hFcεRIα／RBL-2H3細胞株的構(gòu)建與評價

王南南，劉中成，張艷芬，劉玉欣，崔 哲，陳 瑤

（河北大學1．藥學院、2．科學技術(shù)處，河北保定 071002）

hFcεRIα／RBL-2H3細胞株的構(gòu)建與評價

王南南1，劉中成1，張艷芬2，劉玉欣1，崔 哲1，陳 瑤1

（河北大學1．藥學院、2．科學技術(shù)處，河北保定 071002）

中國圖書分類號：R329．24；R392．11；R394.2；R593.1

摘要：目的 構(gòu)建穩(wěn)定表達人FcεRIα（hFcεRIα）亞基的RBL-2H3細胞株。方法 利用RT-PCR技術(shù)克隆hFcεRIα基因，構(gòu)建真核表達載體pCI-neo-hFcεRIα。脂質(zhì)體介導法轉(zhuǎn)染RBL-2H3細胞，G418篩選獲得穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細胞株。利用RT-PCR、Western blot及免疫熒光法鑒定轉(zhuǎn)染結(jié)果。結(jié)果通過對脂質(zhì)體介導轉(zhuǎn)染體系進行優(yōu)化，轉(zhuǎn)染效率可高達75.38%。經(jīng)Western blot、免疫熒光及RT-PCR鑒定，hFcεRIα基因在RBL-2H3細胞內(nèi)成功表達。結(jié)論 成功構(gòu)建hFcεRIα／RBL-2H3細胞模型，為深入研究IgE與FcεRI作用機制及相關(guān)藥物開發(fā)提供了實驗基礎。

關(guān)鍵詞：hFcεRIα；IgE；RBL-2H3細胞；脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染；G418篩選；穩(wěn)定細胞株

網(wǎng)絡出版時間：2015－7－22 10：42 網(wǎng)絡出版地址：http：／／www．cnki．net／kcms／detail／34．1086．R．20150727．0901．032．html

隨著工業(yè)發(fā)展、環(huán)境污染加重以及人們生活方式現(xiàn)代化，變態(tài)反應性疾病發(fā)病率呈逐年增加的趨勢，已經(jīng)成為一種常見病和流行病，尚未有肯定的治愈方法［1］。世界衛(wèi)生組織（WHO）將變態(tài)反應性疾病列為21世紀重點研究和防治的三大疾病之一，已受到諸多研究者的廣泛關(guān)注［2］。肥大細胞、嗜堿性粒細胞等效應細胞表面FcεRI與IgE結(jié)合是觸發(fā)變態(tài)反應的關(guān)鍵，以IgE／FcεRI信號通路為靶點進行藥物設計已成為當前治療變態(tài)反應性疾病藥物研究的熱點［3－4］。

大鼠嗜堿性白血病細胞（rat basophilic leukemia cells，RBL-2H3）是大鼠嗜堿粒細胞腫瘤株的一個亞系，細胞膜表達IgE高親和力受體FcεRI，具有肥大細胞的多種生物學特性，是實驗室中常用的一種早期、穩(wěn)定且敏感的肥大細胞脫顆粒體外檢測模型［5－13］。由于人肥大細胞不易獲得且培養(yǎng)條件要求嚴格，RBL-2H3細胞一直是研究變態(tài)反應發(fā)病機制及治療方法的模式材料［6－8］。據(jù)文獻報道，人IgE具有高度的種屬特異性，人IgE僅與人FcεRI結(jié)合，而不與嚙齒類動物體內(nèi)FcεRI作用，因此，以RBL-2H3細胞為基礎進行體外人IgE與FcεRI的作用研究及藥物設計具有一定的局限性。本研究利用基因工程技術(shù)克隆hFcεRIα基因，通過構(gòu)建pCI-neo-hFcεRIα真核表達載體，建立了穩(wěn)定表達hFcεRIα的RBL-2H3細胞。該重組細胞模型將為深入研究變態(tài)反應發(fā)病機制及藥物開發(fā)提供條件基礎。

