下調(diào)組蛋白賴氨酸特異性脫甲基酶1的表達引起人白血病Molt-4細胞的凋亡

許可珍，黃軼群，黃秀旺，馬旭東

（福建醫(yī)科大學附屬漳州市醫(yī)院1．藥學部、2．血液內(nèi)科，福建漳州 363000；3．福建醫(yī)科大學藥學院，福建福州 350004）

下調(diào)組蛋白賴氨酸特異性脫甲基酶1的表達引起人白血病Molt-4細胞的凋亡

許可珍1，黃軼群2，黃秀旺3，馬旭東2

（福建醫(yī)科大學附屬漳州市醫(yī)院1．藥學部、2．血液內(nèi)科，福建漳州 363000；3．福建醫(yī)科大學藥學院，福建福州 350004）

中國圖書分類號：R341．27；R341．7；R329．25；R733．7；R977．4；R977．6

摘要：目的 觀察LSD1基因?qū)θ祟惣毙訲淋巴母細胞性白血病Molt-4細胞增殖和凋亡的影響。方法 設計并篩選出針對LSD1基因的最佳siRNA片段，將其轉(zhuǎn)染入Molt-4細胞后，MTS法觀察LSD1 siRNA對Molt-4細胞增殖的影響；流式細胞術(shù)分析細胞凋亡；Western blot檢測LSD1 siRNA作用后組蛋白H3K4、H3K9甲基化及組蛋白H3乙酰化狀態(tài)，以及p15、DNA甲基化酶1（DNMT1）和凋亡相關蛋白Bcl-2、pro-caspase-3的表達變化。結(jié)果 沉默LSD1基因可抑制細胞增殖，LSD1 siRNA濃度為0、30、60、120 nmol·L－1作用48 h后，Molt-4細胞的增殖率分別為（99.65±1.21）%、（83.02± 1.69）%、（65.72±2.16）%、（41.15±2.23）%，差異具有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）；LSD1 siRNA以60 nmol·L－1的濃度轉(zhuǎn)染細胞0、24、48、72 h，增殖率分別為（99.86± 1.35）%、（65.72±2.16）%、（48.26±1.92）%、（37.86± 1.66）%，P＜0.05，提示LSD1 siRNA可以抑制Molt-4細胞的增殖。LSD1 siRNA 0、30、60、120 nmol·L－1作用48 h后，細胞凋亡率分別為（3.35±1.26）%、（12.16±1.74）%、（32.74±2.47）%、（54.64±2.58）%，P＜0.05，凋亡率隨著LSD1 siRNA濃度的增加逐漸上升；同時出現(xiàn)凋亡相關蛋白Bcl-2、procaspase-3的表達下降；LSD1 siRNA抑制LSD1蛋白及LSD1 mRNA，上調(diào)組蛋白H3K4一甲基化、二甲基化及組蛋白H3的乙?；?，H3K4三甲基化、H3K9甲基化水平無明顯變化；LSD1 siRNA下調(diào)DNA去甲基化酶DNMT1的表達，上調(diào)p15的表達。結(jié)論 LSD1 siRNA能抑制Molt-4細胞的增殖并誘導其凋亡，其機制可能與表觀遺傳學調(diào)控有關，有望成為白血病治療的一個新的靶點。

關鍵詞：急性白血??；LSD1；組蛋白；甲基化；乙?；?；表觀遺傳學

網(wǎng)絡出版時間：2015－10－16 9：52 網(wǎng)絡出版地址：http：／／www．cnki．net／kcms／detail／34．1086．R．20151016．0952．048．html

賴氨酸特異性組蛋白去甲基化酶1（lysine spe-cific demethylase 1，LSD1）是2004年被人們發(fā)現(xiàn)的第1個組蛋白賴氨酸去甲基化酶。LSD1定位于細胞核內(nèi)，調(diào)控著基因轉(zhuǎn)錄的激活和抑制，在腫瘤發(fā)生和胚胎發(fā)育過程中起著重要的作用。它是一個黃素腺嘌呤二核苷酸（flavin adenine dinulcleotide，F(xiàn)AD）依賴性胺氧化酶，能夠特異性地脫去組蛋白H3第4位賴氨酸（H3K4）和H3K9位點上的單甲基化和二甲基化甲基基團［1］。有研究發(fā)現(xiàn)，LSD1可通過多種途徑參與腫瘤的發(fā)生，例如LSD1可能廣

