抑制NADPH氧化酶對(duì)腦缺血／再灌注損傷的保護(hù)作用

于 麗，童旭輝，樊宗兵，陳銀玲，李 言，董淑英

（蚌埠醫(yī)學(xué)院藥學(xué)系藥理學(xué)教研室，安徽蚌埠 233030）

抑制NADPH氧化酶對(duì)腦缺血／再灌注損傷的保護(hù)作用

于 麗，童旭輝，樊宗兵，陳銀玲，李 言，董淑英

（蚌埠醫(yī)學(xué)院藥學(xué)系藥理學(xué)教研室，安徽蚌埠 233030）

中國(guó)圖書分類號(hào)：R-332；R329．24；R743．310．22；R977.3

摘要：目的 研究抑制NADPH氧化酶對(duì)大鼠局灶性腦缺血／再灌注損傷的保護(hù)作用及可能機(jī)制。方法 利用線栓法制備大鼠大腦中動(dòng)脈栓塞（middle cerebral artery occlusion，MCAO）模型，于缺血前15 min尾靜脈注射apocynin 2.5 mg ·kg－1，腦缺血2 h恢復(fù)血液再灌注24 h后，對(duì)大鼠進(jìn)行神經(jīng)行為學(xué)評(píng)分、腦梗死體積、腦組織病理形態(tài)學(xué)以及Cx36、PKC、Bax、Bcl-2蛋白表達(dá)變化的檢測(cè)。結(jié)果 使用NADPH氧化酶抑制劑apocynin，能明顯降低局灶性腦缺血／再灌注損傷大鼠神經(jīng)行為學(xué)評(píng)分和腦梗死體積百分率，減輕腦組織病理形態(tài)學(xué)損傷，增加大鼠Cx36、PKC蛋白的表達(dá)，降低Bax 與Bcl-2的比值。在使用apocynin的基礎(chǔ)上加用PKC激酶抑制劑，與單用apocynin組相比，其上述保護(hù)作用則減弱。結(jié)論 抑制NADPH氧化酶能夠減輕腦缺血／再灌注損傷，并且能增高Cx36、PKC的蛋白表達(dá)，降低Bax與Bcl-2的比值。

關(guān)鍵詞：腦缺血／再灌注損傷；NADPH氧化酶；apocynin；Cx36；PKC；凋亡

網(wǎng)絡(luò)出版時(shí)間：2015－7－22 10：42 網(wǎng)絡(luò)出版地址：http：／／www．cnki．net／kcms／detail／34．1086．R．20150727．0901．023．html

缺血性腦中風(fēng)是一種發(fā)病率和死亡率都較高的腦血管病，闡明其發(fā)病機(jī)制、探索有效的防治措施一直是研究的熱點(diǎn)。由活性氧（reactive oxygen spe-cies，ROS）引起的氧化應(yīng)激是腦缺血／再灌注（ische-mia reperfusion，I／R）損傷發(fā)生的重要機(jī)制之一。以往多數(shù)研究采用自由基清除劑或者天然抗氧化劑來減輕氧化損傷，但并不能產(chǎn)生理想的效果，近來越來越多的研究者關(guān)注ROS的來源。有報(bào)道表明，在腦缺血時(shí)ROS主要由黃嘌呤氧化酶產(chǎn)生，恢復(fù)血流再灌注時(shí)ROS則主要是由還原型煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸（nicotinamide adenine dinucleotide phos- phate，NADPH）氧化酶產(chǎn)生［1］。因此，NADPH氧化酶成為研究如何減輕腦I／R損傷的熱點(diǎn)。有報(bào)道表明，抑制NADPH氧化酶能夠減輕腦I／R損傷，但具體的作用機(jī)制尚不明確［2］。

