補體旁路激活致內(nèi)皮細胞纖溶凝血相關(guān)分子表達變化及干預(yù)研究

路青瑜，李 敏，孫黔云

（1．貴州大學(xué)藥學(xué)院，貴州貴陽 550025；2．貴州省中國科學(xué)院天然產(chǎn)物化學(xué)重點實驗室，貴州貴陽 550002；3．貴州省人民醫(yī)院干醫(yī)科，貴州貴陽 550002）

補體旁路激活致內(nèi)皮細胞纖溶凝血相關(guān)分子表達變化及干預(yù)研究

路青瑜1，2，李 敏3，孫黔云2

（1．貴州大學(xué)藥學(xué)院，貴州貴陽 550025；2．貴州省中國科學(xué)院天然產(chǎn)物化學(xué)重點實驗室，貴州貴陽 550002；3．貴州省人民醫(yī)院干醫(yī)科，貴州貴陽 550002）

中國圖書分類號：R322．12；R284．1；R329．2；R341；R392.11；R973.2

摘要：目的 研究補體旁路激活致微血管內(nèi)皮細胞纖溶凝血相關(guān)分子表達的變化及干預(yù)。方法 采用眼鏡蛇毒因子激活血清補體旁路途徑。將旁路活化的血清作用于人微血管內(nèi)皮細胞，通過ELISA檢測多個時間點細胞培養(yǎng)上清中P-selectin、VWF、t-PA、PAI-1、TF、TM的表達，采用NO試劑盒檢測NO水平，并進一步研究吡咯烷二硫氨基甲酸（PDTC）、白藜蘆醇對以上指標(biāo)變化的影響。結(jié)果 微血管內(nèi)皮細胞經(jīng)補體旁路活化產(chǎn)物刺激后，P-selectin、VWF的表達快速上調(diào)，其高峰時間為15 min，而纖溶功能分子t-PA、PAI-1也隨后出現(xiàn)持續(xù)上調(diào)表達，與凝血功能相關(guān)的組織因子TF的表達水平持續(xù)上調(diào)，而血栓蛋白TM及NO的表達下降。PDTC、白藜蘆醇對P-selectin、VWF、t-PA、PAI-1、TF上調(diào)表達具有抑制作用，對NO下調(diào)表達具有干預(yù)作用。而白藜蘆醇能使TM的表達進一步下調(diào)。結(jié)論 補體旁路活化產(chǎn)物會導(dǎo)致微血管內(nèi)皮細胞纖溶凝血功能相關(guān)分子表達的變化，而PDTC、白藜蘆醇對此種變化具有一定的影響。

關(guān)鍵詞：補體；補體旁路活化；內(nèi)皮細胞；纖溶；凝血；PDTC；白藜蘆醇

網(wǎng)絡(luò)出版時間：2015－7－22 10：42 網(wǎng)絡(luò)出版地址：http：／／www．cnki．net／kcms／detail／34．1086．R．20150727．0901．025．html

在膿毒癥、急性肺損傷、缺血／再灌注損傷、多器官功能衰竭等臨床急危重癥與病理損傷中往往伴隨有纖溶凝血功能的改變和失調(diào)以及廣泛的微血栓形成。而這些病理變化與內(nèi)皮細胞（endothelial cells，EC）功能受損密切關(guān)聯(lián)。近年來研究表明，補體在上述臨床急危重癥與病理損傷中扮演了重要的角色［1－2］。補體旁路活化會造成微血管內(nèi)皮細胞的活化，表達黏附分子和炎癥介質(zhì)，從而可能導(dǎo)致炎癥和組織損傷［3－4］。本文研究了補體旁路激活對微血管內(nèi)皮細胞纖溶凝血功能相關(guān)分子表達的變化及PDTC、白藜蘆醇的干預(yù)作用。

1　材料與方法

1．1材料 人微血管內(nèi)皮細胞（human microvascu-lar endothelial cells，HMEC）由本實驗室傳代培養(yǎng)；RPMI 1640培養(yǎng)基購自Gibco；胎牛血清（fetal bovine serum，F(xiàn)BS）為天津灝洋生物制品科技有限公司產(chǎn)品；人P-selectin檢測ELISA試劑盒購自武漢博士德生物工程有限公司；人VWF（von Willebrand factor）、

t-PA（tissue plasminogen activator）、PAI-1（plasmino-gen activator inhibitor）、TF（tissue factor）檢測ELISA試劑盒購自美國Assaypro公司；人TM（thrombomod-ulin）試劑盒購自上海鑫樂生物科技有限公司；NO （nitric oxide）試劑盒購自碧云天生物技術(shù)公司；吡咯烷二硫氨基甲酸（pyrrolidine dithiocarbamate，PDTC）、白藜蘆醇（resveratrol，Res）購自美國Sigma公司；正常人血清（normal human serum，NHS）由本實驗室多名健康志愿者獻血制備而成，分裝后凍存于－80℃，經(jīng)補體活性檢測正常，備用；滅活人血清（inactivated normal human serum，INHS）由NHS于56℃孵育30 min而得；眼鏡蛇毒因子（cobra venom factor，CVF）的制備和激活補體活性測定同文獻［5］；其余試劑均為符合實驗要求的分析純。

