hFcεRIα／RBL-2H3細(xì)胞株的構(gòu)建與評價

王南南，劉中成，張艷芬，劉玉欣，崔 哲，陳 瑤

（河北大學(xué)1．藥學(xué)院、2．科學(xué)技術(shù)處，河北保定 071002）

hFcεRIα／RBL-2H3細(xì)胞株的構(gòu)建與評價

王南南1，劉中成1，張艷芬2，劉玉欣1，崔 哲1，陳 瑤1

（河北大學(xué)1．藥學(xué)院、2．科學(xué)技術(shù)處，河北保定 071002）

中國圖書分類號：R329．24；R392．11；R394.2；R593.1

摘要：目的 構(gòu)建穩(wěn)定表達(dá)人FcεRIα（hFcεRIα）亞基的RBL-2H3細(xì)胞株。方法 利用RT-PCR技術(shù)克隆hFcεRIα基因，構(gòu)建真核表達(dá)載體pCI-neo-hFcεRIα。脂質(zhì)體介導(dǎo)法轉(zhuǎn)染RBL-2H3細(xì)胞，G418篩選獲得穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細(xì)胞株。利用RT-PCR、Western blot及免疫熒光法鑒定轉(zhuǎn)染結(jié)果。結(jié)果通過對脂質(zhì)體介導(dǎo)轉(zhuǎn)染體系進(jìn)行優(yōu)化，轉(zhuǎn)染效率可高達(dá)75.38%。經(jīng)Western blot、免疫熒光及RT-PCR鑒定，hFcεRIα基因在RBL-2H3細(xì)胞內(nèi)成功表達(dá)。結(jié)論 成功構(gòu)建hFcεRIα／RBL-2H3細(xì)胞模型，為深入研究IgE與FcεRI作用機(jī)制及相關(guān)藥物開發(fā)提供了實驗基礎(chǔ)。

關(guān)鍵詞：hFcεRIα；IgE；RBL-2H3細(xì)胞；脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染；G418篩選；穩(wěn)定細(xì)胞株

網(wǎng)絡(luò)出版時間：2015－7－22 10：42 網(wǎng)絡(luò)出版地址：http：／／www．cnki．net／kcms／detail／34．1086．R．20150727．0901．032．html

隨著工業(yè)發(fā)展、環(huán)境污染加重以及人們生活方式現(xiàn)代化，變態(tài)反應(yīng)性疾病發(fā)病率呈逐年增加的趨勢，已經(jīng)成為一種常見病和流行病，尚未有肯定的治愈方法［1］。世界衛(wèi)生組織（WHO）將變態(tài)反應(yīng)性疾病列為21世紀(jì)重點研究和防治的三大疾病之一，已受到諸多研究者的廣泛關(guān)注［2］。肥大細(xì)胞、嗜堿性粒細(xì)胞等效應(yīng)細(xì)胞表面FcεRI與IgE結(jié)合是觸發(fā)變態(tài)反應(yīng)的關(guān)鍵，以IgE／FcεRI信號通路為靶點進(jìn)行藥物設(shè)計已成為當(dāng)前治療變態(tài)反應(yīng)性疾病藥物研究的熱點［3－4］。

大鼠嗜堿性白血病細(xì)胞（rat basophilic leukemia cells，RBL-2H3）是大鼠嗜堿粒細(xì)胞腫瘤株的一個亞系，細(xì)胞膜表達(dá)IgE高親和力受體FcεRI，具有肥大細(xì)胞的多種生物學(xué)特性，是實驗室中常用的一種早期、穩(wěn)定且敏感的肥大細(xì)胞脫顆粒體外檢測模型［5－13］。由于人肥大細(xì)胞不易獲得且培養(yǎng)條件要求嚴(yán)格，RBL-2H3細(xì)胞一直是研究變態(tài)反應(yīng)發(fā)病機(jī)制及治療方法的模式材料［6－8］。據(jù)文獻(xiàn)報道，人IgE具有高度的種屬特異性，人IgE僅與人FcεRI結(jié)合，而不與嚙齒類動物體內(nèi)FcεRI作用，因此，以RBL-2H3細(xì)胞為基礎(chǔ)進(jìn)行體外人IgE與FcεRI的作用研究及藥物設(shè)計具有一定的局限性。本研究利用基因工程技術(shù)克隆hFcεRIα基因，通過構(gòu)建pCI-neo-hFcεRIα真核表達(dá)載體，建立了穩(wěn)定表達(dá)hFcεRIα的RBL-2H3細(xì)胞。該重組細(xì)胞模型將為深入研究變態(tài)反應(yīng)發(fā)病機(jī)制及藥物開發(fā)提供條件基礎(chǔ)。