泛地調(diào)控基因表達并且參與前列腺癌的進展及惡化［2］，與乳腺癌、卵巢癌、肝癌的發(fā)展也密切相關［3－5］。

目前H3K4去基化酶LSD1的研究不多，特別是用對RNAi沉默技術(shù)研究LSD1后腫瘤細胞的增殖及凋亡以及對組蛋白調(diào)控及DNA甲基化影響的報告少見。本研究通過RNAi沉默LSD1基因，探討LSD1基因?qū)毙訲淋巴母細胞性白血病Molt-4細胞增殖、凋亡及組蛋白甲基化、乙?；癉NA甲基化的影響，探討LSD1基因在白血病靶向治療中的可能性。

1　材料與方法

1．1試劑 RPMI 1640培養(yǎng)基（美國Gibco公司），胎牛血清（杭州四季青生物制品公司），siRNA及PCR引物委托上海吉瑪制藥技術(shù)有限公司合成，Li-pofectamineTM2000轉(zhuǎn)染試劑、Opti-MEM RT-PCR試劑盒、DNA Marker試劑購自美國Invitrogen公司，細胞增殖檢測（MTS）試劑盒（Promega公司），Annex-in V-FITC／PI雙染試劑盒（BD公司），一抗：p15、Bcl-2、procaspase-3（美國Santa Cruz公司），Anti-ac-etyl-Histone H3、Anti-acetyl-Histone H4、Anti-trimeth-yl-Histone H3（Lys9）、Anti-acetyl-Histone H3 （Lys9）、Anti-acetyl-Histone H3（Lys14）、Anti-acetyl-Histone H3（Lys27）購自美國Upsate公司。羊抗兔、羊抗鼠二抗（Santa Cruz公司）。

1．2Molt-4細胞培養(yǎng) Molt-4細胞購自中國科學院上海細胞庫。Molt-4細胞培養(yǎng)條件：含10%胎牛血清的RPMI 1640細胞培養(yǎng)基（含青霉素105U· L－1＋鏈霉素100 mg·L－1）并在37℃、5%CO2飽和濕度的孵育箱中培養(yǎng)。將Molt-4細胞復蘇后，2～3 d規(guī)律傳代。轉(zhuǎn)染前選擇對數(shù)生長期細胞，離心收集并接種于6孔培養(yǎng)板中，細胞數(shù)為2×106個／孔。

1．3靶序列的選擇 siRNA的有關序列由上海吉瑪制藥技術(shù)有限公司設計及合成，為了避免只選擇一個序列可能出現(xiàn)無效或低效的情況，我們根據(jù)確定序列的原則選擇4條靶序列，并用RT-PCR法篩選最佳LSD1基因的siRNA片段為：上游5′-CCAC-GAGUCAAACCUUUAUTT-3′；下游5′-AUAAAGGU UUGACUCGUGGTT-3′。

1．4RT-PCR法觀察LSD1 siRNA對Molt-4細胞LSD1 mRNA表達的影響 設定陰性對照組、0、30、60、120 nmol·L－1LSD1 siRNA處理組。每孔總體積為2 mL。37℃、5%CO2飽和濕度下培養(yǎng)48 h后，根據(jù)TRIzol試劑盒說明書提取總RNA，紫外分光光度法鑒定、定量，A260／A280比值均為1.8～2.0，經(jīng)逆轉(zhuǎn)錄為cDNA。以反應所得cDNA進行PCR擴增。將β-actin（上游引物：5′-GAGACCTTCA AGAC-CCCAGCC-3′，下游引物：5′-TCGGGGCATCGGAAC-CGCTCA-3′）與LSD1引物按1∶2的比例混合。PCR反應條件：95℃5 min（預變性），95℃45 s（變性），61℃45 s（退火），72℃45 s（延伸），40個循環(huán)，最終延伸72℃10 min。將PCR產(chǎn)物與上樣緩沖液以5∶1混合后，16 g·L－1瓊脂糖凝膠電泳，于凝膠圖像分析儀上自動分析成像，觀察效果最佳LSD1 siRNA片段對Molt-4細胞LSD1 mRNA表達的影響。

1．5MTS法繪制細胞的生長曲線 取3個96孔板，每個96孔板中接種Molt-4細胞2×104個／孔，分別加入適量的LSD1 siRNA使終濃度分別為0、30、60、120 nmol·L－1，終體積為100 μL。每組設6個平行孔，轉(zhuǎn)染后置于5%CO2飽和濕度、37℃的孵箱中繼續(xù)培養(yǎng)。于24、48、72 h分別收獲一個板內(nèi)的4組細胞。將MTS和PMS按20∶1的體積比混合成混合液，每孔加20 μL的上述混合液，繼續(xù)培養(yǎng)4 h，震蕩10 min，充分溶解結(jié)晶物，在酶標儀上測吸光度即OD值（單波長492 nm），記錄試驗結(jié)果，并計算細胞增殖率。細胞增殖率／%＝（OD實驗－OD空白）／（OD對照－OD空白）×100%。以細胞增殖率為縱軸、時間為橫軸繪制細胞增殖曲線。實驗重復3次。

