離心運(yùn)動(dòng)誘導(dǎo)大鼠骨骼肌損傷中絲氨酸蛋白酶Omi的表達(dá)升高

趙曉琴，孫君志，白勝超，李俊平，周 越，王瑞元

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離心運(yùn)動(dòng)誘導(dǎo)大鼠骨骼肌損傷中絲氨酸蛋白酶Omi的表達(dá)升高

趙曉琴1，孫君志2，白勝超3，李俊平3，周 越3，王瑞元3

目的：旨在觀察離心運(yùn)動(dòng)致骨骼肌損傷后絲氨酸蛋白酶（Omi）在骨骼肌組織中的表達(dá)變化。方法：8周齡雄性SD大鼠36只，隨機(jī)分為安靜對(duì)照（n=6）、離心運(yùn)動(dòng)2大組（n=30），離心運(yùn)動(dòng)組大鼠在跑臺(tái)上進(jìn)行一次性離心運(yùn)動(dòng)，分別于運(yùn)動(dòng)后即刻（E0組，n=6）、運(yùn)動(dòng)后12 h（E12組，n=6）、運(yùn)動(dòng)后24 h（E24組，n=6）、運(yùn)動(dòng)后48 h（E48組，n=6）和運(yùn)動(dòng)后72 h（E72組，n=6）麻醉大鼠，腹主動(dòng)脈取血，取比目魚肌待測(cè)；使用熒光酶聯(lián)免疫吸附法檢測(cè)半胱氨酸天冬氨酸特異性蛋白酶-3（Caspase-3）的活性；Western Blot和Realtime-PCR法分別檢測(cè)Omi、凋亡抑制蛋白（XIAP）的蛋白表達(dá)和基因水平；Co-IP法檢測(cè)XIAP和Omi的相互結(jié)合作用。結(jié)果：與對(duì)照組相比，離心運(yùn)動(dòng)后Caspase-3、Caspase-9活性均明顯升高；離心運(yùn)動(dòng)后Omi、XIAP的蛋白表達(dá)和mRNA水平均明顯升高；離心運(yùn)動(dòng)能明顯增加X(jué)IAP和Omi的結(jié)合量。結(jié)論：離心運(yùn)動(dòng)能夠激活骨骼肌組織Caspase-9和Caspase-3的活性，誘導(dǎo)Omi和XIAP的表達(dá)上調(diào)，促進(jìn)XIAP與Omi相互結(jié)合，Omi可能在促使凋亡過(guò)程中發(fā)揮重要介導(dǎo)作用。

離心運(yùn)動(dòng)；骨骼??；細(xì)胞凋亡；Omi；XIAP

運(yùn)動(dòng)性骨骼肌損傷一直以來(lái)都是運(yùn)動(dòng)醫(yī)學(xué)和運(yùn)動(dòng)生理學(xué)研究的重點(diǎn)課題。在運(yùn)動(dòng)性骨骼肌損傷中，離心收縮較等長(zhǎng)收縮引起的損傷更為嚴(yán)重。前期研究發(fā)現(xiàn)[1-2]，離心運(yùn)動(dòng)可以導(dǎo)致骨骼肌線粒體形態(tài)結(jié)構(gòu)異常，細(xì)胞色素c和Smac蛋白表達(dá)顯著上調(diào)，Caspase-3活性顯著升高，同時(shí)啟動(dòng)線粒體凋亡程序。線粒體途徑導(dǎo)致細(xì)胞凋亡的關(guān)鍵所在是由于其各種促凋亡蛋白的釋放[3]。絲氨酸蛋白酶Omi是新發(fā)現(xiàn)的一種線粒體促凋亡蛋白，在組織器官中普遍表達(dá)[4]。正常生理情況下，Omi存在于線粒體膜間隙中，只有應(yīng)激刺激使線粒體膜通透性增加時(shí)，Omi才會(huì)被釋放入胞漿并發(fā)揮其包括促凋亡在內(nèi)的生物介導(dǎo)作用。

運(yùn)動(dòng)性骨骼肌損傷時(shí)，會(huì)伴有大量線粒體促凋亡蛋白釋放入胞漿，與細(xì)胞色素c和Smac類似，推測(cè)Omi作為作用較強(qiáng)的線粒體促凋亡蛋白，可能參與了運(yùn)動(dòng)性骨骼肌損傷的發(fā)生發(fā)展。因此，本研究通過(guò)建立大鼠運(yùn)動(dòng)性骨骼肌損傷模型，探討運(yùn)動(dòng)對(duì)骨骼肌細(xì)胞凋亡程度及凋亡途徑的影響，并以線粒體促凋亡蛋白Omi為切入點(diǎn)，觀察運(yùn)動(dòng)后骨骼肌組織中Omi的表達(dá)變化，并對(duì)Omi-XIAP-Caspases通路進(jìn)行分析，同時(shí)探究其在運(yùn)動(dòng)性骨骼肌損傷的作用。