1　材料與方法

1．1材料 RBL-2H3大鼠嗜堿性白血病細胞購自中國科學院細胞庫；pCI-neo載體、DH5α菌株由本實驗室保存；限制性內(nèi)切酶Xba I、EcoR I、T4 DNA連接酶、膠回收試劑盒、質(zhì)粒提取試劑盒、RNA提取試劑盒、兔抗人FcεRIα抗體購自生工生物工程（上海）股份有限公司；dNTD、PCR Buffer、Taq DNA聚合酶、逆轉(zhuǎn)錄試劑盒、FITC標記羊抗兔IgG、HRP標記羊抗兔IgG購自康為世紀生物科技有限公司；DMEM培養(yǎng)基、胰蛋白酶、G418購自索來寶生物科技有限公司；新生牛血清購自杭州四季青公司；GeneTran III轉(zhuǎn)染試劑購自Bi-omiga；PCR引物等DNA均由生工生物工程有限公司合成。

1．2人FcεRIα基因的克隆 依據(jù)GenBank公布的hFcεRIα基因組序列及表達載體pCI-neo多克隆酶切位點設計引物序列如下：上游引物：5′-GGAATTCGAAGAAGATG-GCTCCTGC-3′（25 bp），下劃線部分表示EcoR I限制性內(nèi)切酶識別位點；下游引物：5′-GCTCTAGATCAGTTGTTTTT-GGGGT TTG-3′（28 bp），下劃線部分表示Xba I限制性內(nèi)切酶識別位點。U937細胞培養(yǎng)于含10%新生牛血清的RPMI 1640完全培養(yǎng)液中，當細胞匯合度達90%時提取細胞總RNA，RT-PCR法克隆hFcεRIα基因，按以下反應程序擴增目的基因：cDNA 1 μg；94℃，2 min；94℃，30 s；55℃，30 s；72℃，30 s；25個循環(huán)；72℃，2 min。純化回收目的片段。

1．3pCI-neo-hFcεRIα表達載體的構(gòu)建與鑒定 取質(zhì)粒載體pCI-neo和回收的hFcεRIα目的片段，分別用Xba I和EcoR I限制性內(nèi)切酶于37℃雙酶切1 h，然后酶切產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳回收純化，再在T4連接酶的作用下于16℃連接過夜。將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化感受態(tài)大腸桿菌DH5α，涂于含有氨芐青霉素（50 mg·L－1）的LB固體培養(yǎng)基，置于37℃生化培養(yǎng)箱中培養(yǎng)12～16 h。挑取單克隆菌落進行菌落PCR鑒定，選取陽性克隆接種于含有氨芐青霉素（50 mg·L－1）的LB液體培養(yǎng)基中，37℃震蕩培養(yǎng)過夜。質(zhì)粒試劑盒提取重組質(zhì)粒，將Xba I和EcoR I雙酶切鑒定正確的菌液送生工生物工程有限公司測序。將測序結(jié)果通過blast比對，完全正確的質(zhì)粒命名為pCI-neo-hFcεRIα。無內(nèi)毒素試劑盒大量提取質(zhì)粒并定量備用。

1．4pCI-neo-hFcεRIα轉(zhuǎn)染RBL-2H3細胞及轉(zhuǎn)染條件的優(yōu)化

1．4．1脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染步驟 RBL-2H3細胞，用含10%新生牛血清的DMEM培養(yǎng)液，置于37℃、5%CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，用0.25%的胰酶消化細胞傳代，每2 d換液，3～4 d傳代1次，收集對數(shù)生長期的細胞進行實驗。轉(zhuǎn)染前1 d RBL-2H3細胞均勻鋪于24孔板，2×105個每孔。細胞匯合度達90%～95%時，按Biomiga說明書分別轉(zhuǎn)染pCI-neo-hFcεRIα 和pCI-neo：分別將適量質(zhì)粒DNA和脂質(zhì)體加入無抗生素、無血清的DMEM培養(yǎng)液50 μL中混勻，靜置5 min。然后將兩溶液混勻，室溫放置20 min。吸棄培養(yǎng)板中的培養(yǎng)液，PBS清洗2遍，加入無血清、無抗生素的培養(yǎng)液200 μL，培養(yǎng)箱中孵育20 min。將轉(zhuǎn)染混合液逐滴加入培養(yǎng)板，輕輕混勻，置于培養(yǎng)箱中孵育。

1．4．2細胞接種數(shù)目的優(yōu)化 轉(zhuǎn)染前1 d分別接種不同數(shù)目的細胞于24孔板：2×105、1×105、5×104個每孔，每組重復3次。24 h后觀察細胞匯合度，通過免疫熒光結(jié)合細胞計數(shù)法檢測轉(zhuǎn)染效率。