1．6流式細胞儀檢測細胞早期凋亡 LSD1 siRNA使終濃度分別為0、30、60、120 nmol·L－1，分別培養(yǎng)48 h后離心收集細胞，在流式細胞儀檢測細胞凋亡率，方法及步驟參照BD公司試劑盒說明書進行。實驗重復3次。

1．7Western blot檢測干擾后LSD1蛋白、凋亡相關蛋白、p15蛋白、組蛋白H3K4一、二甲基化、H3K9甲基化、H3乙?；癄顟B(tài)及DNA甲基化酶DNMT1的表達 用不同濃度的LSD1 siRNA處理Molt-4細胞48 h后，收集細胞，用PBS洗滌后，調(diào)整細胞數(shù)為1×106的濃度，加入裂解液與酶抑制劑（100∶1）100 μL充分裂解細胞；低溫（4℃）12 000 r ·min－1離心15 min，吸取中間清亮層，收集蛋白，BCA法進行蛋白定量，－20℃保存?zhèn)溆?。取備用蛋白，?2%SDS-PAGE電泳分離，電轉(zhuǎn)移法轉(zhuǎn)膜，室溫下?lián)u床封閉1 h；加入用TBS稀釋的一抗4℃過夜，TBS洗滌液洗膜后分別加入二抗，室溫下孵育1 h，TBS洗膜后加入化學發(fā)光工作液，在X射線膠片（KODAK）上曝光，以β-actin為內(nèi)參，用AlphaDigi-Doc圖像分析軟件進行分析比較。

1．8統(tǒng)計學分析 采用SPSS 13.5統(tǒng)計學軟件進

行結(jié)果處理，常規(guī)進行方差齊性檢驗、正態(tài)性檢驗。計量資料實驗數(shù)據(jù)采用±s表示，并進行單因素方差分析。

2　結(jié)果

2．1LSD1 siRNA下調(diào)LSD1 mRNA及其蛋白的表達 分別將濃度為0、30、60、120 nmol·L－1的LSD1-2045 RNAi片段轉(zhuǎn)染Molt-4細胞，48 h后提取細胞的mRNA進行RT-PCR試驗。如Fig 1A所示，LSD1 siRNA轉(zhuǎn)染后LSD1 mRNA受到抑制，且與濃度相關。各組LSD1 mRNA條帶灰度值與β-actin比值分別為：0.967±0.124、0.302±0.083、0.153± 0.082、0.091±0.024，各組與β-actin比值統(tǒng)計學處理，P＜0.05（Fig 1A）。與對照組相比，經(jīng)LSD1 RNA干擾后，LSD1蛋白的表達量隨著siRNA作用濃度的增加而逐漸減少，其中120 nmol·L－1組減少最明顯，下降了67.67%（Fig 1B）。

Fig 1 Transfection of LSD1 siRNA in Molt-4 cells

2．2LSD1 siRNA抑制Molt-4細胞增殖 經(jīng)終濃度分別為0、30、60、120 nmol·L－1的LSD1 siRNA作用24、48、72 h后，Molt-4細胞的增殖率變化見Fig 2，隨LSD1 siRNA濃度的增加和時間的延長，增殖率逐漸下降，呈現(xiàn)濃度和時間依賴性。

2．3LSD1 siRNA誘導Molt-4細胞凋亡 經(jīng)30、60、120 nmol·L－1的LSD1 siRNA處理48 h后，Molt-4細胞的凋亡率分別為（12.16±1.74）%、（32.74±2.47）%、（54.64±2.58）%，而對照組為（3.35±1.26）%，細胞的凋亡率隨著LSD1 siRNA濃度的增加逐漸上升（P＜0.05）。LSD1 siRNA濃度與凋亡率有明顯的量效關系（Fig 3）。

2．4LSD1 siRNA對Molt-4細胞的凋亡相關蛋白、DNMT1及p15的影響 經(jīng)終濃度分別為0、30、60、120 nmol·L－1的LSD1的siRNA轉(zhuǎn)染Molt-4細胞48 h后，抗凋亡蛋白Bcl-2的表達隨著LSD1 siRNA終濃度的增加而逐漸減少，分別比對照組減少33.70%、55.62%、79.78%；procaspase-3隨著siRNA處理濃度的增加表達量也逐漸下降，分別比對照組減少33.69%、54.35%、77.17%；同時，隨著siRNA處理濃度的增加，抑癌基因p15的表達量逐漸增加，分別比對照組增加1.21倍、2.71倍、4.58倍；而DNMT1蛋白的表達則逐漸減弱，分別比對照組減少22.47%、71.35%、88.76%（P＜0.05）（Fig 4）。