1．2儀器 Forma 3111型CO2培養(yǎng)箱（美國Ther-mo公司）；Nikon TS100倒置相差顯微鏡（日本Ni-kon公司）；Milli Q超純水系統(tǒng)和Elix純水系統(tǒng)（美國Millipore公司）；Molecular Devices Spectra MAX-190酶標(biāo)儀（美國MD公司）；5810R冷凍離心機（德國Eppendorf公司）；Revco超低溫冰箱（美國Thermo公司）。

1．3方法

1．3．1內(nèi)皮細胞培養(yǎng) 人微血管內(nèi)皮細胞株HMEC由本實驗室傳代培養(yǎng)，用含20%胎牛血清的RPMI 1640培養(yǎng)基在37℃、5%CO2飽和濕度培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)，收集對數(shù)生長期細胞進行實驗。

1．3．2血清活化 參照前期已發(fā)表文獻［3］的方法，將NHS與CVF（6.5×104U·L－1）等體積混合，在37℃水浴孵育30 min制成CAC（CVF-actived complement）備用。實驗以INHS與CVF的孵育混合物作為對照。

1．3．3CAC對HMEC纖溶凝血相關(guān)蛋白分子表達的影響 將HMEC以1×104cells·well－1，接種于96孔細胞培養(yǎng)板，培養(yǎng)24 h后棄上清，加入140 μL無血清RPMI 1640培養(yǎng)基，再加入60 μL CAC至200 μL，分別孵育不同時間，取5、15、30、60 min上清測定P-selectin、VWF，取1、6、12、24 h上清測定t-PA、PAI-1、TF、TM，上述各指標(biāo)的測定均按照試劑盒說明書進行。實驗同時設(shè)置滅活血清對照組及血清本底對照組（negative control，NC）。

1．3．4CAC對HMEC表達NO的影響 將HMEC 以1×105cells·well－1，接種于24孔細胞培養(yǎng)板，培養(yǎng)24 h后棄上清，后續(xù)操作同“1．3．3”，分別孵育12、24、48 h，取上清按試劑盒說明書步驟測定NO。

1．3．5PDTC、Res對CAC刺激HMEC表達P-selec-tin、VWF、t-PA、PAI-1、TF、TM變化的影響 將HMEC以1×104cells·well－1，接種于96孔細胞培養(yǎng)板，培養(yǎng)24 h后棄上清，分別加入含不同濃度PDTC、Res的無血清RPMI 1640培養(yǎng)基140 μL預(yù)處理細胞1 h，再加入60 μL CAC，37℃孵育不同時間取上清檢測P-selectin、VWF、t-PA、PAI-1、TF、TM。

1．3．6PDTC、Res對CAC刺激HMEC表達NO的影響 將HMEC以1×105cells·well－1，接種于24孔細胞培養(yǎng)板，培養(yǎng)24 h后棄上清，后續(xù)操作同1．3．5，37℃孵育48 h，取上清測定NO。

2　結(jié)果

2．1CAC對HMEC纖溶凝血相關(guān)分子表達的影響

2．1．1CAC對HMEC表達P-selectin、VWF的影響補體旁路活化產(chǎn)物CAC刺激HMEC后能使P-se-lectin、VWF的表達瞬時上調(diào)。P-selectin的表達變化與之前研究結(jié)果［3］類似，在5 min即有明顯上調(diào)，15 min時達到峰值（數(shù)據(jù)未列出）。而VWF的表達高峰在15 min，但在5 min時基本沒變化（Fig 1）。

2．1．2CAC對HMEC表達t-PA、PAI-1的影響CAC刺激HMEC后，t-PA、PAI-1的表達均持續(xù)上調(diào)（數(shù)據(jù)未列），與之前研究結(jié)果［6］類似。其中，24 h時間點刺激組t-PA為（1.941±0.468）μg·L－1，對照組t-PA為（1.185±0.179）μg·L－1，兩者的差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。刺激組t-PA／PAI-1比值在1 h時間點有一個明顯的上調(diào)（P＝0.06）（Fig 2）。

Fig 1 Expression of VWF after HMEC exposure to CAC（n＝4）

Fig 2 Expression of t-PA and PAI-1 after HMEC exposure to CAC（n＝4）

2．1．3CAC對HMEC表達TF、TM、NO的影響CAC刺激HMEC后，TF的表達持續(xù)上調(diào)，TM的表達在6 h時間點后下調(diào)（Fig 3）。而刺激組NO的表達下調(diào)（數(shù)據(jù)未列），與之前研究結(jié)果［3］類似。其中，48 h刺激組NO濃度為（2.297±0.650）μmol· L－1，對照組NO濃度為（4.966±1.823）μmol·L－1，兩者的差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。