神經(jīng)元是腦I／R損傷過程中最為敏感的細(xì)胞，它對(duì)I／R耐受性低。研究發(fā)現(xiàn)，腦I／R過程中往往伴隨著神經(jīng)元縫隙連接蛋白Cx36的蛋白表達(dá)異常［3］。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，蛋白激酶C（protein kinase C，PKC）可以磷酸化Cx36蛋白的特殊位點(diǎn)，從而改變縫隙連接通道的耦合［4］。有報(bào)道表明，改變Cx36的蛋白表達(dá)以及神經(jīng)元縫隙連接通道的耦合能夠明顯減輕腦I／R損傷［3］。但是尚未有報(bào)道表明，抑制NADPH氧化酶對(duì)腦I／R損傷的保護(hù)作用是否與PKC激酶和Cx36蛋白表達(dá)有關(guān)。研究表明腦I／R過程中往往伴隨著ROS生成增加，ROS的過度釋放能夠調(diào)控Bcl-2家族參與細(xì)胞凋亡［5－6］。抑制NADPH氧化酶能夠減少ROS的生成，那么，抑制NADPH氧化酶對(duì)腦I／R損傷的保護(hù)作用是否與調(diào)控Bcl-2家族參與凋亡有關(guān)？本文探討抑制NAD-PH氧化酶保護(hù)腦I／R損傷的可能機(jī)制。

1　材料與方法

1．1材料

1．1．1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 SPF級(jí)♂SD大鼠52只，體質(zhì)量（300±20）g，安徽醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供［動(dòng)物許可證號(hào)：SCXK（皖）2011－002］。

1．1．2主要試劑 Apocynin和Cx36單克隆抗體購于Sigma公司；PKC單克隆抗體購于Abcam公司；Bax、Bcl-2單克隆抗體購自BOSTER公司；TTC（2，3，5，-氯三苯基四氮唑）、β-actin單克隆抗體、山羊抗小鼠IgG二抗、山羊抗兔IgG二抗均購于Sigma公司；其他試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純級(jí)。

1．2實(shí)驗(yàn)方法

1．2．1實(shí)驗(yàn)分組 將52只大鼠隨機(jī)分為4組：假手術(shù)組（sham組）、I／R組、I／R＋apocynin組（I／R＋Apo組）、I／R＋apocynin＋PKC抑制劑GF109203X組（I／R＋Apo＋GF組），每組13只。

1．2．2模型制作 大鼠稱重，腹腔注射水合氯醛3 mL·kg－1麻醉，頸部正中切口，分離并結(jié)扎右側(cè)頸總動(dòng)脈、頸外動(dòng)脈，在頸內(nèi)動(dòng)脈和頸外動(dòng)脈分叉約1 mm處做一小切口，將直徑0.32 mm的尼龍線插入頸總動(dòng)脈，再經(jīng)頸內(nèi)動(dòng)脈至大腦中動(dòng)脈，進(jìn)線約18 ～22 mm，栓塞大鼠大腦中動(dòng)脈，造成局灶性腦缺血。Sham組進(jìn)行上述操作，但不插入線栓阻斷大腦中動(dòng)脈血流。I／R組缺血2 h后，恢復(fù)腦血流再灌注24 h；I／R＋Apo組于缺血前15 min尾靜脈注射apocynin 2.5 mg·kg－1，其余操作同I／R組。I／R＋Apo＋GF組于缺血前15 min尾靜脈注射apocynin 2.5 mg·kg－1，并于缺血15 min后尾靜脈注射PKC抑制劑（GF109203X）80 μg·kg－1，其余操作同I／R組。

1．2．3神經(jīng)行為學(xué)評(píng)估 根據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道的神經(jīng)行為功能損傷的評(píng)分方法［7］，對(duì)缺血2 h再灌注24 h后的大鼠進(jìn)行神經(jīng)功能評(píng)分（每組13只）。0分：無神經(jīng)功能缺失癥狀，活動(dòng)正常；1分：提尾時(shí)手術(shù)對(duì)側(cè)的前肢內(nèi)收，不能完全伸直；2分：行走時(shí)向手術(shù)對(duì)側(cè)旋轉(zhuǎn)；3分：行走時(shí)向手術(shù)對(duì)側(cè)傾倒，行動(dòng)不便；4分：不能自己行走或處于昏迷狀態(tài)。神經(jīng)行為評(píng)分≥1分為成功模型，評(píng)分采用雙盲法，由未參與實(shí)驗(yàn)分組的成員完成。

