑盒說明書，將RNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA后用于檢測miR-133a-5p、miR-133b-5p、miR-664-1-5p、miR-6216、let-7e-5p及內(nèi)參基因U6的表達量（引物序列保密）。逆轉(zhuǎn)錄反應條件為：37℃60 min，85℃5 min；PCR擴增條件為：95℃預變性10 min，95℃10 s，60℃30 s，重復45個循環(huán)進行擴增；反應結(jié)束后建立溶解曲線。同時設去離子水陰性對照，采用U6 RNA作為各組內(nèi)標，進行歸一化。采用StepOne Software v 2．3軟件進行數(shù)據(jù)分析。同一實驗重復4次，實驗數(shù)據(jù)分析采用2－△△CT法計算［8］。

1．2．9統(tǒng)計學分析 采用SPSS 10．0統(tǒng)計軟件進行分析，計量資料±s表示，多組間數(shù)據(jù)比較采用單因素方差分析（ANOVA），組間兩兩比較采用SNK檢驗。

2　結(jié)果

2．1MPC增加H9c2心肌細胞活力 各組經(jīng)過處理后，心肌細胞活力分別為：CON組（1.43±0.08）、H／R組（0.69±0.10）、MPC＋H／R組（1.11± 0.12）。與CON組相比，H／R可明顯降低心肌細胞活力（P＜0.01），而MPC則明顯增加心肌細胞活力（P＜0.01），見Fig 1。

Fig 1 Morphine preconditioning increased cell viability in H9c2 myocardial cells（±s，n＝4）

2．2MPC降低H9c2心肌細胞LDH活性 心肌細胞培養(yǎng)液中的LDH水平可反映細胞損傷程度。與CON組（120±10）相比，H／R組LDH活性明顯升高（281±10，P＜0.01）；而MPC則可以明顯減輕H／R損傷，培養(yǎng)液中LDH活性明顯降低（151±10，P＜0.01）（單位：IU·L－1），見Fig 2。

Fig 2 Morphine preconditioning reduced LDH activity in H9c2 myocardial cells（±s，n＝4）

2．3MPC抑制H9c2心肌細胞凋亡 在流式細胞散點分析圖上劃十字門，如Fig 3A所示，正常細胞顯示為圖中左下區(qū)細胞簇（FITC－PI－），早期凋亡細胞顯示為圖中右下區(qū)細胞簇（FITC＋PI－），晚期凋亡及死亡細胞顯示為圖中右上區(qū)細胞簇（FITC＋PI＋）。從Annexin-V-FITC／PI熒光雙參數(shù)點圖觀察到，CON組細胞主要分布在左下象限，細胞狀態(tài)良好，右下象限為少量凋亡細胞（FITC＋PI－：3.2%± 1.2%）；H／R組右下象限出現(xiàn)大量凋亡細胞（FITC＋PI－：25.4%±2.4%，P＜0.01）；而MPC＋H／R組凋亡細胞明顯減少（FITC＋PI－：9.3%±1.6%，P ＜0.01）（Fig 3B），說明MPC可抑制H／R損傷誘導的心肌細胞凋亡。

2．4MPC降低H9c2心肌細胞Fas蛋白表達 Fas蛋白是細胞內(nèi)重要的凋亡調(diào)控蛋白。Western blot結(jié)果顯示，H／R損傷組細胞內(nèi)Fas蛋白表達水平明顯升高，是CON組的（1.7±0.2）倍（P＜0.01）；而MPC則下調(diào)細胞內(nèi)Fas蛋白表達，與H／R組相比，差異具有統(tǒng)計學意義（1.2±0.4，P＜0.01），見Fig 4。說明MPC可抑制凋亡蛋白Fas表達，減輕H／R損傷。

2．5MPC對H9c2心肌細胞miRNA表達水平的

影響 熒光定量RT-PCR結(jié)果顯示，與CON組相比，H／R損傷組miR-133a-5p、miR-133b-5p、miR-664-1-5p、miR-6216、let-7e-5p的表達水平均明顯下調(diào)，分別降低至（0.34±0.06）、（0.18±0.06）、（0.28±0.02）、（0.29±0.02）、（0.29±0.03）（P＜0.05），而MPC減輕心肌細胞損傷的同時，也可明顯上調(diào)上述miRNA在心肌細胞的表達水平，分別升高至（4.29±0.42）、（5.72±0.63）、（7.37±0.51）、（7.71±0.29）、（9.39±0.48）（P＜0.01），見Fig 5。