2．2PDTC和Res對HMEC纖溶凝血相關(guān)分子表達變化的影響

2．2．1PDTC和Res對HMEC表達P-selectin、VWF的影響 PDTC和Res對CAC刺激HMEC表達P-se-lectin、VWF均具有干預(yù)作用（Fig 4）。其中，高濃度的PDTC和3個濃度的Res對P-selectin的表達具有明顯抑制作用（P＜0.05或P＜0.01），而低劑量的PDTC對VWF表達具有明顯抑制作用（P＜0.05）。

Fig 3 Expression of TF and TM after HMEC exposure to CAC（n＝4）

Fig 4 Effect of PDTC and Res on expressions of P-selectin and VWF after HMEC exposure to CAC（n＝4）

Fig 5 Effect of PDTC and Res on expressions of t-PA and PAI-1 after HMEC exposure to CAC（n＝4）

2．2．2PDTC和Res對HMEC表達t-PA、PAI-1的影響 PDTC和Res對補體活化產(chǎn)物CAC刺激HMEC表達t-PA、PAI-1均具有干預(yù)作用（Fig 5）。其中，Res對t-PA表達的上調(diào)具有明顯的抑制作用（P＜0.01），中、高劑量的PDTC對PAI-1上調(diào)表達具有明顯的抑制作用（P＜0.05），Res能明顯抑制t-PA／PAI-1比值的上調(diào)（P＜0.01）（Fig 5）。

2．2．3PDTC和Res對HMEC表達TF、TM和NO的影響 PDTC和Res對CAC刺激HMEC上調(diào)表達TF具有抑制作用。低劑量的Res能明顯促進TM的下調(diào)表達（P＜0.05）。高劑量的PDTC及3個濃度的Res對NO的下調(diào)表達有明顯干預(yù)作用（P＜0.01）（Fig 6）。

3　討論

本研究采用CVF激活補體旁路途徑來刺激微血管內(nèi)皮細胞。CVF是從眼鏡蛇毒中分離純化出來的一種高度特異的補體旁路激活蛋白，與補體C3b有高度的同源性，其在血清中能與B因子特異結(jié)合，經(jīng)過D因子識別和酶切，進而形成的C3／C5轉(zhuǎn)化酶CVF·Bb可持續(xù)激活補體旁路，產(chǎn)生C3a、C3b、C5a以及攻膜復(fù)合物等多種活化產(chǎn)物。

Fig 6 Effect of PDTC and Res on expressions of TF，TM and NO after HMEC exposure to CAC（n＝4）

研究結(jié)果顯示，內(nèi)皮細胞受到CAC刺激后，P-selectin、VWF表達瞬時上調(diào)，且均在15 min時達到峰值，但P-selectin的表達在5 min時明顯上調(diào)，而此時VWF的表達基本未變化。P-selectin、VWF分別作為內(nèi)皮細胞活化及內(nèi)皮細胞受損的標(biāo)志，均位于內(nèi)皮細胞的Weibel-Palade內(nèi)，以上結(jié)果提示兩者的釋放調(diào)控機制存在差異。纖溶功能相關(guān)指標(biāo)t-PA、PAI-1明顯上調(diào)，t-PA／PAI-1比值在1 h明顯升高，提示纖溶功能的改變，而我們之前的研究也表明補體旁路的激活會導(dǎo)致內(nèi)皮細胞纖溶功能分子的變化［6］。生理條件下，t-PA與PAI-1按1∶1形成穩(wěn)定的復(fù)合物，當(dāng)受到炎癥分子等的刺激時，纖溶局部功能失調(diào)，引起血栓形成。因此，上述實驗結(jié)果提示了CAC刺激HMEC可能會導(dǎo)致纖溶功能的失調(diào)。組織因子TF是凝血因子VII／VIIa的受體和輔助因子，具有激活凝血因子、促進血小板聚集等功能。在本研究中，TF的表達持續(xù)上調(diào)，提示了細胞表面凝血功能的變化。TM是細胞表面蛋白C抗凝血系統(tǒng)的重要組成成份，可作為血管內(nèi)皮損傷的分子標(biāo)記物［7－9］。有研究表明低密度脂蛋白、同型半胱氨酸處理內(nèi)皮細胞后TM的表達會上調(diào)［10－11］。而本實驗中TM的表達下調(diào)，這提示了內(nèi)皮細胞表面抗凝血功能的下降。同時，內(nèi)皮細胞分泌NO明顯減少。NO是體內(nèi)重要的信號及功能分子，與炎癥、凝血密切相關(guān)，其表達的變化是內(nèi)皮細胞功能失調(diào)的重要標(biāo)志［12］。以上結(jié)果表明，補體旁路激活會導(dǎo)致內(nèi)皮細胞纖溶凝血相關(guān)分子表達的變化，從而可能導(dǎo)致微血管內(nèi)皮細胞纖溶凝血功能的失調(diào)。