1．2．4腦梗死體積測(cè)定 大鼠缺血2 h，再灌注24 h后快速斷頭取腦（每組6只），將大腦置于－20℃冰箱10 min。自額極2 mm向后連續(xù)等距切取6張冠狀腦片，間距為2 mm。2%TTC避光染色30 min （37℃），正常腦組織染為紅色，腦梗死組織染為白色。將染色好的腦片放置于4%多聚甲醛溶液中固定保存24 h，逐層拍照。拍照后用Image J軟件測(cè)量腦片相應(yīng)部位面積，計(jì)算腦梗死體積百分率。計(jì)算公式：腦梗死體積百分率／%＝［對(duì)側(cè)大腦皮質(zhì)的面積－（同側(cè)大腦皮質(zhì)的面積－腦梗死的面積）］／對(duì)側(cè)大腦皮質(zhì)的面積×100%［8］。

1．2．5HE染色法觀察腦組織病理形態(tài)學(xué)變化將腦缺血2 h，再灌注24 h后的大鼠斷頭取腦（每組3只），將腦組織進(jìn)行甲醛固定、石蠟包埋，冠狀位切片，片厚5 μm，HE染色，封片，光學(xué)顯微鏡下觀察腦組織形態(tài)學(xué)變化，采集圖像。

1．2．6Western blot檢測(cè)蛋白表達(dá)變化 將腦缺血2 h，再灌注24 h后的大鼠斷頭取腦（每組4只），夾取右側(cè)大腦腦組織，提取蛋白，進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)蛋白定量。于100℃加熱5 min，每孔取20 μg蛋白樣品經(jīng)15% SDS-PAGE凝膠電泳分離后，以濕轉(zhuǎn)法電轉(zhuǎn)移至聚偏二氟乙烯（polyvinylidene fluoride，PVDF）膜上，用新鮮配制的含5%脫脂奶粉的磷酸鹽緩沖液封閉2 h，洗膜，與Cx36（1.25 mg·L－1）、PKC（1∶1 000）、Bax（1∶2 000）、Bcl-2（1∶2 000）單克隆抗體共同孵育，4℃過夜，洗滌后山羊抗兔抗體（1∶5 000）搖床上室溫孵育2 h，β-actin（1∶4 000）單克隆抗體室溫孵育2 h即可，其二抗為山羊抗鼠抗體（1∶1 000）。二抗孵育完畢后，洗膜，將膜與曝光液充分接觸。1 min后將膜放入凝膠圖像分析系統(tǒng)進(jìn)行拍照。曝光時(shí)間調(diào)整在5～10 min之間。采用Bio Imaging sys-tem（Gene Genius）對(duì)圖像進(jìn)行灰度掃描分析。

1．3統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 采用SPSS 13．0軟件分析實(shí)驗(yàn)結(jié)果，數(shù)據(jù)資料以±s表示，計(jì)量資料比較進(jìn)行單因素ANOVA分析，統(tǒng)計(jì)圖采用Sigma Plot 10．0繪制。

2　結(jié)果

2．1抑制NADPH氧化酶對(duì)腦I／R損傷大鼠的神經(jīng)行為學(xué)評(píng)分的影響 腦I／R后，除sham組大鼠無神經(jīng)功能缺失癥狀，其他各組大鼠都有不同程度的神經(jīng)功能障礙。與sham組相比，I／R組大鼠神經(jīng)行為學(xué)評(píng)分明顯增高（P＜0.05）。與I／R組相比，I／R ＋Apo組大鼠的神經(jīng)行為學(xué)評(píng)分明顯降低（P＜0.01）。與I／R＋Apo組相比，I／R＋Apo＋GF組大鼠的神經(jīng)行為學(xué)評(píng)分則明顯增高（P＜0.01）（Tab 1）。

Tab 1 Effect of inhibition of NADPH oxidase on neurobehavioral scores of rats with focal cerebral I／R injury（±s，n＝13）