1．4．3質(zhì)粒與轉(zhuǎn)染試劑比例的優(yōu)化 確定合適的培養(yǎng)條件及細胞接種數(shù)目后，按照說明書確定加入質(zhì)粒的量分別為1.0、2.0、3.0、4.0、5.0 μg，質(zhì)粒加入量與轉(zhuǎn)染試劑量的比例依次設定為1∶1、1∶2、1∶3、1∶4進行轉(zhuǎn)染。24 h后，免疫熒光結(jié)合細胞計數(shù)法計算細胞轉(zhuǎn)染效率。

1．5穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細胞株的篩選 RBL-2H3細胞培養(yǎng)于含10%新生牛血清的DMEM完全培養(yǎng)液中，均勻鋪于24孔板，1 000個細胞每孔。待細胞匯合度達50%時，向每孔中加入G418至終濃度分別為：0、300、400、500、600、700、800、 900 mg·L－1，每個濃度設3個復孔。培養(yǎng)2～3 d更換培養(yǎng)液，并保持G418濃度不變，培養(yǎng)10～14 d。選取RBL-2H3細胞全部死亡的最低G418濃度為最佳細胞篩選濃度。

細胞轉(zhuǎn)染24 h后，按1∶10傳代至含新鮮完全培養(yǎng)液的6孔板，置于37℃、5%CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。24 h后用最佳細胞篩選濃度的G418進行篩選，每3 d更換含G418的培養(yǎng)液，至未轉(zhuǎn)染組細胞全部死亡。采用有限稀釋法將轉(zhuǎn)染組細胞接種于96孔板，培養(yǎng)2～3 d后，觀察細胞生長情況，標記生長有單克隆細胞的孔繼續(xù)G418加壓培養(yǎng)，停止板內(nèi)生長多個克隆和無細胞生長的孔培養(yǎng)。3～4 d更換含G418的培養(yǎng)液，孔內(nèi)單克隆密度達1／3時，消化細胞單克隆，逐級擴大培養(yǎng)至獲得穩(wěn)定的單克隆細胞系，同時以半G418濃度維持篩選。

1．6hFcεRIα／RBL-2H3細胞的鑒定 RT-PCR檢測：利用試劑盒提取轉(zhuǎn)染后細胞總RNA，RT-PCR法檢測目的基因的表達。所用內(nèi)參照為β-actin，上游引物為5′-CTCCATCCTG-GCCTCGCTGT-3′（20 bp），下游引物5′-GCTGTCACCTTCAC-CGTTCC-3′（20 bp），PCR產(chǎn)物應為308 bp。按以下反應程序進行擴增：cDNA 1 μg；94℃，2 min；94℃，30 s；55℃，30 s；72℃，30 s；25個循環(huán)；72℃，2 min。反應結(jié)果進行瓊脂糖凝膠電泳觀察并拍照。

Western blot檢測：轉(zhuǎn)染24 h后，收集轉(zhuǎn)染細胞，提取細胞膜蛋白，Western blot檢測目的基因的表達。首先將膜蛋白進行SDS-PAGE電泳，然后轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素膜上，4℃封閉過夜。再加與封閉液1∶500稀釋的兔抗人FcεRIα抗體，37℃孵育1h，TBST洗2次，加入1∶2 000稀釋后的HRP-標記的羊抗兔IgG二抗，37℃孵育1 h，TBST洗2次，加入ECL發(fā)光液，檢測結(jié)果并拍照。以β-actin作為內(nèi)參。

免疫熒光檢測：取轉(zhuǎn)染細胞與野生型RBL-2H3細胞接種于24孔板，每毫升4×105個，培養(yǎng)箱中培養(yǎng)過夜。PBS 洗3次，4%多聚甲醛室溫固定15 min，PBS洗3次，5%BSA封閉1 h。與1∶500兔抗人FcεRIα多克隆抗體孵育過夜，PBS洗3次，再與FITC標記羊抗兔IgG孵育2 h，PBS洗3次后，熒光顯微鏡下觀察并拍照。

2　結(jié)果

2．1hFcεRIα基因的克隆 提取U937細胞總RNA（Fig 1A），利用RT-PCR方法克隆得到了hFcεRIα基因（796 bp）（Fig 1B）。測序后與GenBank：J03605．1提供序列相一致，表明成功克隆hFcεRIα基因。