1　材料與方法

1．1材料 RBL-2H3大鼠嗜堿性白血病細(xì)胞購自中國科學(xué)院細(xì)胞庫；pCI-neo載體、DH5α菌株由本實驗室保存；限制性內(nèi)切酶Xba I、EcoR I、T4 DNA連接酶、膠回收試劑盒、質(zhì)粒提取試劑盒、RNA提取試劑盒、兔抗人FcεRIα抗體購自生工生物工程（上海）股份有限公司；dNTD、PCR Buffer、Taq DNA聚合酶、逆轉(zhuǎn)錄試劑盒、FITC標(biāo)記羊抗兔IgG、HRP標(biāo)記羊抗兔IgG購自康為世紀(jì)生物科技有限公司；DMEM培養(yǎng)基、胰蛋白酶、G418購自索來寶生物科技有限公司；新生牛血清購自杭州四季青公司；GeneTran III轉(zhuǎn)染試劑購自Bi-omiga；PCR引物等DNA均由生工生物工程有限公司合成。

1．2人FcεRIα基因的克隆 依據(jù)GenBank公布的hFcεRIα基因組序列及表達(dá)載體pCI-neo多克隆酶切位點設(shè)計引物序列如下：上游引物：5′-GGAATTCGAAGAAGATG-GCTCCTGC-3′（25 bp），下劃線部分表示EcoR I限制性內(nèi)切酶識別位點；下游引物：5′-GCTCTAGATCAGTTGTTTTT-GGGGT TTG-3′（28 bp），下劃線部分表示Xba I限制性內(nèi)切酶識別位點。U937細(xì)胞培養(yǎng)于含10%新生牛血清的RPMI 1640完全培養(yǎng)液中，當(dāng)細(xì)胞匯合度達(dá)90%時提取細(xì)胞總RNA，RT-PCR法克隆hFcεRIα基因，按以下反應(yīng)程序擴(kuò)增目的基因：cDNA 1 μg；94℃，2 min；94℃，30 s；55℃，30 s；72℃，30 s；25個循環(huán)；72℃，2 min。純化回收目的片段。

1．3pCI-neo-hFcεRIα表達(dá)載體的構(gòu)建與鑒定 取質(zhì)粒載體pCI-neo和回收的hFcεRIα目的片段，分別用Xba I和EcoR I限制性內(nèi)切酶于37℃雙酶切1 h，然后酶切產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳回收純化，再在T4連接酶的作用下于16℃連接過夜。將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化感受態(tài)大腸桿菌DH5α，涂于含有氨芐青霉素（50 mg·L－1）的LB固體培養(yǎng)基，置于37℃生化培養(yǎng)箱中培養(yǎng)12～16 h。挑取單克隆菌落進(jìn)行菌落PCR鑒定，選取陽性克隆接種于含有氨芐青霉素（50 mg·L－1）的LB液體培養(yǎng)基中，37℃震蕩培養(yǎng)過夜。質(zhì)粒試劑盒提取重組質(zhì)粒，將Xba I和EcoR I雙酶切鑒定正確的菌液送生工生物工程有限公司測序。將測序結(jié)果通過blast比對，完全正確的質(zhì)粒命名為pCI-neo-hFcεRIα。無內(nèi)毒素試劑盒大量提取質(zhì)粒并定量備用。