Fig 3 Morphine preconditioning inhibited apoptosis in H9c2 myocardial cells（±s，n＝4）

Fig 4 Morphine preconditioning decreased Fas protein expression in H9c2 myocardial cells（±s，n＝4）

Fig 5 Expression of miRNAs in each group（±s，n＝4）

3　討論

嗎啡是臨床麻醉中常用的一種非選擇性的阿片類鎮(zhèn)痛藥，常用于心血管手術(shù)麻醉和術(shù)后鎮(zhèn)痛，以激動μ受體為主，同時也激動δ和κ阿片受體［9］。本實驗根據(jù)參考文獻［7］并加以改良，建立H9c2心肌細胞缺氧／復氧損傷模型，并參照前期及預實驗結(jié)果，選擇濃度為1 μmol·L－1的嗎啡進行預處理。結(jié)果顯示，MPC明顯增強心肌細胞活力，降低H／R損傷導致的LDH活性升高，并抑制心肌細胞凋亡，說明MPC可以減輕心肌細胞H／R損傷，發(fā)揮心肌保護作用。Fas是一種分子質(zhì)量為48 ku的跨膜糖

蛋白，它與FasL結(jié)合后介導的凋亡通路是經(jīng)典的凋亡途徑之一。Fas受體活化后可激活下游的caspase凋亡級聯(lián)信號，導致心肌細胞凋亡，在心肌缺血／再灌注損傷中發(fā)揮關(guān)鍵作用［10］。本研究發(fā)現(xiàn)，MPC可降低H／R誘導的心肌細胞內(nèi)Fas蛋白表達，提示了MPC可能通過抑制Fas介導的凋亡信號發(fā)揮心肌保護作用。

miRNA是生物體內(nèi)長度約22個核苷酸的非編碼小RNA，廣泛表達于各個組織和器官。它們以不完全互補的方式與成熟mRNA結(jié)合，抑制mRNA的翻譯或使mRNA降解，在轉(zhuǎn)錄后水平調(diào)節(jié)蛋白質(zhì)的表達，參與調(diào)控細胞多個生物學過程。在miRNA與心肌損傷、凋亡的研究中，Yin等［11］發(fā)現(xiàn)，心肌缺血預處理時miR-21、miR-221、miR-224表達上調(diào)，于動物的心肌缺血區(qū)注射這些miRNA能減少心肌缺血／再灌注損傷。表明miRNA在心肌損傷、心肌細胞凋亡過程中起到了重要的調(diào)控作用，可能成為抗心肌缺血／再灌注損傷治療的重要靶點。已有研究報道，嗎啡可下調(diào)腦組織miR-133b表達，調(diào)節(jié)多巴胺神經(jīng)元的功能［12］；此外，let-7家族可與μ受體結(jié)合，轉(zhuǎn)錄后抑制阿片受體活性［13］。說明阿片類發(fā)揮生物學作用可能通過調(diào)控miRNA表達來實現(xiàn)。然而，阿片預處理發(fā)揮心肌保護作用是否涉及miRNA調(diào)控機制，目前尚未見報道。本實驗通過熒光定量RT-PCR，檢測各組miRNA表達水平的變化，結(jié)果顯示，在H／R損傷組中明顯下調(diào)的miR-133a-5p、miR-133b-5p、miR-664-1-5p、miR-6216、let-7e-5p均被MPC明顯上調(diào)，提示MPC可能通過調(diào)控這些miR-NA表達，減輕H9c2心肌細胞H／R損傷，發(fā)揮心肌細胞保護作用。

這些受MPC調(diào)控的miRNA中，miR-133a與miR-133b同屬miR-133家族。研究表明，在心肌梗死或心臟缺血／再灌注過程中，miR-133a、miR-133b表達均明顯下降［14－15］。miR-133a已被證明具有抗心肌細胞凋亡作用，上調(diào)心肌內(nèi)miR-133a表達可明顯減輕缺血／再灌注損傷，改善心臟功能［16］，可能與其負性調(diào)控促凋亡基因caspase-9有關(guān)［17］。miR-133b參與調(diào)控心肌細胞凋亡，但其具體作用機制尚不明確。我們通過靶基因預測軟件對miR-133b-5p的靶基因進行分析，發(fā)現(xiàn)Fas基因的3’-UTR端與miR-133b-5p的種子序列匹配，可能是其關(guān)鍵靶基因之一。因此，我們推測MPC上調(diào)心肌細胞miR-133a和miR-133b的表達，可能與抑制凋亡信號通路Fas、caspase-9相關(guān)，進而抑制心肌細胞凋亡，減輕H／R損傷。其他miRNA如miR-664-1-5p、miR- 6216、let-7e-5p在心肌缺血／再灌注損傷或心肌細胞凋亡中的作用尚不清楚，在MPC介導的心肌保護效應中作用機制也有待進一步探討。