2．2pCI-neo-hFcεRIα表達載體的構(gòu)建與鑒定 hFcεRIα重組質(zhì)粒通過Xba I和EcoR I雙酶切及PCR鑒定，電泳得到796 bp目的條帶，與預期結(jié)果相符（Fig 2），表明成功構(gòu)建pCI-neo-hFcεRIα表達載體。

2．3轉(zhuǎn)染條件的優(yōu)化

2．3．1細胞接種數(shù)目的確定 分別接種細胞2×105、1× 105、5×104個每孔于24孔板，含10%新生牛血清的無雙抗培養(yǎng)液培養(yǎng)。24 h后顯微鏡下觀察，發(fā)現(xiàn)每組匯合度依次為90%～100%、75%～85%、60%～70%；3組細胞按照說明書進行轉(zhuǎn)染，結(jié)果發(fā)現(xiàn)細胞匯合度對轉(zhuǎn)染效率影響較大，且匯合度達75%～85%時的細胞轉(zhuǎn)染效率較佳，轉(zhuǎn)染效率可達70.23%（Fig 3）。

Fig 1 Analysis of total RNA from U937 and product of RT-PCR by agarose gel electrophoresis

Fig 2 Recombinant plasmid pCI-neo-hFcεRIα digested with Xba I and EcoR I

Fig 3 Effect of cell confluence on transfection efficiency

2．3．2質(zhì)粒用量及質(zhì)粒與轉(zhuǎn)染試劑比例的確定 接種細胞1×105個每孔，含10%新生牛血清的無雙抗培養(yǎng)液培養(yǎng)，細胞匯合度達75%～85%時進行轉(zhuǎn)染。分析發(fā)現(xiàn)當DNA加入量小于3.0 μg時，隨著DNA加入量的增多，轉(zhuǎn)染效率也隨之增高；當DNA加入量大于3.0 μg時，隨著DNA加入量的增多轉(zhuǎn)染效率下降。當質(zhì)粒加入量為3.0 μg、質(zhì)粒與轉(zhuǎn)染試劑比例為1∶3時轉(zhuǎn)染效率最高，可達75.38%（Fig 4）。

Fig 4 Effect of DNA and transfection reagent on transfection efficiency

2．4G418最佳篩選濃度的確定 不同濃度的G418處理細胞，每隔2 d換1次液，且顯微鏡下觀察細胞生長狀況。開始時各組細胞均生長旺盛、狀態(tài)良好；G418篩選3 d后，800、900 mg·L－1孔中部分細胞出現(xiàn)死亡，對照組細胞匯合度達90%；加壓篩選6 d后，800、900 mg·L－1孔中細胞全部死亡，600、700 mg·L－1孔中部分細胞出現(xiàn)死亡，細胞狀態(tài)差；加壓篩選9 d后，700 mg·L－1孔中細胞全部死亡，600 mg·L－1孔中僅少數(shù)細胞貼壁存活；加壓篩選12 d后，600 mg·L－1孔中細胞全部死亡，其余G418濃度孔內(nèi)細胞僅部分死亡。因此，G418最佳篩選濃度為600 mg·L－1，見Fig 5。將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染細胞、空載質(zhì)粒轉(zhuǎn)染細胞及野生型RBL-2H3細胞用含有終濃度為600 mg·L－1G418的培養(yǎng)液加壓篩選，至野生型RBL-2H3細胞全部死亡而轉(zhuǎn)染細胞克隆貼壁生長；改用含300 mg·L－1G418的培養(yǎng)液維持篩選3～5代至轉(zhuǎn)染細胞能穩(wěn)定生長，繼續(xù)傳代并冷凍保存。

Fig 5 Conditions of RBL-2H3 cells treated with 600 mg·L－1G418 at different time

2．5hFcεRIα／RBL-2H3細胞鑒定

2．5．1RT-PCR鑒定hFcεRIα在RBL-2H3細胞中的表達情況 細胞轉(zhuǎn)染24 h后，提取細胞總RNA，利用RT-PCR方法檢測目的基因的表達。結(jié)果如Fig 6所示，轉(zhuǎn)染pCI-neo-hFcεRIα的RBL-2H3細胞中hFcεRIα得到了表達，轉(zhuǎn)染pCI-neo及未轉(zhuǎn)染的RBL-2H3細胞中未檢測到相應mRNA存在，內(nèi)參β-actin在3種細胞內(nèi)均正常表達。