1．4pCI-neo-hFcεRIα轉(zhuǎn)染RBL-2H3細(xì)胞及轉(zhuǎn)染條件的優(yōu)化

1．4．1脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染步驟 RBL-2H3細(xì)胞，用含10%新生牛血清的DMEM培養(yǎng)液，置于37℃、5%CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，用0.25%的胰酶消化細(xì)胞傳代，每2 d換液，3～4 d傳代1次，收集對數(shù)生長期的細(xì)胞進(jìn)行實驗。轉(zhuǎn)染前1 d RBL-2H3細(xì)胞均勻鋪于24孔板，2×105個每孔。細(xì)胞匯合度達(dá)90%～95%時，按Biomiga說明書分別轉(zhuǎn)染pCI-neo-hFcεRIα 和pCI-neo：分別將適量質(zhì)粒DNA和脂質(zhì)體加入無抗生素、無血清的DMEM培養(yǎng)液50 μL中混勻，靜置5 min。然后將兩溶液混勻，室溫放置20 min。吸棄培養(yǎng)板中的培養(yǎng)液，PBS清洗2遍，加入無血清、無抗生素的培養(yǎng)液200 μL，培養(yǎng)箱中孵育20 min。將轉(zhuǎn)染混合液逐滴加入培養(yǎng)板，輕輕混勻，置于培養(yǎng)箱中孵育。

1．4．2細(xì)胞接種數(shù)目的優(yōu)化 轉(zhuǎn)染前1 d分別接種不同數(shù)目的細(xì)胞于24孔板：2×105、1×105、5×104個每孔，每組重復(fù)3次。24 h后觀察細(xì)胞匯合度，通過免疫熒光結(jié)合細(xì)胞計數(shù)法檢測轉(zhuǎn)染效率。

1．4．3質(zhì)粒與轉(zhuǎn)染試劑比例的優(yōu)化 確定合適的培養(yǎng)條件及細(xì)胞接種數(shù)目后，按照說明書確定加入質(zhì)粒的量分別為1.0、2.0、3.0、4.0、5.0 μg，質(zhì)粒加入量與轉(zhuǎn)染試劑量的比例依次設(shè)定為1∶1、1∶2、1∶3、1∶4進(jìn)行轉(zhuǎn)染。24 h后，免疫熒光結(jié)合細(xì)胞計數(shù)法計算細(xì)胞轉(zhuǎn)染效率。

1．5穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細(xì)胞株的篩選 RBL-2H3細(xì)胞培養(yǎng)于含10%新生牛血清的DMEM完全培養(yǎng)液中，均勻鋪于24孔板，1 000個細(xì)胞每孔。待細(xì)胞匯合度達(dá)50%時，向每孔中加入G418至終濃度分別為：0、300、400、500、600、700、800、 900 mg·L－1，每個濃度設(shè)3個復(fù)孔。培養(yǎng)2～3 d更換培養(yǎng)液，并保持G418濃度不變，培養(yǎng)10～14 d。選取RBL-2H3細(xì)胞全部死亡的最低G418濃度為最佳細(xì)胞篩選濃度。

細(xì)胞轉(zhuǎn)染24 h后，按1∶10傳代至含新鮮完全培養(yǎng)液的6孔板，置于37℃、5%CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。24 h后用最佳細(xì)胞篩選濃度的G418進(jìn)行篩選，每3 d更換含G418的培養(yǎng)液，至未轉(zhuǎn)染組細(xì)胞全部死亡。采用有限稀釋法將轉(zhuǎn)染組細(xì)胞接種于96孔板，培養(yǎng)2～3 d后，觀察細(xì)胞生長情況，標(biāo)記生長有單克隆細(xì)胞的孔繼續(xù)G418加壓培養(yǎng)，停止板內(nèi)生長多個克隆和無細(xì)胞生長的孔培養(yǎng)。3～4 d更換含G418的培養(yǎng)液，孔內(nèi)單克隆密度達(dá)1／3時，消化細(xì)胞單克隆，逐級擴(kuò)大培養(yǎng)至獲得穩(wěn)定的單克隆細(xì)胞系，同時以半G418濃度維持篩選。

1．6hFcεRIα／RBL-2H3細(xì)胞的鑒定 RT-PCR檢測：利用試劑盒提取轉(zhuǎn)染后細(xì)胞總RNA，RT-PCR法檢測目的基因的表達(dá)。所用內(nèi)參照為β-actin，上游引物為5′-CTCCATCCTG-GCCTCGCTGT-3′（20 bp），下游引物5′-GCTGTCACCTTCAC-CGTTCC-3′（20 bp），PCR產(chǎn)物應(yīng)為308 bp。按以下反應(yīng)程序進(jìn)行擴(kuò)增：cDNA 1 μg；94℃，2 min；94℃，30 s；55℃，30 s；72℃，30 s；25個循環(huán)；72℃，2 min。反應(yīng)結(jié)果進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳觀察并拍照。