Tab 1 Effect of inhibition of NADPH oxidase on neurobehavioral scores of rats with focal cerebral I／R injury（±s，n＝13）

**P＜0.01 vs I／R group；＃＃P＜0．01 vs I／R＋Apo group

Score Group　0　1　2　3　4　±s Sham　13　0　0　0　0　0 I／R　0　0　3　9　1　2．84±0．55 I／R＋Apo　0　8　4　1　0　1．46±0．66**I／R＋Apo＋GF　0　3　6　4　0　2．08±0．75＃＃

2．2抑制NADPH氧化酶對(duì)腦I／R損傷大鼠的腦梗死體積的影響 如Fig 1A結(jié)果顯示，TTC染色后，大鼠大腦腦梗死區(qū)域呈白色，非梗死區(qū)域呈紅色。梗死灶主要位于缺血側(cè)大腦皮質(zhì)、基底節(jié)和海馬區(qū)域。用Image J軟件測(cè)量腦片相應(yīng)部位面積，計(jì)算腦梗死體積百分率。Sham組大鼠大腦無明顯梗死，I／R組大鼠腦梗死明顯，腦梗死體積百分率最高。與I／R組相比，I／R＋Apo組大鼠大腦梗死體積明顯減少，腦梗死體積百分率明顯降低（P＜0.05）。與I／R＋Apo組相比，I／R＋Apo＋GF組大鼠腦梗死體積百分率明顯增加（P＜0.05）（Fig 1B）。

2．3抑制NADPH氧化酶對(duì)腦I／R損傷大鼠腦組織病理形態(tài)學(xué)變化的影響 采用HE染色法觀察大鼠腦組織病理形態(tài)學(xué)的變化。如Fig 2所示，sham組大鼠腦組織中細(xì)胞排列整齊、均勻，細(xì)胞核圓形，細(xì)胞層次清晰；與sham組相比，I／R組大鼠腦組織中細(xì)胞的細(xì)胞核明顯固縮，細(xì)胞層次混亂；與I／R組相比，I／R＋Apo組大鼠腦組織中細(xì)胞的細(xì)胞核固縮有所減輕，細(xì)胞層次清晰；與I／R＋Apo組相比，I／R＋Apo＋GF組大鼠腦組織病理形態(tài)學(xué)損傷明顯增強(qiáng)。

Fig 1 Effect of inhibition of NADPH oxidase on the brain infarct volume of rats with cerebral I／R injury detected by TTC staining（±s，n＝6）

Fig 2 Effect of inhibition of NADPH oxidase on the pathological morphological changes of rats with cerebral I／R injury observed by HE staining

2．4抑制NADPH氧化酶對(duì)腦I／R損傷大鼠腦組織中Cx36、PKC、Bax、Bcl-2蛋白表達(dá)的影響 采用Western blot檢測(cè)Cx36、PKC以及凋亡相關(guān)蛋白Bax、Bcl-2的蛋白表達(dá)變化。與sham組相比，I／R組大鼠的Cx36、PKC蛋白表達(dá)明顯降低（P＜0.05），但是Bax／Bcl-2的比值明顯增高（P＜0.05）。與I／R組相比，I／R＋Apo組大鼠的Cx36、PKC蛋白表達(dá)明顯增高（P＜0.05），Bax／Bcl-2的比值則明顯降低（P＜0.05）。與I／R＋Apo組相比，I／R＋Apo＋GF組大鼠的Cx36、PKC蛋白表達(dá)明顯降低（P＜0.05），但是Bax／Bcl-2的比值明顯增高（P＜0.05）（Fig 3、4）。

Fig 3 Effect of inhibition of NADPH oxidase on the expression of Cx36 and PKC of rats with cerebral I／R injury detected by Western blot（±s，n＝4）

Fig 4 Effect of inhibition of NADPH oxidase on the expression of Bax and Bcl-2 protein of rats with cerebral I／R injury detected by Western blot（±s，n＝4）