Fig 6 hFcεRIα expressed in RBL-2H3 by RT-PCR analysis

2．5．2Western blot鑒定hFcεRIα在RBL-2H3細胞中的表達情況 細胞轉(zhuǎn)染24 h后，提取細胞膜蛋白，利用Western blot檢測目的基因的表達。結(jié)果表明，轉(zhuǎn)染pCI-neo-hFcεRIα 的RBL-2H3細胞中hFcεRIα表達，而在轉(zhuǎn)染pCI-neo及未轉(zhuǎn)染的RBL-2H3細胞均無hFcεRIα表達（Fig 7）。

Fig 7 Expression of hFcεRIα in RBL-2H3 by Western blot

2．5．3免疫熒光法檢測hFcεRIα蛋白的表達 細胞轉(zhuǎn)染24 h后，利用免疫熒光法檢測目的基因的表達。結(jié)果表明，轉(zhuǎn)染pCI-neo-hFcεRIα的RBL-2H3細胞中hFcεRIα蛋白免疫熒光鑒定結(jié)果呈陽性，熒光顯微鏡下可觀察到綠色熒光（Fig 8），而轉(zhuǎn)染pCI-neo及未轉(zhuǎn)染的RBL-2H3細胞中hFcεRIα蛋白免疫熒光鑒定結(jié)果呈陰性，熒光顯微鏡下無綠色熒光。

3　討論

肥大細胞是IgE介導的I型變態(tài)反應的主要效應細胞，RBL-2H3細胞系是大鼠嗜堿性粒細胞系的一個亞系，可以表達肥大細胞的許多特性和功能，常作為過敏反應性疾病體外研究的替代模型。由于IgE與其高親和受體FcεRI的作用具有種屬特異性，故以RBL-2H3細胞為模型研究I型變態(tài)反應具有一定的局限性。因此，構(gòu)建人源化的RBL-2H3細胞株是便于研究I型變態(tài)反應機制及治療方法的重要手段之一。

Fig 8 Immunofluorescence assay of transfected RBL-2H3 cells

肥大細胞表面IgE高親和力受體FcεRI由4個亞基組成：1個α鏈、1個跨4次膜的β鏈及2個通過二硫鍵連接的γ鏈。研究者對此3種亞基在變態(tài)反應中的作用進行了大量研究，發(fā)現(xiàn)在人FcεRIα（hFcεRIα）轉(zhuǎn)染的嚙齒動物細胞中，當hFcεRIα與嚙齒類FcεRI中γ共表達時，hFcεRIα的胞外區(qū)會高效表達［14－16］。本實驗通過RT-PCR法得到人FcεRIα基因并將其克隆入真核表達載體pCI-neo，利用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染法將重組質(zhì)粒導入RBL-2H3細胞，成功構(gòu)建了hFcεRI／RBL-2H3細胞株，RT-PCR、Western blot以及免疫熒光結(jié)果均表明hFcεRIα在轉(zhuǎn)染細胞內(nèi)成功表達［17－20］。

脂質(zhì)體介導法是當前常用的轉(zhuǎn)染方法，但不同細胞及不同載體的轉(zhuǎn)染條件各不相同。本實驗通過對轉(zhuǎn)染條件進行優(yōu)化，發(fā)現(xiàn)在轉(zhuǎn)染過程中細胞生長狀態(tài)及匯合度是影響轉(zhuǎn)染效率的重要因素，待轉(zhuǎn)染細胞處于對數(shù)期、匯合度達75%～85%時，轉(zhuǎn)染效率最高可達70.23%。不同細胞的轉(zhuǎn)染條件有很大的差異，卓長華等［21］在轉(zhuǎn)染AAV-293細胞時發(fā)現(xiàn)，待細胞匯合度達60%～80%時細胞轉(zhuǎn)染效率較佳；張歡等［22］選用匯合度達80%～90%的HEK293細胞進行轉(zhuǎn)染；張椿等［23］則待H292細胞匯合度達90%～95%時進行轉(zhuǎn)染。本研究采用Biomiga公司的GeneTran III high efficiency transfec-tion reagent作為轉(zhuǎn)染試劑，該產(chǎn)品推薦轉(zhuǎn)染細胞的匯合度為90%～95%，在實驗過程中發(fā)現(xiàn)按照此操作得到的結(jié)果不理想，分析原因可能是該細胞匯合度過高致細胞活性下降、細胞活力降低，從而導致該細胞轉(zhuǎn)染效率降低，這一點可以進一步通過該細胞EB染色及MTT、CCK實驗進行驗證。此外，本實驗優(yōu)化了DNA和轉(zhuǎn)染試劑的用量及比例，發(fā)現(xiàn)在一定范圍內(nèi)加大DNA及脂質(zhì)體的用量會提高轉(zhuǎn)染效率，分析認為細胞處于一定的匯合度時，DNA及脂質(zhì)體相對不足；當脂質(zhì)體過量時，其對細胞的毒性作用增大，從而導致轉(zhuǎn)染效率降低。Karmali等［24］亦有類似的研究。