綜上所述，本研究證明嗎啡預處理可明顯減輕H9c2心肌細胞缺氧／復氧損傷，其機制可能與影響miR-133a-5p、miR-133b-5p、miR-664-1-5p、miR-6216 和let-7e-5p等miRNA表達有關(guān)，為進一步研究嗎啡預處理的miRNA調(diào)控機制提供了基礎。

（致謝：感謝安徽醫(yī)科大學第二附屬醫(yī)院中心實驗室為本課題研究提供儀器設備和技術(shù)支持。）

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Effects of morphine preconditioning on expression of microRNAs during hypoxia-reoxygenation in H9c2 myocardial cells

HAN Zheng-yi，HE Shu-fang，CHENG Jie，XU Shi-jin，YANG Wan，ZHAGN Ye
（Dept of Anesthesiology，the Second Affiliated Hospital of Anhui Medical University，Hefei 230601，China）

Abstract：Aim To evaluate the effects of morphine preconditioning（MPC）on the expression of microR-NAs（miRNAs）induced by hypoxia-reoxygenation （H／R）in H9c2 myocardial cells．Methods H9c2 cells were randomly divided into 3 groups（n＝4 each）as follows：control group（CON），hypoxia／reoxygen-ation group（H／R）and morphine preconditioning group（MPC＋H／R）．The cells were cultured in nor-mal condition in CON group．The cells were subjected to 5 h hypoxia followed by 1 h reoxygenation in H／R group and MPC＋H／R group．Specifically，the cells in MPC＋H／R group were preconditioned with morphine with the final concentration of 1 μmol·L－1for 10 min before H／R．After the treatment，CCK-8 was used to detect cell viability and chemical colorimetry was used to detect lactate dehydrogenase（LDH）activity in the culture medium．Cell apoptosis was assessed by An-nexin-V-FITC／PI flow cytometry．Relative expression of Fas protein was detected by Western blot．The ex-pression of miRNA in myocardial cells was analyzed by quantitative reverse transcription polymerase chain re- action（qRT-PCR）．Results Compared with CON group，the cell viability was significantly decreased，while the LDH activity，apoptotic rate and Fas protein expression were dramatically increased in group H／R （P＜0.01）．However，MPC significantly increased the cell viability，whereas it decreased the LDH activity，apoptotic rate and Fas protein expression induced by H／R injury（P＜0.01）．The expressions of miR-133a-5p，miR-133b-5p，miR-664-1-5p，miR-6216 and let-7e-5p were markedly down-regulated by H／R as compared to CON group（P＜0.05），while MPC inhibited these miRNAs which were significantly down-regulated by H／R group（P＜0.01）．Conclusion Morphine preconditioning might protect H9c2 myocar-dial cells against H／R injury by regulating the expres-sion of miRNAs such as miR-133a-5p，miR-133b-5p，miR-664-1-5p，miR-6216 and let-7e-5p．

Key words：morphine preconditioning；H9c2 myocar-dial cells；hypoxia-reoxygenation；apoptosis；Fas；mi-croRNAs

作者簡介：韓正怡（1991－），女，碩士，研究方向：麻醉藥理學，E-mail：15155971268＠163．com；張 野（1968－），男，博士，教授，主任醫(yī)師，博士生導師，研究方向：麻醉藥理學，通訊作者，Tel：0551-63869480，E-mail：zhangye＿hassan＠sina．com

基金項目：國家自然科學基金資助項目（No 81200171）；安徽省科技廳年度重點項目（No 1301043030）；安徽省高校省級自然科學研究重大項目（No KJ2014ZD16）

收稿日期：2015－06－13，修回日期：2015－07－18

文獻標志碼：A

文章編號：1001－1978（2015）11－1552－06

doi：10．3969／j．issn．1001－1978．2015．11．015