Western blot檢測：轉(zhuǎn)染24 h后，收集轉(zhuǎn)染細(xì)胞，提取細(xì)胞膜蛋白，Western blot檢測目的基因的表達(dá)。首先將膜蛋白進(jìn)行SDS-PAGE電泳，然后轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素膜上，4℃封閉過夜。再加與封閉液1∶500稀釋的兔抗人FcεRIα抗體，37℃孵育1h，TBST洗2次，加入1∶2 000稀釋后的HRP-標(biāo)記的羊抗兔IgG二抗，37℃孵育1 h，TBST洗2次，加入ECL發(fā)光液，檢測結(jié)果并拍照。以β-actin作為內(nèi)參。

免疫熒光檢測：取轉(zhuǎn)染細(xì)胞與野生型RBL-2H3細(xì)胞接種于24孔板，每毫升4×105個，培養(yǎng)箱中培養(yǎng)過夜。PBS 洗3次，4%多聚甲醛室溫固定15 min，PBS洗3次，5%BSA封閉1 h。與1∶500兔抗人FcεRIα多克隆抗體孵育過夜，PBS洗3次，再與FITC標(biāo)記羊抗兔IgG孵育2 h，PBS洗3次后，熒光顯微鏡下觀察并拍照。

2　結(jié)果

2．1hFcεRIα基因的克隆 提取U937細(xì)胞總RNA（Fig 1A），利用RT-PCR方法克隆得到了hFcεRIα基因（796 bp）（Fig 1B）。測序后與GenBank：J03605．1提供序列相一致，表明成功克隆hFcεRIα基因。

2．2pCI-neo-hFcεRIα表達(dá)載體的構(gòu)建與鑒定 hFcεRIα重組質(zhì)粒通過Xba I和EcoR I雙酶切及PCR鑒定，電泳得到796 bp目的條帶，與預(yù)期結(jié)果相符（Fig 2），表明成功構(gòu)建pCI-neo-hFcεRIα表達(dá)載體。

2．3轉(zhuǎn)染條件的優(yōu)化

2．3．1細(xì)胞接種數(shù)目的確定 分別接種細(xì)胞2×105、1× 105、5×104個每孔于24孔板，含10%新生牛血清的無雙抗培養(yǎng)液培養(yǎng)。24 h后顯微鏡下觀察，發(fā)現(xiàn)每組匯合度依次為90%～100%、75%～85%、60%～70%；3組細(xì)胞按照說明書進(jìn)行轉(zhuǎn)染，結(jié)果發(fā)現(xiàn)細(xì)胞匯合度對轉(zhuǎn)染效率影響較大，且匯合度達(dá)75%～85%時的細(xì)胞轉(zhuǎn)染效率較佳，轉(zhuǎn)染效率可達(dá)70.23%（Fig 3）。

Fig 1 Analysis of total RNA from U937 and product of RT-PCR by agarose gel electrophoresis

Fig 2 Recombinant plasmid pCI-neo-hFcεRIα digested with Xba I and EcoR I

Fig 3 Effect of cell confluence on transfection efficiency

2．3．2質(zhì)粒用量及質(zhì)粒與轉(zhuǎn)染試劑比例的確定 接種細(xì)胞1×105個每孔，含10%新生牛血清的無雙抗培養(yǎng)液培養(yǎng)，細(xì)胞匯合度達(dá)75%～85%時進(jìn)行轉(zhuǎn)染。分析發(fā)現(xiàn)當(dāng)DNA加入量小于3.0 μg時，隨著DNA加入量的增多，轉(zhuǎn)染效率也隨之增高；當(dāng)DNA加入量大于3.0 μg時，隨著DNA加入量的增多轉(zhuǎn)染效率下降。當(dāng)質(zhì)粒加入量為3.0 μg、質(zhì)粒與轉(zhuǎn)染試劑比例為1∶3時轉(zhuǎn)染效率最高，可達(dá)75.38%（Fig 4）。

