血管內(nèi)成栓腦梗死模型的制備及評(píng)價(jià)

馬寅仲，杜冠華

（中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院藥物研究所，藥物靶點(diǎn)研究和新藥篩選北京市重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京 100050）

血管內(nèi)成栓腦梗死模型的制備及評(píng)價(jià)

馬寅仲，杜冠華

（中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院藥物研究所，藥物靶點(diǎn)研究和新藥篩選北京市重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京 100050）

中國圖書分類號(hào)：R-332；R363－332；R743．330．22；R743.330.53

摘要：目的 建立大鼠血管內(nèi)成栓腦梗死模型并對(duì)其病理特征進(jìn)行評(píng)價(jià)。方法 使用直流電刺激頸總動(dòng)脈制造血栓，通過血流引導(dǎo)碎栓堵塞中動(dòng)脈，制造腦栓塞模型。通過測(cè)定腦血流、腦梗死體積、動(dòng)物行為學(xué)等指標(biāo)，評(píng)價(jià)模型特點(diǎn)，并觀察了組織型纖維蛋白酶原激活劑（tissue plasminogen activa-tor，t-PA）的溶栓作用。結(jié)果 腦梗死大鼠的病灶區(qū)血流量降低至基準(zhǔn)值的30%左右，并在造模24 h后表現(xiàn)出明顯的神經(jīng)功能與運(yùn)動(dòng)功能失調(diào)，腦組織出現(xiàn)明顯的梗死灶。使用t-PA進(jìn)行溶栓治療后可以明顯改善上述病理特征。結(jié)論

大鼠血管內(nèi)成栓腦梗死模型適用于進(jìn)行血栓性腦梗死病理研究與藥物溶栓作用評(píng)價(jià)。

關(guān)鍵詞：缺血性腦卒中；中風(fēng)；腦缺血；腦梗死；血栓模型；卒中模型

網(wǎng)絡(luò)出版時(shí)間：2015－10－16 9：52 網(wǎng)絡(luò)出版地址：http：／／www．cnki．net／kcms／detail／34．1086．R．20151016．0952．054．html

腦梗死是指血液中的各種栓子（如心臟內(nèi)的附壁血栓、動(dòng)脈粥樣硬化的斑塊等）隨血流進(jìn)入腦動(dòng)脈而阻塞血管，引起該動(dòng)脈供血區(qū)腦組織缺血性壞死，進(jìn)而出現(xiàn)局灶性的神經(jīng)功能缺損。制備符合臨床實(shí)際的動(dòng)物模型是研究腦栓塞病理過程、治療效果和藥物作用的關(guān)鍵條件。

本實(shí)驗(yàn)室根據(jù)腦栓塞發(fā)生的病理特點(diǎn)和臨床表現(xiàn)，建立了一種新穎的大鼠血管內(nèi)成栓腦梗死模型。通過使用直流電刺激觸發(fā)凝血機(jī)制并形成初始血栓，再通過血流引導(dǎo)血栓阻塞中動(dòng)脈供血，進(jìn)而實(shí)現(xiàn)腦栓塞。本方法能夠穩(wěn)定造成大鼠中動(dòng)脈供血區(qū)腦組織的梗死，并可以通過使用tPA溶解血栓，觀察溶栓治療效果。

1　材料與方法

1．1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 ♂SPF級(jí)大鼠，體質(zhì)量250～300 g，購自北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司，許可證號(hào)：SCXK（京）2012－0001。飼養(yǎng)于中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院藥物研究所動(dòng)物房，光照12 h／d，溫度20℃～23℃，相對(duì)濕度40%～60%。

1．2藥物和試劑 t-PA（50mg）購自勃林格殷格翰。批號(hào)305265。溶解于廠家提供的50 mL注射用水，使用前根據(jù)分組需要，使用醫(yī)用生理鹽水進(jìn)行稀釋。2，3，5-氯化三苯基四氮唑（2，3，5-triphenyl tetrazolium chloride，TTC）購自西格瑪奧德里奇，貨號(hào)17779。TTC用生理鹽水配制成質(zhì)量濃度為每mL 0.5 g的溶液備用。

1．3主要儀器 YLS-14B小動(dòng)物血栓生成儀（濟(jì)南益延科技發(fā)展有限公司）；激光多普勒血流儀（Laser Doppler Flowm-etry，LDF）系統(tǒng)，包括PeriFlux 5001 Main Unit、PF5010 LDPM Unit（激光多普勒微血流灌注量檢測(cè)單元）和LD Probe 407-1 （Perimed Co．，Jarfalla，Sweden）；ALC-HTP小動(dòng)物恒溫系統(tǒng)（上海奧爾科特生物科技有限公司）；DXP-3大小鼠轉(zhuǎn)棒儀（中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院藥物研究所）。