1 材料與方法

1.1 主要試劑和儀器

Ac-DEVD-AFC底物（#ALX-260-032）、Ac-LEHD-AFC底物（#ALX-260-116）和AFC標(biāo)準(zhǔn)品（#BΜL-K108-0001）均購(gòu)自BIOΜOL公司；小鼠抗Omi抗體（#sc-271528）購(gòu)自Santa Cruz公司；兔抗XIAP抗體（#2042）購(gòu)自Cell Signaling公司；HRP標(biāo)記山羊抗小鼠IgG（#ZB-2305）和HRP標(biāo)記山羊抗兔IgG（#ZB-2301）均購(gòu)自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司；RNAisoTΜPlus（#D9108A）、SYBR Premix Ex TaqTΜII（#DRR081A）、PrimeScriptTΜRT reagent Kit（#RR037A）、Omi引物和XIAP引物均購(gòu)自TaKaRa公司。

EnSpireII2 300 Μultilabel酶標(biāo)儀，Reader Perkin Elmer公司；BIO-RAD電泳儀和ChemiDocTΜXRS凝膠成像，美國(guó)BIO-RAD公司；7 500 Real Time PCR儀，美國(guó)Life Technologies公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

8 周齡健康雄性SD大鼠36只，體重為（199.27±6.85）g，SPF/ VAF級(jí)，許可證編號(hào)：SCXK（京）2009-0007，由中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院藥用植物研究所動(dòng)物中心提供。6只/籠飼養(yǎng)，自由飲食、飲水，室溫（22±2）℃，相對(duì)濕度30%～60%，12 h光照/12 h黑暗模擬晝夜交替。大鼠適應(yīng)性飼養(yǎng)3天后，進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.3 實(shí)驗(yàn)分組及運(yùn)動(dòng)方案

大鼠隨機(jī)分為2大組：對(duì)照組（C組，n=6）和離心運(yùn)動(dòng)組（E組，n=30）。離心運(yùn)動(dòng)組大鼠按照運(yùn)動(dòng)后的不同時(shí)間，又被隨機(jī)分為運(yùn)動(dòng)后即刻組（E0組，n=6）、運(yùn)動(dòng)后12 h組（E12組，n=6）、運(yùn)動(dòng)后24 h組（E24組，n=6）、運(yùn)動(dòng)后48 h組（E48組，n=6）和運(yùn)動(dòng)后72 h組（E72組，n=6）。

在正式實(shí)驗(yàn)前，運(yùn)動(dòng)組大鼠進(jìn)行3天速度為16 m/min的適應(yīng)性跑臺(tái)運(yùn)動(dòng)。第1天進(jìn)行5 min的跑臺(tái)運(yùn)動(dòng)，坡度0°；第2天進(jìn)行10 min的跑臺(tái)運(yùn)動(dòng)，坡度0°；第3天休息；第4天進(jìn)行90 min的正式實(shí)驗(yàn)，坡度-16°。

1.4 標(biāo)本收集

于上述不同時(shí)間點(diǎn)分批麻醉大鼠，腹主動(dòng)脈取血，迅速分離比目魚肌，去除兩側(cè)肌腱和結(jié)締組織。取材過(guò)程中，盡量避免牽拉肌肉。將分離好的比目魚肌小心裝入凍存管后，立即投入液氮速凍，之后再移至-80℃冰箱待測(cè)。

1.5 大鼠骨骼肌Caspase-3和Caspase-9的檢測(cè)

測(cè)定Caspase-3和Caspase-9活性可以反應(yīng)骨骼肌細(xì)胞凋亡發(fā)生的程度以及線粒體凋亡途徑[5]?；静襟E如下：將骨骼肌按1∶10加入裂解液，于冰上剪碎，勻漿，14 000 rpm，4oC離心后取上清液。在黑色避光酶標(biāo)板中分別加入上清30 μL，2×Reaction buffer 50 μL，雙蒸水10 μL，底物，混勻。置于熒光酶標(biāo)儀中連續(xù)檢測(cè)其光密度值，參數(shù)為405 nm，37oC，1.5 h。Caspases活性結(jié)果用單位時(shí)間內(nèi)骨骼肌組織蛋白分解底物產(chǎn)生AFC的速度表示，計(jì)算公式為[AFC（1.5 h）-AFC（0 h）]/蛋白濃度/1.5 h，單位為nmol/h/mg。其中，Caspase-3和Caspase-9的底物分別是Ac-DEVD-AFC和Ac-LEHD-AFC。

1.6 大鼠骨骼肌Omi和XIAP蛋白表達(dá)檢測(cè)

常規(guī)提取并測(cè)定骨骼肌組織蛋白濃度后，調(diào)整樣品體積為20 μL/孔，蛋白濃度為3 μg/μL。SDS-PAGE凝膠電泳分離蛋白（10%分離膠和4%濃縮膠），將蛋白采用濕轉(zhuǎn)法轉(zhuǎn)至PVDF膜上（恒流300 mA，90 min），常規(guī)經(jīng)封閉、一抗（Omi：1∶100；XIAP：1∶1 000）、二抗孵育后，加化學(xué)發(fā)光液，之后通過(guò)凝膠成像系統(tǒng)顯像，采用Gel-pro軟件分析條帶密度。