Fig 4 Effect of DNA and transfection reagent on transfection efficiency

2．4G418最佳篩選濃度的確定 不同濃度的G418處理細(xì)胞，每隔2 d換1次液，且顯微鏡下觀察細(xì)胞生長狀況。開始時各組細(xì)胞均生長旺盛、狀態(tài)良好；G418篩選3 d后，800、900 mg·L－1孔中部分細(xì)胞出現(xiàn)死亡，對照組細(xì)胞匯合度達(dá)90%；加壓篩選6 d后，800、900 mg·L－1孔中細(xì)胞全部死亡，600、700 mg·L－1孔中部分細(xì)胞出現(xiàn)死亡，細(xì)胞狀態(tài)差；加壓篩選9 d后，700 mg·L－1孔中細(xì)胞全部死亡，600 mg·L－1孔中僅少數(shù)細(xì)胞貼壁存活；加壓篩選12 d后，600 mg·L－1孔中細(xì)胞全部死亡，其余G418濃度孔內(nèi)細(xì)胞僅部分死亡。因此，G418最佳篩選濃度為600 mg·L－1，見Fig 5。將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染細(xì)胞、空載質(zhì)粒轉(zhuǎn)染細(xì)胞及野生型RBL-2H3細(xì)胞用含有終濃度為600 mg·L－1G418的培養(yǎng)液加壓篩選，至野生型RBL-2H3細(xì)胞全部死亡而轉(zhuǎn)染細(xì)胞克隆貼壁生長；改用含300 mg·L－1G418的培養(yǎng)液維持篩選3～5代至轉(zhuǎn)染細(xì)胞能穩(wěn)定生長，繼續(xù)傳代并冷凍保存。

Fig 5 Conditions of RBL-2H3 cells treated with 600 mg·L－1G418 at different time

2．5hFcεRIα／RBL-2H3細(xì)胞鑒定

2．5．1RT-PCR鑒定hFcεRIα在RBL-2H3細(xì)胞中的表達(dá)情況 細(xì)胞轉(zhuǎn)染24 h后，提取細(xì)胞總RNA，利用RT-PCR方法檢測目的基因的表達(dá)。結(jié)果如Fig 6所示，轉(zhuǎn)染pCI-neo-hFcεRIα的RBL-2H3細(xì)胞中hFcεRIα得到了表達(dá)，轉(zhuǎn)染pCI-neo及未轉(zhuǎn)染的RBL-2H3細(xì)胞中未檢測到相應(yīng)mRNA存在，內(nèi)參β-actin在3種細(xì)胞內(nèi)均正常表達(dá)。

Fig 6 hFcεRIα expressed in RBL-2H3 by RT-PCR analysis

2．5．2Western blot鑒定hFcεRIα在RBL-2H3細(xì)胞中的表達(dá)情況 細(xì)胞轉(zhuǎn)染24 h后，提取細(xì)胞膜蛋白，利用Western blot檢測目的基因的表達(dá)。結(jié)果表明，轉(zhuǎn)染pCI-neo-hFcεRIα 的RBL-2H3細(xì)胞中hFcεRIα表達(dá)，而在轉(zhuǎn)染pCI-neo及未轉(zhuǎn)染的RBL-2H3細(xì)胞均無hFcεRIα表達(dá)（Fig 7）。

Fig 7 Expression of hFcεRIα in RBL-2H3 by Western blot

2．5．3免疫熒光法檢測hFcεRIα蛋白的表達(dá) 細(xì)胞轉(zhuǎn)染24 h后，利用免疫熒光法檢測目的基因的表達(dá)。結(jié)果表明，轉(zhuǎn)染pCI-neo-hFcεRIα的RBL-2H3細(xì)胞中hFcεRIα蛋白免疫熒光鑒定結(jié)果呈陽性，熒光顯微鏡下可觀察到綠色熒光（Fig 8），而轉(zhuǎn)染pCI-neo及未轉(zhuǎn)染的RBL-2H3細(xì)胞中hFcεRIα蛋白免疫熒光鑒定結(jié)果呈陰性，熒光顯微鏡下無綠色熒光。