細胞穩(wěn)定轉(zhuǎn)染最常用的篩選方法是G418篩選，在篩選前需要確定G418的最佳篩選濃度。眾所周知，不同細胞對G418的敏感性不同，而同一細胞由于不同廠家、甚至同一廠家生產(chǎn)的相同濃度的G418的批次不同，其活性亦不盡相同，故即使是同一細胞，其最佳G418篩選濃度也有可能不同。Takagi等［17］建立穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的RBL-2H3細胞株時使用500 mg ·L－1的G418進行篩選；Taudou等［18］用含1 000～2 000 mg ·L－1的選擇性培養(yǎng)基篩選轉(zhuǎn)染的RBL-2H3細胞；Zhang等［25］則在研究RBL-2H3細胞內(nèi)Syt2的表達及作用時選用終濃度為800 mg·L－1的G418篩選穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的RBL-2H3細胞。本實驗通過對RBL-2H3細胞的最佳篩選濃度進行摸索，最終確定600 mg·L－1的G418為最佳篩選濃度。

綜上所述，本實驗成功構(gòu)建了真核表達載體pCI-neo-hFcεRIα，建立了最佳RBL-2H3細胞轉(zhuǎn)染及篩選體系，獲得了穩(wěn)定表達hFcεRIα的RBL-2H3細胞株，為基于RBL-2H3細胞模型研究變態(tài)反應奠定了基礎。

（致謝：本研究于河北大學藥學院藥物質(zhì)量分析控制重點實驗室完成。）

參考文獻：

［1］ 鄧 政，蒲小平．抗I型變態(tài)反應的藥物作用靶點及其新藥研發(fā)［J］．中國新藥雜志，2013，22（4）：417－46．

［1］ Deng Z，Pu X P．Progress in research of the targets and new drugs resisting type I hypersensitivity［J］．Chin J New Drug，2013，22 （4）：417－46．

［2］ 楊越楠．變態(tài)反應性疾病的相關(guān)發(fā)病因素分析［J］．中國醫(yī)藥導報，2011，8（19）：8－9．

［2］ Yang Y N．Analysis of related factors of allergic diseases［J］．Chi-na Med Her，2011，8（19）：8－9．

［3］ Frandsen P M，Krohn I J，Hoffmann H J，et al．The influence of IgE on cultured human mast cells［J］．Allergy Asthma Immunol Res，2013，5（6）：409－14．

［4］ 劉中成，時海浪，張艷芬，等．以IgE／FcεRI信號通路為靶標治療變態(tài)反應性疾病研究進展［J］．藥學學報，2011，46 （10）：1161－6．

［4］ Liu Z C，Shi H L，Zhang Y F，et al．Progress in the study if al-lergic disease drugs targeting on IgE／FcεRI signaling pathway［J］．Acta Pharm Sin，2011，46（10）：1161－6．

［5］ Bischoff S．Role of mast cells in allergic and non-allergic immune responses：comparison of human and murine data［J］．Immunol，2007，7：93－104．

［6］ Sun N，Zhou C，Zhou X，et al．Use of a rat basophil leukemia （RBL）cell-based immunological assay for allergen identification，clinical diagnosis of allergy，and identification of anti-allergy a-gents for use in immunotherapy［J］．J Immunotoxicol，2015，12 （2）：199－205．