1．4模型制備 按350 mg·kg－1劑量腹腔注射水合氯醛麻醉大鼠，并將其俯臥位固定于鼠板上。沿矢狀縫縱向剪開頭部皮膚并清理手術(shù)視野，以前囟為坐標(biāo)原點(diǎn)，選取前囟后2 mm、右側(cè)5 mm為測(cè)定點(diǎn)，清理周圍直徑約2－3 mm區(qū)域毛細(xì)血管與筋膜，粘接固定好激光多普勒血流儀檢測(cè)探頭并記錄5 min的術(shù)前血流值作為基準(zhǔn)值。

縱向剪開2 cm左右頸部皮膚，分離頸外靜脈、頸總動(dòng)脈與頸外動(dòng)脈，使用動(dòng)脈夾夾閉頸外動(dòng)脈。剝離動(dòng)脈鞘及神經(jīng)，將勁總動(dòng)脈放入血管電擊夾的溝槽內(nèi)，調(diào)整好高度和方向，使用1．00 mA電流強(qiáng)度，持續(xù)電刺激225 s。

電刺激結(jié)束后動(dòng)脈失去搏動(dòng)，并可見血管內(nèi)長度約1 cm的黑色血栓。取下電擊夾，用動(dòng)脈夾夾閉頸總動(dòng)脈的遠(yuǎn)心端，使用長度為1 cm的軟質(zhì)鑷子（頭部為1 mm左右鋸齒）夾動(dòng)血栓10次，此時(shí)血管變?yōu)榫鶆虻幕疑?，同時(shí)可見動(dòng)脈恢復(fù)搏動(dòng)并沖擊碎栓。放開動(dòng)脈夾，見到血栓進(jìn)入頸內(nèi)動(dòng)脈后立即夾閉頸總動(dòng)脈近心端10－15 min。到時(shí)間后打開全部動(dòng)脈夾，若血流值下降至基準(zhǔn)值的40%以下時(shí)，視為形成目的栓塞模型。造模過程如Fig 1所示。造模成功率87.2%（327只大鼠中，42只出現(xiàn)自發(fā)血管再通或血流變化小于基準(zhǔn)值的60%）。

1．5動(dòng)物分組及給藥 大鼠隨機(jī)分為3組（每組10只），分別為：假手術(shù)組（sham）、溶劑對(duì)照組（vehicle）、tPA給藥組。手術(shù)后10 min給藥組于頸外靜脈緩慢推注給藥兩次，兩次給藥間隔30 min。假手術(shù)組及模型溶劑對(duì)照組靜脈注射給予生理鹽水。

1．6觀察指標(biāo)及檢測(cè)方法

1．6．1中動(dòng)脈供血區(qū)腦血流量（cerebral blood flow，CBF）監(jiān)

測(cè) 按照前述方法固定激光多普勒血流儀探頭，持續(xù)監(jiān)測(cè)大鼠中動(dòng)脈供血區(qū)的血流值。血流變化以第二次給藥后30 min血流值與基準(zhǔn)值的百分比變化表示。

Fig 1 Schematic illustration of thrombosis in cerebral embolism model in rats

1．6．2行為學(xué)評(píng)分 手術(shù)后24 h進(jìn)行4項(xiàng)行為學(xué)檢測(cè)：神經(jīng)行為學(xué)評(píng)分，檢測(cè)參照Bederson等［1］和Belvyev等［2］的觀察方法并稍加改進(jìn)：提起鼠尾離地30 cm，正常大鼠兩前肢對(duì)稱向前伸開。如有肩部?jī)?nèi)旋、前肢內(nèi)收，根據(jù)其嚴(yán)重程度，正常評(píng)分為0分，嚴(yán)重程度最高評(píng)為4分。

1．6．2．1轉(zhuǎn)棒實(shí)驗(yàn) 檢測(cè)大鼠的四肢協(xié)調(diào)性。0分：轉(zhuǎn)動(dòng)過程中，鼠可在棒上行走；1分：鼠可以在轉(zhuǎn)動(dòng)的棒上行走至少1 min；2分：轉(zhuǎn)動(dòng)開始后，鼠在1 min以內(nèi)從棒上掉下來；3分：轉(zhuǎn)動(dòng)開始前，鼠從棒上掉落。

1．6．2．2懸掛實(shí)驗(yàn) 觀察大鼠前爪抓握能力。將大鼠前爪同時(shí)掛于直徑5 mm的繩上。1分：兩爪均能掛?。?分：一爪能掛??；3分：兩爪均不能掛住。

1．6．2．3斜板實(shí)驗(yàn) 觀察大鼠后肢力量與四肢協(xié)調(diào)性。將大鼠頭向上放置于85°傾斜木板的塑料顆粒面上。記錄大鼠在斜板上的停留時(shí)間，肢體完全脫離塑料顆粒面時(shí)視為掉落，停留時(shí)間大于120 s時(shí)按120 s計(jì)算。大鼠攀爬至板頂端、四肢中僅部分離開塑料顆粒面均不作為有效結(jié)果。