3　討論

NADPH氧化酶廣泛分布于大腦神經(jīng)元細(xì)胞、星形膠質(zhì)細(xì)胞、血管內(nèi)皮細(xì)胞以及小膠質(zhì)細(xì)胞，是腦缺血后，恢復(fù)血液再灌注時(shí)ROS最重要的來源。研究發(fā)現(xiàn)，使用NADPH氧化酶抑制劑或敲除NADPH氧化酶的基因可以明顯減輕氧化損傷［9－10］，表明NADPH氧化酶在保護(hù)腦I／R損傷方面具有重要意義。Apocynin又叫夾竹桃麻素、羅布麻寧、香莢蘭乙酮，是傳統(tǒng)中醫(yī)中的一種天然化合物。研究發(fā)現(xiàn)apocynin可以通過阻止p47 phox與NOX 2的組裝從而抑制NADPH氧化酶的活化［11］。已有報(bào)道表明，apocynin能夠減少大鼠腦梗死體積、神經(jīng)功能缺陷以及細(xì)胞凋亡率，從而減輕腦I／R損傷，但具體的作用機(jī)制尚不明確［12］。

Cx36是縫隙連接蛋白家族的新成員，主要分布在腦組織以及視網(wǎng)膜。由Cx36組成的縫隙連接是最為常見的神經(jīng)元細(xì)胞間偶聯(lián)形式，是神經(jīng)元電信號(hào)傳導(dǎo)所必需的，而Cx36是唯一一個(gè)在神經(jīng)系統(tǒng)中優(yōu)先表達(dá)的縫隙連接蛋白，因此成為研究神經(jīng)元縫隙連接功能改變的熱點(diǎn)［13］。PKC激酶屬于多功能絲氨酸／蘇氨酸激酶，廣泛調(diào)節(jié)各細(xì)胞的生理功能。有報(bào)道發(fā)現(xiàn)，PKC可以磷酸化Cx36蛋白的特殊位點(diǎn)，從而改變縫隙連接通道的耦合［4］。研究表明神經(jīng)元之間的電耦合很少是靜態(tài)的，動(dòng)態(tài)變化的程度往往反映在蛋白表達(dá)水平的變化上［14］。有報(bào)道表明，在腦I／R過程中往往伴隨著Cx36蛋白表達(dá)以及神經(jīng)元縫隙連接功能異常，而改變Cx36蛋白表達(dá)以及神經(jīng)元縫隙連接通道的耦合能夠明顯減輕腦I／R損傷［3］。在心臟以及腎臟組織中主要表達(dá)Cx43蛋白，而Src激酶可以使Cx43蛋白磷酸化或直接與Cx43蛋白相結(jié)合［15－16］。有報(bào)道表明，NADPH氧化酶的活化可以通過Src激酶下調(diào)Cx43蛋白表達(dá)造成心肌損傷［15］。在腎病的動(dòng)物模型中發(fā)現(xiàn)NADPH氧化酶的活化可以通過Src激酶上調(diào)Cx43蛋白表達(dá)，造成足細(xì)胞損傷［16］。但是尚未見報(bào)道表明在腦I／R過程中，NADPH氧化酶與PKC激酶和神經(jīng)元縫隙連接蛋白Cx36之間的關(guān)系。

本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，抑制NADPH氧化酶能夠減少大鼠神經(jīng)行為學(xué)評(píng)分，降低腦梗死百分率以及減輕腦組織病理形態(tài)損傷，從而減輕腦I／R損傷。為了探討其可能的作用機(jī)制，我們采用Western blot檢測(cè)Cx36、PKC蛋白表達(dá)變化。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，與I／R組相比，使用NADPH氧化酶抑制劑apocynin后，明顯增加大鼠Cx36、PKC的蛋白表達(dá)。在使用apo-cynin的基礎(chǔ)上加用PKC抑制劑GF109203X，與單用apocynin相比，Cx36、PKC的蛋白表達(dá)明顯降低。結(jié)果表明，抑制NADPH氧化酶減輕腦I／R損傷可能與增高Cx36、PKC的蛋白表達(dá)有關(guān)。