［7］ 趙 吟，李 欽，張信岳．基于RBL-2H3細胞模型的I型過敏反應和類過敏反應研究［J］．中國臨床藥理學與治療學，2010，15（11）：1310－5．

［7］ Zhao Y，Li Q，Zhang X Y．Study progress of type I anaphylaxis reaction and anaphylactoid reaction on the basis of RBL-2H3 cell models［J］．Chin J Clin Pharmacol Ther，2010，15（11）：1310 －5．

［8］ 張瑞霞，林海霞，湯納平，等．藥物超敏反應安全評價體外代替方法的研究進展［J］．中國新藥雜志，2012，21（13）：1494 －506．

［8］ Zhang R X，Lin H X，Tang N P，et al．In vitro alternatives to safety assessment of drug-induced hypersensitivity reactions［J］．China J New Drugs，2012，21（13）：1494－506．

［9］ Peng B，He R，Xu Q H，et al．Comparison of RBL-2H3 and P815 cell lines for establishing in vitro model of mast cell degranu-lation［J］．Chin J Nat Med，2011，9（3）：227－31．

［10］孫 娜，周 催，王翠燕，等．大鼠嗜堿性白血病粒細胞系RBL-2H3和RBL-1細胞模型在評價食品潛在致敏性中的比較［J］．農(nóng)業(yè)生物技術(shù)學報，2013，21（12）：1465－72．

［10］Sun N，Zhou C，Wang C Y，et al．Comparison of rat（rattus nor-vegicus）basophilic leukaemia（RBL）-2H3 and RBL-1 cell models for evaluating potential allergenicity of food［J］．J Agricult Biotech-nol，2013，21（12）：1465－72．

［11］周 琴，付賢樹，王為民．RBL-2H3細胞在藥理學研究上的應用［J］．中國藥學雜志，2011，46（17）：1305－8．

［11］Zhou Q，F(xiàn)u X S，Wang W M．Application of RBL-2H3 cell line in pharmacology［J］．Chin Pharm J，2011，46（17）：1305－8．

［12］張立波，易娟娟，趙 琳，等．RBL-2H3細胞用于藥物類過敏反應評價［J］．中國藥理學與毒理學雜志，2013，27（3）：549 －56．

［12］Zhang L B，Yi J J，Zhao L，et al．Assessment of anaphylactoid re-action of RBL-2H3 cells［J］．Chin J Pharmacol Toxicol，2013，27 （3）：549－56．

［13］陳 萍，房林華．RBL-2H3細胞系在過敏性疾病中的應用［J］．生命的化學，2010，30（4）：586－9．

［13］Chen P，F(xiàn)ang L H．Application of RBL-2H3 cell line in allergic diseases［J］．Chem Life，2010，30（4）：586－9．

［14］Hakimi J，Seals C，Kondas J A，et al．The α subunit of the hu-man IgE receptor（FcεRI）is sufficient for high affinity IgE bing-ding［J］．J Biol Chem，1990，265（36）：22079－81．

［15］Blank U，Ra C S，Kinet J P．Characterization of truncated α chain products from human，rat，and mouse high affinity receptor for im-munoglobulin E［J］．J Biol Chem，1991，266（4）：2639－46．

［16］Ra C，Jouvin M H，Kinet J P．Complete structure of the mouse mast cell receptor for IgE（FcεRI）and surface expression of chim-eric receptors（rat-mouse-human）on transfected cells［J］．J Biol Chem，1989，264（26）：15323－7．

［17］Takagi K，Nakamura R，Teshima R，Sawada J．Application of hu-man FcεRIα-chain-transfected RBL-2H3 cells for estimation of ac-tive serum IgE［J］．Biol Pharm Bull，2003，26（2）：252－5．

［18］Taudou G，Varin-Blank N，Jouin H，et al．Expression of the al-pha chain of human FcεRI in transfected rat basophilic leukemia cells：functional activation after sensitization with human mite-spe-cific IgE［J］．Int Arch Allergy Immunol，1993，100（4）：344－50．

［19］Fung-Leung W P，De Sousa-Hitzler J，Ishaque A，et al．Trans-genic mice expressing the human high-affinity immunoglobulin （Ig）E receptor α chain respond to human IgE in mast cell de-granulation and in allergic reactions［J］．J Exp Med，1996，183 （1）：49－56．