3　討論

肥大細(xì)胞是IgE介導(dǎo)的I型變態(tài)反應(yīng)的主要效應(yīng)細(xì)胞，RBL-2H3細(xì)胞系是大鼠嗜堿性粒細(xì)胞系的一個亞系，可以表達(dá)肥大細(xì)胞的許多特性和功能，常作為過敏反應(yīng)性疾病體外研究的替代模型。由于IgE與其高親和受體FcεRI的作用具有種屬特異性，故以RBL-2H3細(xì)胞為模型研究I型變態(tài)反應(yīng)具有一定的局限性。因此，構(gòu)建人源化的RBL-2H3細(xì)胞株是便于研究I型變態(tài)反應(yīng)機(jī)制及治療方法的重要手段之一。

Fig 8 Immunofluorescence assay of transfected RBL-2H3 cells

肥大細(xì)胞表面IgE高親和力受體FcεRI由4個亞基組成：1個α鏈、1個跨4次膜的β鏈及2個通過二硫鍵連接的γ鏈。研究者對此3種亞基在變態(tài)反應(yīng)中的作用進(jìn)行了大量研究，發(fā)現(xiàn)在人FcεRIα（hFcεRIα）轉(zhuǎn)染的嚙齒動物細(xì)胞中，當(dāng)hFcεRIα與嚙齒類FcεRI中γ共表達(dá)時，hFcεRIα的胞外區(qū)會高效表達(dá)［14－16］。本實驗通過RT-PCR法得到人FcεRIα基因并將其克隆入真核表達(dá)載體pCI-neo，利用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染法將重組質(zhì)粒導(dǎo)入RBL-2H3細(xì)胞，成功構(gòu)建了hFcεRI／RBL-2H3細(xì)胞株，RT-PCR、Western blot以及免疫熒光結(jié)果均表明hFcεRIα在轉(zhuǎn)染細(xì)胞內(nèi)成功表達(dá)［17－20］。

脂質(zhì)體介導(dǎo)法是當(dāng)前常用的轉(zhuǎn)染方法，但不同細(xì)胞及不同載體的轉(zhuǎn)染條件各不相同。本實驗通過對轉(zhuǎn)染條件進(jìn)行優(yōu)化，發(fā)現(xiàn)在轉(zhuǎn)染過程中細(xì)胞生長狀態(tài)及匯合度是影響轉(zhuǎn)染效率的重要因素，待轉(zhuǎn)染細(xì)胞處于對數(shù)期、匯合度達(dá)75%～85%時，轉(zhuǎn)染效率最高可達(dá)70.23%。不同細(xì)胞的轉(zhuǎn)染條件有很大的差異，卓長華等［21］在轉(zhuǎn)染AAV-293細(xì)胞時發(fā)現(xiàn)，待細(xì)胞匯合度達(dá)60%～80%時細(xì)胞轉(zhuǎn)染效率較佳；張歡等［22］選用匯合度達(dá)80%～90%的HEK293細(xì)胞進(jìn)行轉(zhuǎn)染；張椿等［23］則待H292細(xì)胞匯合度達(dá)90%～95%時進(jìn)行轉(zhuǎn)染。本研究采用Biomiga公司的GeneTran III high efficiency transfec-tion reagent作為轉(zhuǎn)染試劑，該產(chǎn)品推薦轉(zhuǎn)染細(xì)胞的匯合度為90%～95%，在實驗過程中發(fā)現(xiàn)按照此操作得到的結(jié)果不理想，分析原因可能是該細(xì)胞匯合度過高致細(xì)胞活性下降、細(xì)胞活力降低，從而導(dǎo)致該細(xì)胞轉(zhuǎn)染效率降低，這一點可以進(jìn)一步通過該細(xì)胞EB染色及MTT、CCK實驗進(jìn)行驗證。此外，本實驗優(yōu)化了DNA和轉(zhuǎn)染試劑的用量及比例，發(fā)現(xiàn)在一定范圍內(nèi)加大DNA及脂質(zhì)體的用量會提高轉(zhuǎn)染效率，分析認(rèn)為細(xì)胞處于一定的匯合度時，DNA及脂質(zhì)體相對不足；當(dāng)脂質(zhì)體過量時，其對細(xì)胞的毒性作用增大，從而導(dǎo)致轉(zhuǎn)染效率降低。Karmali等［24］亦有類似的研究。