腦I／R過程中，ROS生成明顯增加，ROS的過度釋放可以調(diào)控Bcl-2家族參與細(xì)胞凋亡［5－6］。Bcl-2家族能夠調(diào)控線粒體膜通透性，在細(xì)胞的固有凋亡通路中有重要作用，被稱為線粒體途徑。腦缺血或缺氧后，線粒體膜蛋白的表達(dá)增加，促凋亡蛋白Bax從細(xì)胞質(zhì)中進(jìn)入線粒體，促進(jìn)細(xì)胞色素C的釋放。細(xì)胞色素C可以和caspase-9前體的功能前區(qū)相互作用，導(dǎo)致caspase-3激活，并進(jìn)一步激活下游的caspases［17］（包括caspases-2、6、8、10），誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。抑凋亡蛋白Bcl-2位于線粒體壁，能夠抑制細(xì)胞色素C的釋放［17］。目前，許多學(xué)者用Bax／Bcl-2的比值作為判定細(xì)胞凋亡是否被抑制或促進(jìn)的重要標(biāo)志［18］。Western blot結(jié)果顯示，使用NADPH氧化酶抑制劑apocynin后，與I／R組相比，能夠降低Bax／Bcl-2的比值。在使用apocynin的基礎(chǔ)上使用PKC抑制劑，與I／R＋Apo相比，Bax／Bcl-2的比值則明顯增高。

綜上所述，抑制NADPH氧化酶能夠減輕腦I／R損傷，并且能增高Cx36、PKC的蛋白表達(dá)，降低Bax與Bcl-2的比值。

參考文獻(xiàn)：

［1］ Abramor A Y，Scorziello A，Duchen M R，et al．Three distinct mechanisms generate oxygen free radicals in neurons and contrib-ute to cell death during anoxia and reoxygenation［J］．J Neurosci，2007，27（5）：1129－38．

［2］ 張朝弘，劉丹彥．NADPH氧化酶與腦缺血／再灌注損傷［J］．國(guó)際病理科學(xué)與臨床雜志，2013，33（3）：246－50．

［2］ Zhang Z H，Liu D Y．NADPH oxidase and cerebral ischemia／reperfusion injury［J］．Int J Pathol Clin Med，2013，33（3）：246 －50．

［3］ Belousov A B，F(xiàn)ontes J D．Neuronal gap junctions：making and breaking connections during development and injury［J］．Cell，2013，36（4）：227－36．

［4］ Kothmann W W，Li X，Burr G S，et al．Connexin 35／36 is phos-phorylated at regulatory sites in the retina［J］．Vis Neurosci，2007，24（3）：363－75．

［5］ Sanderson T H，Reynolds C A，Kumar R，et al．Molecular mech-anisms of ischemia-reperfusion injury in brain：pivotal role of the mitochondrial membrane potential in reactive oxygen species gener-ation［J］．Mol Neurobiol，2013，47（1）：9－23．

［6］ Li H，Wang L J，Qiu G F，et al．Apoptosis of HeLa cells induced by extract from Cremanthodium humile［J］．Food Chem Toxicol，2007，45（10）：2040－6．

［7］ 雷軍榮，秦 軍，張 晶，等．姜黃素對(duì)大鼠缺血性腦損傷炎癥反應(yīng)和血腦屏障通透性的影響［J］．中國(guó)藥理學(xué)通報(bào)，2010，26 （1）：120－3．

［7］ Lei J R，Qin J，Zhang J，et al．Effects of curcumin on inflamma-tory reaction and blood－brain barrier permeability in rats following cerebral ischemic injury［J］．Chin Pharmacol Bull，2010，26 （1）：120－3．

［8］ Zhang Y M，Xu H，Sun H，et al．Electroacupuncture treatment improves neurological function associated with regulation of tight junction proteins in rats with cerebral ischemia reperfusion injury ［J］．Evid Based Complement Alternat Med，2014，6（10）：1－10．

［9］ Liu W，Chen Q，Liu J，et al．Normobaric hyperoxia protects the blood brain barrier through inhibiting Nox2 containing NADPH oxi-dase in ischemic stroke［J］．Med Gas Res，2011，1（1）：22．