Fig 2 Deceased cell proliferation of Molt-4 cells after transfected with LSD1 siRNA in different concentrations and in different time

Fig 3 Induction of cells apoptosis after transfected with LSD1 siRNA Molt-4 cells for 48 hours

2．5LSD1 RNAi對Molt-4細胞組蛋白甲基化和乙?；挠绊?LSD1 siRNA終濃度為30、60、120 nmol·L－1處理Molt-4細胞48 h后，組蛋白H3K4

一甲基化和二甲基化表達隨siRNA濃度增加而增強；組蛋白H3K4三甲基化水平不變；組蛋白H3K9一甲基化和二甲基化水平也幾乎不變；組蛋白H3乙酰化水平隨siRNA濃度增加而表達增強（Fig 5）。

Fig 4 Alteration of apoptosis-related protein and DNMT1，p15 protein in Molt-4 cells after transfected with indicated concentrations of LSD1 siRNA for 24 h

3　討論

一般認為，腫瘤的發(fā)生與癌基因的異常激活或過度表達有關，而抑癌基因的失活也可能使細胞向惡性轉(zhuǎn)化。表觀遺傳學的改變對腫瘤的發(fā)生和發(fā)展起了重要的作用。組蛋白H3K4去基化酶LSD1在表觀遺傳學中發(fā)揮了重要作用，其在多種腫瘤表達異常，說明它對腫瘤的發(fā)生有關。本研究以RNA干擾技術(shù)削減急性淋巴細胞白血病Molt-4細胞的LSD1表達，觀察白血病細胞的表觀遺傳學的變化及增殖、凋亡的影響，探討LSD1作為抗腫瘤靶點的可能性。

特異性地誘導腫瘤細胞凋亡已經(jīng)成為治療惡性腫瘤的主要策略之一。2010年Kontaki等［6］首先報告當DNA損傷時，set和LSD1分別對E2F1-K185me進行去甲基化修飾，使其更遠的乙酰化和磷酸化，它主要作用于細胞周期的G1期到S期的過渡，并通過激活p53、p73等輔助因子，即p53依賴和非p53依賴細胞凋亡通路，激活大量凋亡前基因。本研究結(jié)果顯示，LSD1 siRNA干擾LSD1基因后可促進Molt-4細胞凋亡相關蛋白Bcl-2、procaspase-3裂解，觸發(fā)細胞凋亡，細胞凋亡率隨著LSD1 siRNA濃度的增加逐漸上升（P＜0.05）；Wang等［7］鑒定出DN-MT1是LSD1的新底物。DNMT1可被LSD1去甲基化，引起DNA甲基化的失衡。p15（Ink4b）基因?qū)儆谝职┗蛑兄芷诘鞍滓蕾囆约っ敢种埔蜃樱–K-Is）第二大家族，通過抑制CDK4／6，從而抑制Rb蛋白磷酸化，阻止細胞由G1期進入S期，從而減少細胞的異常生長及變異，阻止腫瘤發(fā)生和發(fā)展。沉默LSD1基因可下調(diào)DNA甲基轉(zhuǎn)移酶1（DNMT1），使抑癌基因p15去甲基化而表達上調(diào)，從而抑制腫瘤細胞增殖。

Fig 5 Alteration of histone methylation and acetylation modification of Molt-4 cells after transfection with indicated concentrations of LSD1 siRNA for 24 h

本研究還發(fā)現(xiàn)沉默LSD1后，H3K4的一甲基化和二甲基化水平逐漸增強，組蛋白H3乙酰化水平上調(diào)，而H3K4的三甲基化及H3K9的一甲基化和二甲基化未發(fā)生改變。Shi等［1］和Nicholson等［8］的實驗顯示在FAD的參與下，LSD1在體外可以特異去除組蛋白H3第4位賴氨酸（H3K4）的二甲基和一甲基修飾。而三甲基則需要亞胺陽離子中間體才能介導對H3K4三甲基的去甲基化反應。LSD1不

是H3K9去甲基化酶，但有文獻報告LSD1可在體內(nèi)才能去除H3K9的二甲基和一甲基修飾［9］。Miao等［10］研究發(fā)現(xiàn)：組蛋白H3-K4Me2、H3-K4Me3、H3-K36Me2和H3-K79Me2與高度乙酰化和基因激活都有關系。因此，可以推導出：當組蛋白H3-K4Me2表達增加時，可引起組蛋白高度乙?；?，從而使組蛋白H3乙?；黾?。