1．6．3腦梗死體積測(cè)定 行為學(xué)檢測(cè)后，大鼠麻醉后脫頸處死，取全腦迅速于－40℃冷凍并切片。每片厚度2 mm。腦組織切片使用TTC溶液于37℃孵育15 min后，換以4%多聚甲醛孵育20 min。最后按順序擺放切片并拍攝照片。數(shù)據(jù)處理時(shí)，應(yīng)用圖像分析軟件Image J處理并計(jì)算每張腦片的梗死面積，梗死體積以所占大腦半球的百分率來表示，按下述公式計(jì)算以消除腦水腫的影響。

腦梗死體積／%＝（手術(shù)對(duì)側(cè)半球的體積－手術(shù)側(cè)半球未梗死部分的體積）／2×手術(shù)對(duì)側(cè)半球的體積×100%

1．7統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS 17．0統(tǒng)計(jì)軟件，進(jìn)行正態(tài)性檢驗(yàn)。所有數(shù)據(jù)以±s表示，如正態(tài)分布數(shù)據(jù)用單因素方差分析（One-Way ANOVA），若方差齊，兩兩比較采用最小顯著性差異法（least significant difference，LSD）。方差不齊則采用Dunnett’s T3檢驗(yàn)。不符合正態(tài)分布的數(shù)據(jù)采用非參數(shù)檢驗(yàn)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)。死亡率顯著性檢驗(yàn)采用χ2檢驗(yàn)。

2　結(jié)果

2．1血管內(nèi)成栓腦梗死模型大鼠缺血區(qū)血流檢測(cè) 如Fig 2A－2B所示，當(dāng)血栓進(jìn)入中動(dòng)脈供血區(qū)實(shí)現(xiàn)梗死后，CBF立即降低至基準(zhǔn)值的（35.74±8.07）%。模型組在栓塞后的60 min內(nèi)CBF值能夠保持穩(wěn)定。于頸外靜脈注射t-PA后，CBF明顯回升至基準(zhǔn)值的（69.64±7.38）%。造模24 h后，t-PA組15只大鼠存活14只，明顯高于模型組，P＜0.05（3／15）。

Fig 2 Cerebral blood flow in thromboembolic stroke model measured after the thrombolytic therapy

2．2大鼠腦梗死體積檢測(cè) 造模24 h后對(duì)大鼠腦組織進(jìn)行TTC染色。如Fig 3A所示，模型大鼠腦組織出現(xiàn)典型的梗死灶與水腫。模型大鼠的腦梗死體積為（23.66± 4.31）%。而t-PA溶栓治療可以明顯降低腦梗死體積至（12.32±1.13）%（Fig 3B）。

2．3大鼠行為學(xué)檢測(cè) 造模24 h后，大鼠表現(xiàn)出明顯的神經(jīng)功能障礙。模型組大鼠四肢協(xié)調(diào)能力與肢體力量均明顯降低。如Fig 4A－4D所示，t-PA給藥組的各項(xiàng)行為學(xué)檢測(cè)評(píng)分均得到明顯改善，提示t-PA對(duì)模型大鼠的治療作用。

3　討論

腦缺血?jiǎng)游锬Ｐ褪沁M(jìn)行腦缺血病理與治療藥物研究的基礎(chǔ)，目前局灶性腦缺血模型主要有線栓法、栓子栓塞法和局部凝血法［3－4］。

線栓法是目前最常用的腦缺血模型。該模型通常使用適宜直徑的尼龍線由頸外動(dòng)脈經(jīng)頸總動(dòng)脈插入腦中動(dòng)脈阻

塞血流，形成栓塞模型［4］。該方法可以完全阻斷中動(dòng)脈供血，造成穩(wěn)定的腦梗死體積，而且可以通過拔出線栓制備缺血／再灌注損傷模型。然而該方法并不涉及血栓栓塞過程，與臨床血栓形成的實(shí)際過程不一致，也不適用于溶栓藥物的研究。

Fig 3 Brain lesion measured by TTC-staining

Fig 4 Four behavior tests carried out at 24 h after the t-PA treatment in thromboembolic stroke model

栓子栓塞造模法通常通過頸總動(dòng)脈向大腦注入一定體積的栓子，導(dǎo)致腦血管堵塞。目前動(dòng)物實(shí)驗(yàn)使用的栓子主要有兩種，一是塑料栓子，大小均勻，可以形成比較穩(wěn)定的腦缺血模型［5］；二是使用大鼠自身血液，在體外凝固干燥后研磨成顆粒，再通過導(dǎo)管導(dǎo)入大鼠中動(dòng)脈實(shí)現(xiàn)血栓栓塞［6］。該方法由于血栓在體外形成，無法模擬臨床上血栓形成與老化過程。干燥的血栓導(dǎo)入血管內(nèi)不易黏附在血管壁上，易造成梗死體積與梗死區(qū)域的變化，因此不適用于進(jìn)行藥物溶栓能力與時(shí)間窗的研究。