［10］Shen J，Bai X Y，Qin Y，et al．Interrupted reperfusion reduces the activation of NADPH oxidase after cerebral I／R injury［J］．Free Radical Bio Med，2011，50（12）：1780－6．

［11］Stefanska J，Pawliczak R．Apocynin：molecular aptitudes［J］．Mediators Inflamm，2008，2008：106507．

［12］Pamenter M E，Ali S S，Tang Q，et al．An in vitro ischemic pe-numbral mimic perfusate increases NADPH oxidase-mediated su-peroxide production in cultured hippocampal neurons［J］．Brain Res，2012，1452（2）：165－72．

［13］Palacios-Prado N，Hoge G，Marandykina A，et al．Intracellular magnesium-dependent modulation of gap junction channels formed by neuronal Connexin36［J］．J Neurosci，2013，33（11）：4741－53．

［14］Patel L S，Mitchell C K，Dubinsky W P，et al．Regulation of gap junction coupling through the neuronal connexin Cx35 by nitric ox-ide and cGMP［J］．Cell Commun Adhes，2006，13（1－2）：41－54．

［15］Sovari A A，Rutledge C A，Jeong E M，et al．Mitochondria oxida-tive stress，Connexin43 remodeling，and sudden arrhythmic death ［J］．Circ Arrhythm Eletrophysiol，2013，6（3）：623－31．

［16］Yan Q．NADPH oxidase-mediated upregulation of connexin43 con-tributes to podocyte injury［J］．Free Radic Biol Med，2012，53 （6）：1286－9．

［17］Kroemer G．Mitochondrial control of apoptosis：an introduction ［J］．Biochem Biophys Res Commun，2003，304（3）：433－5．

［18］Huang X，Cho J K，Park S R，et al．GM-CSF inhibits apoptosis of neural cells via regulating the expression of apoptosis related proteins［J］．Neurosci Res，2007，58（1）：50－7．

Protective effect of NADPH oxidase against cerebral ischemia／reperfusion injury

YU Li，TONG Xu-hui，F(xiàn)AN Zong-bing，CHEN Yin-ling，LI Yan，DONG Shu-ying
（Dept of Pharmacology，Bengbu Medical College，Bengbu Anhui 233030，China）

Abstract：Aim To determine the protective effect of NADPH oxidase against focal cerebral ischemia／reper-fusion（I／R）injury in rats．Method A thread occlu-sion method was used to make a middle cerebral artery occlusion（MCAO）model．Apocynin（2.5 mg· kg－1）was injected by tail vein 15 min before ischemi-a．Then，the neurological behavior，cerebral infarction volume，pathological morphological changes and the expression of Cx36，PKC，Bax，Bcl-2 of rats were de- tected after ischemia for 2 h，followed by reperfusion for 24 h．Results Compared with cerebral I／R group，administration of apocynin significantly reduced the neurological behavior scores and the cerebral in-farction volume percentage，alleviated the pathological morphological damage，increased the protein expres-sion of Cx36 and PKC，and reduced the Bax／Bcl-2 ra-tio of rats with focal cerebral I／R injury．Compared with apocynin group，apocynin combined with PKCbook=1131,ebook=100inhibitor significantly reduced above protective effects．Conclusion Inhibition of NADPH oxidase could alle-viate cerebral I／R injury，increase the levels of Cx36，PKC proteins and reduce the Bax／Bcl-2 ratio．

Key words：cerebral ischemia／reperfusion injury；NADPH oxidase；apocynin；Cx36；PKC；apoptosis

作者簡(jiǎn)介：于 麗（1990－），女，碩士生，研究方向：心腦血管藥理學(xué)，E-mail：strongpao＠163．com；董淑英（1974－），女，博士，教授，研究方向：心腦血管藥理學(xué)，通訊作者，E-mail：bbmcdsy＠126．com

基金項(xiàng)目：國(guó)家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目（No 81402930）；安徽省自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目（No 1408085MH176）

收稿日期：2015－05－22，修回日期：2015－06－24

文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A

文章編號(hào)：1001－1978（2015）08－1126－06

doi：10．3969／j．issn．1001－1978．2015．08．020