本研究提示干擾LSD1基因后腫瘤細胞發(fā)生表觀遺傳學改變，進而促使細胞凋亡，腫瘤細胞受到抑制，有望成為腫瘤治療的靶點。

（致謝：本文實驗在閩南師范大學生物科學院中心實驗室完成，感謝實驗室的老師對本實驗的支持。）

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［6］ Kontaki H，Talianidis I．Lysine methylation regulates E2F1-in-duced cell death［J］．J Molell，2010，39（1）：152－60．

［7］ Wang J，Hevi S，Kurash J K，et al．The lysine demethylase LSD1 （KDM1）is required for maintenance of global DNA methylation ［J］．J Nat Genet，2009，41（1）：125－9．

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Effects of silencing LSD1 gene on Molt-4 cells apoptosis

XU Ke-zhen1，HUANG Yi-qun2，HUANG Xiu-wang3，MA Xu-dong2
（1．Dept of Pharmacy，2．Dept of Hematology，Zhangzhou Affiliated Hospital of Fujian Medical University，Zhangzhou Fujian 363000，China；3．School of Pharmacy，F(xiàn)ujian Medical University，F(xiàn)uzhou 350004，China）

Abstract：Aim To observe the effect of the LSD1 gene on the proliferation and apoptosis of Molt-4 cells，a kind of human acute T-lymphoblastic leukemia cells．Methods siRNA fragment based on LSD1 gene was designed，filtered out and then transfected into Molt-4 cells．The effects of LSD 1 siRNA on Molt-4 cell prolif-eration were observed by the method of MTS．The cell apoptosis was analyzed by flow cytometry．The states of histone H3K4，H3K9 methylation，histone H3 acetyla-tion，p15，DNA methyltransferase 1（DNMT1），and apoptosis-related proteins like Bcl-2，procaspase-3 were evaluated by Western blot．Results Silencing LSD1 gene inhibited cell proliferation．Molt-4 cell pro-liferation rate was（99.65±1.21）%，（83.02± 1.69）%，（65.72±2.16）%，and（41.15±2.23）% respectively after the treatment of Molt-4 cells with 0，30，60，120 nmol·L－1of LSD1 siRNA after 48 hours （P＜0.05）．Cell proliferation rate was（99.86± 1.35）%，（65.72±2.16）%，（48.26±1.92）%，and （37.86±1.66）%respectively after the transfection of Molt-4 cells with 60 nmol·L－1of LSD1 siRNA after 0，24，48，72 hours（P＜0.05）．Cell apoptosis rate was（3.35±1.26）%，（12.16±1.74）%，（32.74 ±2.47）%，（54.64±2.58）%respectively after transfection of LSD1 siRNA in indicated concentrations for 48 hours（P＜0.05）．At the same time，the ex-pression levels of apoptosis-related proteins like Bcl-2，procaspase-3 decreased．LSD1 siRNA inhibited LSD1 and LSD1 mRNA，and accumulated histone mono-，and di-methylation H3K4 and histone H3 acetylation．However，alteration of H3K4 trimethylation，H3K9 methylation was not detected．LSD1 siRNA downregu-lated DNA demethylase DNMT1 and upregulated p15．Conclusions LSD1 siRNA can inhibit Molt-4 cell proliferation and induce apoptosis．Its mechanism may be associated with epigenetic regulation．In addition，it is expected to become a new target for leukemia treat-ment．

Key words：acute leukemia；LSD1；histone；methyla-tion；acetylation；epigenetics

作者簡介：許可珍（1979－），女，碩士，主管藥師，研究方向：臨床藥學，Tel：0596-2082381，E-mail：xkz868＠163．com；馬旭東（1957－），女，碩士，主任醫(yī)師，教授，博士生導師，研究方向：血液腫瘤學，通訊作者，Tel：0596-2082021，F(xiàn)ax：0596-2593904，E-mail：maxudong005＠hotmail．com

基金項目：福建省自然科學基金資助項目（No 2012J01420）；漳州市科學研究發(fā)展計劃基金資助項目（No 20100080）；福建省引進重大項目計劃基金（No 2012I2004）；福建醫(yī)科大學重點科研項目（No FZS13004Z）；福建省醫(yī)學創(chuàng)新課題（No 2012-CX-32）

收稿日期：2015－06－13，修回日期：2015－07－15

文獻標志碼：A

文章編號：1001－1978（2015）11－1603－05

doi：10．3969／j．issn．1001－1978．2015．11．024