局部凝血法是通過感光染料［7］、凝血酶［8］或三氯化鐵等方式激活中動(dòng)脈凝血酶系統(tǒng)，進(jìn)而形成血栓的造模方式。此類方法雖然屬于體內(nèi)成栓，然而臨床上栓子的多是由內(nèi)皮脫落斑塊形成的混合型血栓，并非單一的血凝塊，且血栓基本是由于非腦源的栓子（分為心源或非心源）通過血流進(jìn)入腦內(nèi)微動(dòng)脈造成的栓塞。此外，此類模型基本都需要開顱手術(shù)，因而釋放了模型動(dòng)物的顱內(nèi)壓，減輕了水腫對(duì)腦組織的損傷。因此這類模型仍然難以勝任溶栓藥物的臨床前研究。

本文介紹了一種新穎的大鼠血管內(nèi)成栓腦梗死模型。本模型盡可能的模擬了臨床上非腦源性腦梗死的發(fā)病過程，因而非常適合進(jìn)行藥物溶栓作用的評(píng)價(jià)。當(dāng)血栓堵塞中動(dòng)脈供血區(qū)后，該區(qū)域的CBF值能夠穩(wěn)定下降至基準(zhǔn)值的30%左右，與其它造模方法產(chǎn)生的血流阻斷效果一致［9］。

造模24 h后，與前述模型類似［10］，大鼠表現(xiàn)出均一的神經(jīng)功能失調(diào)，如身體向一側(cè)傾斜，病灶腦區(qū)對(duì)側(cè)前肢內(nèi)收，肢體自發(fā)性轉(zhuǎn)圈等。TTC染色證明造模大鼠出現(xiàn)腦梗死與水腫現(xiàn)象，且梗死體積較為均一。在使用t-PA進(jìn)行溶栓治療后，病灶區(qū)血流量明顯升高，各項(xiàng)行為學(xué)指標(biāo)均明顯改善，腦梗死體積也明顯縮小。提示使用t-PA進(jìn)行溶栓治療能夠有效溶解血栓，改善腦梗死造成的損傷。

綜上所述，本模型通過血管內(nèi)造栓，不需開顱。造模成功率高（87.2%）、腦梗死體積穩(wěn)定（23.66±4.31）%、造模后能夠表現(xiàn)出相應(yīng)神經(jīng)與運(yùn)動(dòng)功能障礙。血栓的形成、栓塞與老化過程十分接近心源性卒中的病理過程，適用于評(píng)價(jià)藥物的溶栓治療效果和副作用。

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Establishment and evaluation of intravascular thrombosis used for cerebral embolism model

MA Yin-zhong，DU Guan-hua
（Beijing Key Laboratory of Drugs Target and Screening Research，Institute of Materia Medica，Chinese Academy of Medical Sciences and Peking Union Medical College，Beijing 100050，China）

Abstract：Aim To produce cerebral embolism rat model via in-travascularly formed thrombus．Methods Thrombus was formed in common carotid artery（CCA）by constant galvanic stimulation，then it was shattered and MCA was occluded．To i-dentify the feature of the model，focal cerebral blood flow （CBF），cerebral infarction volume and behavior tests were measured．Thrombolysis with tissue plasminogen activator（tPA）were observed．Results This model developed a reduction of blood flow（30%of baselines）within the MCA territory．Signifi- cant infarction and neurological disorder were observed 24 h after the embolism onset．Thrombolysis with tPA ameliorated the path-ological process which was mentioned above．Conclusion Cer-ebral embolism model induced by intravascular formed thrombus in rat is suitable for the research of pathology and thrombolytics for embolic stroke．

Key words：ischemic stroke；stroke；cerebral ischemia；cere-bral embolism；thrombus model；stroke model

作者簡(jiǎn)介：馬寅仲（1986－），男，博士生，研究方向：神經(jīng)藥理學(xué)，E-mail：mayinzhong＠imm．a(chǎn)c．cn；杜冠華（1956－），男，博士，研究員，博士生導(dǎo)師，通訊作者，E-mail：dugh＠imm．a(chǎn)c．cn

基金項(xiàng)目：國家科技部“重大新藥創(chuàng)制”科技重大專項(xiàng)（No 2009ZX09102-034）；國家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目（No 81073120）

收稿日期：2015－07－01，修回日期：2015－07－30

文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A

文章編號(hào)：1001－1978（2015）11－1620－04

doi：10．3969／j．issn．1001－1978．2015．11．027