［20］Gilfillan A M，Kado-Fong H，Wiggan G A，et al．Conservation of signal transduction mechanisms via the human FcεRIα after trans-fection into a rat mast cell line，RBL 2H3［J］．J Immunol，1992，149（7）：2445－51．

［21］卓長華，應敏剛，龔福生．脂質(zhì)體介導質(zhì)粒DNA體外細胞轉(zhuǎn)染的優(yōu)化研究［J］．腫瘤學雜志，2012，16（6）：453－5．

［21］Zhuo C H，Ying M G，Gong F S．Optimization lipofectamine trans-fer DNA in vitro［J］．J Chin Oncol，2012，16（6）：453－5．

［22］張 歡，方 瑞，黃思超，等．穩(wěn)定表達重組小鼠FAPα蛋白細胞株的構(gòu)建［J］．生物技術(shù)通報，2012，5：93－8．

［22］Zhang H，F(xiàn)ang R，Huang S C，et al．Establishment of a cell line stably expressing recombinant mouse FAPα［J］．Biotechnol Bull，2012，5：93－8．

［23］張 椿，錢桂生，趙云峰，等．SIGIRR-EGFP真核表達載體構(gòu)建及在H292細胞中的亞細胞定位研究［J］．免疫學雜志，2009，25（1）：64－7．

◇研究簡報◇

［23］Zhang C，Qian G S，Zhao Y F，et al．Construction of eukaryotic expression vector of SIGIRR-EGFP and its subcellular localization in H292 cells［J］．Immunol J，2009，25（1）：64－7．

［24］Karmali P P，Majeti B K，Sreedhar B，et al．In vitro gene transfer efficacies and serum compatibility profiles of novel mono-，di-，and tri-histidinylated cationic transfection lipids：a structure-activity in-vestigation［J］．Bioconjug Chem，2006，17（1）：159－71．

［25］Zhang J C，Lu W L，Li Y R，et al．Anti-sense RNA inhibits the expression of synaptotagmin II in RBL-2H3 and enhances the exocy-tosis of lysosomes in RBL-2H3［J］．J Huazhong Univ Sci Technol，2005，25（2）：117－20．

Construction and identification of recombinant RBL-2H3 cells transfected with hFcεRIα

WANG Nan-nan1，LIU Zhong-cheng1，ZHANG Yan-fen2，LIU Yu-xin1，CUI Zhe1，CHEN Yao1
（1．College of Pharmaceutical Sciences，2．Science and Technology Office，Hebei University，Baoding Hebei 071002，China）

Abstract：Aim To construct the stable hFcεRIα／RBL-2H3 cell line expressing human FcεRIα（hFcεRIα）．Methods The human FcεRIα gene was obtained by RT-PCR and cloned into the eukaryotic expression vector pCI-neo．Then，the pCI-neo-hFcεRIα vector was transfected into RBL-2H3 cells by lipo-somes，and the transfected cells were screened through G418 fil-tration subsequently．Finally，RT-PCR，Western blot and immu-nofluorescence assay were used to determine the result of trans-fection．Results According to the optimized transfection param- eters，the transfection efficiency reached 75．38%．The results of Western blot，immunofluorescence and RT-PCR showed that hFcεRIα could be expressed in RBL-2H3 cells successfully．Conclusion HFcεRIα／RBL-2H3 cells were successfully con-structed，which will be the experimental basis for further study on the mechanism of IgE／FcεRI and drugs for allergy diseases．

Key words：hFcεRIα；immunoglobulin E；RBL-2H3 cell；lipo-some transfection；G418 filtration；stable cell line

作者簡介：王南南（1990－），女，碩士生，研究方向：分子藥理學，E-mail：858500370＠qq．com；張艷芬（1979－），女，碩士，講師，研究方向：生化藥學及分子藥理學，通訊作者，Tel：0312-5079483，E-mail：zhangjing＠hbu．edu．cn

基金項目：國家自然科學基金資助項目（No 81202338）；河北省自然科學基金資助項目（No H2013201128）；中國博士后科學基金資助項目（No 2013M530885）；河北省教育廳項目（No Z2015013）

收稿日期：2015－04－24，修回日期：2015－05－18

文獻標志碼：A

文章編號：1001－1978（2015）08－1174－06

doi：10．3969／j．issn．1001－1978．2015．08．029