PDTC和Res的干預(yù)實驗表明，其對P-selectin、 VWF、t-PA、PAI-1、TF上調(diào)表達具有抑制作用，對NO下調(diào)表達具有干預(yù)作用。值得注意的是，Res對TM的下調(diào)表達具有促進作用。PDTC是NF-κB的特異抑制劑，能夠通過阻止Iκb的磷酸化降解，阻礙NF-κB的p65、p50亞基向細胞核內(nèi)轉(zhuǎn)移等多種途徑抑制NF-κB的活化，進而抑制炎癥分子的表達。而Res對NF-κB及NADPH氧化酶的活化具有抑制作用［13］，從而能夠明顯對抗氧化應(yīng)激造成的損傷。本研究中，PDTC、Res對微血管內(nèi)皮細胞纖溶凝血相關(guān)分子的表達變化具有一定的影響，總體上評價，Res的作用優(yōu)于PDTC。上述研究結(jié)果為深入開展相關(guān)的調(diào)控機制及干預(yù)研究提供了線索和參考。

本研究表明，補體旁路激活會導(dǎo)致微血管內(nèi)皮細胞纖溶凝血相關(guān)分子的表達變化及潛在的功能失調(diào)，而PDTC、白藜蘆醇對此種變化具有一定的干預(yù)作用，這有助于進一步認(rèn)識炎癥情況下纖溶凝血功能改變的發(fā)生機制，并能為臨床治療新策略及新藥的篩選和研發(fā)提供參考依據(jù)和適宜的細胞模型。

（致謝：本文實驗是在貴州省中國科學(xué)院天然產(chǎn)物化學(xué)重點實驗室藥理與活性篩選中心孫黔云研究員實驗室完成。）

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Expression of coagulation-and fibrinolysis-related molecules of endothelial cells induced by activated complement alternative pathway and intervention

LU Qing-yu1，2，LI Min3，SUN Qian-yun2
（1．College of Pharmacy，Guizhou University，Guiyang 550025，China；2．Key Laboratory of Chemistry for Natural Products，Guizhou Province and Chinese Academy of Sciences，Guiyang 550002，China；3．General Ward，Guizhou Provincial People’s Hospital，Guiyang 550002，China）

Abstract：Aim To investigate the change of molecu-lar expression related to coagulation and fibrinolysis in human microvascular endothelial cells（HMEC）in-duced by activated complement alternative pathway and effect of pyrrolidine dithiocarbamate（PDTC）and res-veratrol on intervention．Methods Normal human se-rum was activated by cobra venom factor（CVF）．After exposure of HMEC to activated complement for various times，supernatant was removed and assayed for ex-pressions of P-selectin，VWF，t-PA，PAI-1，TF，TM，and NO by using reagent kits．The expressions of the above molecules in HMEC pretreated with PDTC and resveratrol were also investigated．Results P-selectin and VWF were rapidly released by endothelial cells and the expression reached the peak at the time point of 15 min．The expressions of t-PA，PAI-1，and TF were continuously upregulated，whereas NO and TM were decreased．PDTC and resveratrol inhibited the upregulation of P-selectin，VWF，t-PA，PAI-1 and TF，and intervened the downregulation of NO．Res-veratrol further downregulated the expression of TM．Conclusion Activated complement alternative path-way can influence the expression of molecules related to coagulation and fibrinolysis in HMEC，and PDTC and resveratrol can affect this change．

Key words：complement；activation of the complement alternative pathway；endothelial cells；fibrinolysis；co-agulation；PDTC；resveratrol

作者簡介：路青瑜（1988－），女，碩士生，研究方向：天然藥物成分及生理活性，E-mail：756291505＠qq．com；孫黔云（1968－），男，博士，研究員，碩士生導(dǎo)師，研究方向：生化藥理學(xué)與新藥發(fā)現(xiàn)，通訊作者，Tel：0851-83805095，F(xiàn)ax：0851-83805081，E-mail：sunqy＠hotmail．com

基金項目：國家自然科學(xué)基金資助項目（No 31060124、81260494）；貴州省優(yōu)秀科技教育人才省長專項資金項目（黔省專合字2006-65號和2012-9號）

收稿日期：2015－05－29，修回日期：2015－06－27

文獻標(biāo)志碼：A

文章編號：1001－1978（2015）08－1142－05

doi：10．3969／j．issn．1001－1978．2015．08．023