細(xì)胞穩(wěn)定轉(zhuǎn)染最常用的篩選方法是G418篩選，在篩選前需要確定G418的最佳篩選濃度。眾所周知，不同細(xì)胞對G418的敏感性不同，而同一細(xì)胞由于不同廠家、甚至同一廠家生產(chǎn)的相同濃度的G418的批次不同，其活性亦不盡相同，故即使是同一細(xì)胞，其最佳G418篩選濃度也有可能不同。Takagi等［17］建立穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的RBL-2H3細(xì)胞株時使用500 mg ·L－1的G418進(jìn)行篩選；Taudou等［18］用含1 000～2 000 mg ·L－1的選擇性培養(yǎng)基篩選轉(zhuǎn)染的RBL-2H3細(xì)胞；Zhang等［25］則在研究RBL-2H3細(xì)胞內(nèi)Syt2的表達(dá)及作用時選用終濃度為800 mg·L－1的G418篩選穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的RBL-2H3細(xì)胞。本實驗通過對RBL-2H3細(xì)胞的最佳篩選濃度進(jìn)行摸索，最終確定600 mg·L－1的G418為最佳篩選濃度。

綜上所述，本實驗成功構(gòu)建了真核表達(dá)載體pCI-neo-hFcεRIα，建立了最佳RBL-2H3細(xì)胞轉(zhuǎn)染及篩選體系，獲得了穩(wěn)定表達(dá)hFcεRIα的RBL-2H3細(xì)胞株，為基于RBL-2H3細(xì)胞模型研究變態(tài)反應(yīng)奠定了基礎(chǔ)。

（致謝：本研究于河北大學(xué)藥學(xué)院藥物質(zhì)量分析控制重點實驗室完成。）

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Construction and identification of recombinant RBL-2H3 cells transfected with hFcεRIα

WANG Nan-nan1，LIU Zhong-cheng1，ZHANG Yan-fen2，LIU Yu-xin1，CUI Zhe1，CHEN Yao1
（1．College of Pharmaceutical Sciences，2．Science and Technology Office，Hebei University，Baoding Hebei 071002，China）

Abstract：Aim To construct the stable hFcεRIα／RBL-2H3 cell line expressing human FcεRIα（hFcεRIα）．Methods The human FcεRIα gene was obtained by RT-PCR and cloned into the eukaryotic expression vector pCI-neo．Then，the pCI-neo-hFcεRIα vector was transfected into RBL-2H3 cells by lipo-somes，and the transfected cells were screened through G418 fil-tration subsequently．Finally，RT-PCR，Western blot and immu-nofluorescence assay were used to determine the result of trans-fection．Results According to the optimized transfection param- eters，the transfection efficiency reached 75．38%．The results of Western blot，immunofluorescence and RT-PCR showed that hFcεRIα could be expressed in RBL-2H3 cells successfully．Conclusion HFcεRIα／RBL-2H3 cells were successfully con-structed，which will be the experimental basis for further study on the mechanism of IgE／FcεRI and drugs for allergy diseases．

Key words：hFcεRIα；immunoglobulin E；RBL-2H3 cell；lipo-some transfection；G418 filtration；stable cell line

作者簡介：王南南（1990－），女，碩士生，研究方向：分子藥理學(xué)，E-mail：858500370＠qq．com；張艷芬（1979－），女，碩士，講師，研究方向：生化藥學(xué)及分子藥理學(xué)，通訊作者，Tel：0312-5079483，E-mail：zhangjing＠hbu．edu．cn

基金項目：國家自然科學(xué)基金資助項目（No 81202338）；河北省自然科學(xué)基金資助項目（No H2013201128）；中國博士后科學(xué)基金資助項目（No 2013M530885）；河北省教育廳項目（No Z2015013）

收稿日期：2015－04－24，修回日期：2015－05－18

文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A

文章編號：1001－1978（2015）08－1174－06

doi：10．3969／j．issn．1001－1978．2015．08．029