1.7 大鼠骨骼肌Omi和XIAP mRNA水平檢測(cè)[6]

將骨骼肌組織加入RNAisoTΜPlus裂解液提取RNA，合成cDNA使用PrimeScriptTΜRT reagent試劑盒，參數(shù)為37oC15 min，85oC5 s。SYBR Premix Ex TaqTΜⅡ試劑檢測(cè)Real-time PCR，在7 500 Real Time PCR儀上進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄，參數(shù)如下。預(yù)變性：95oC30 s；PCR反應(yīng)：95oC5 s，60oC32 s，30 cycle；熔解曲線參數(shù)：95oC15s，60oC1min，95oC15s，60oC15s（Omi：NΜ_001106599.2，GAPDH：NΜ_017008.3），2-△△Ct法進(jìn)行相對(duì)定量分析。

1.8 大鼠骨骼肌XIAP和Omi相互結(jié)合量檢測(cè)

將裂解的骨骼肌組織以14 000 rpm離心15 min，提取上清，以一個(gè)樣本為例，在500 μg蛋白樣品中，加入1 μg的mouse IgG及20 μL的Agarose A/G，4oC搖轉(zhuǎn)儀上反應(yīng)30 min去除非特異性結(jié)合。1 000 rpm 4oC離心5 min，取上清，加入Omi抗體2 μg/ 500 μg蛋白，于4oC搖轉(zhuǎn)儀孵育過(guò)夜。1 000 rpm 4oC離心5 min，棄上清，再用裂解液洗滌beads，4oC離心棄上清，重復(fù)3次。洗滌后，再次加入2×loading buffer 15 μL，95℃5 min。12 000 rpm離心5 min，取上清進(jìn)行Western Blot實(shí)驗(yàn)。本研究用免疫共沉淀方法檢測(cè)XIAP與Omi的相互結(jié)合。

1.9 統(tǒng)計(jì)方法

數(shù)據(jù)分析用SPSS18.0軟件，結(jié)果以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示，采用單因素方差（One-way ANOVA）分析實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)，結(jié)果均以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 骨骼肌細(xì)胞凋亡情況

Caspases活化是普遍公認(rèn)的細(xì)胞凋亡的生化學(xué)特征之一。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，大鼠骨骼肌組織Caspase-3活性與C組相比，在運(yùn)動(dòng)后即刻、12 h、24 h、48 h顯著升高，且運(yùn)動(dòng)后12 h達(dá)到最高峰，驗(yàn)證了離心運(yùn)動(dòng)可以誘發(fā)骨骼肌細(xì)胞凋亡（見(jiàn)圖1）。

圖1 大鼠骨骼肌組織Caspase-3活性變化Figure1 Changes of Caspase-3 activity in skeletal tissue

2.2 骨骼肌線粒體凋亡途徑

Caspase-9的活性結(jié)果顯示，大鼠骨骼肌組織Caspase-9活性與C組相比，在運(yùn)動(dòng)后即刻即有升高趨勢(shì)但無(wú)顯著差異，運(yùn)動(dòng)后12 h、24 h、48 h顯著升高，72 h已恢復(fù)至C組水平，且在運(yùn)動(dòng)后12 h達(dá)到最高峰（見(jiàn)圖2）。提示，線粒體凋亡途經(jīng)參與了骨骼肌的細(xì)胞凋亡。

圖2 大鼠骨骼肌Caspase-9活性變化Figure2 Changes of Caspase-9 activity in skeletal tissue

2.3 骨骼肌組織Omi的蛋白表達(dá)和mRNA水平變化

用Western blot和Realtime-PCR方法分別檢測(cè)正常和運(yùn)動(dòng)組大鼠骨骼肌組織Omi的蛋白表達(dá)和mRNA水平。結(jié)果顯示，與C組相比，Omi的蛋白表達(dá)和mRNA水平運(yùn)動(dòng)后即刻至48 h顯著升高，且均在12 h達(dá)到最高峰（見(jiàn)圖3、圖4）。提示，離心運(yùn)動(dòng)可以誘導(dǎo)骨骼肌組織Omi蛋白表達(dá)和基因水平上調(diào)。

圖3 大鼠骨骼肌組織Omi蛋白表達(dá)變化Figure3 Changes of Omi protein in skeletal tissue

圖4 大鼠骨骼肌組織Omi mRNA水平變化Figure4 Changes of Omi mRNA in skeletal tissue

2.4 骨骼肌組織XIAP的蛋白表達(dá)和mRNA水平變化

大鼠骨骼肌組織XIAP的檢測(cè)結(jié)果顯示，與C組相比，運(yùn)動(dòng)后即刻至72 h全程XIAP的蛋白表達(dá)顯著升高，并在48 h達(dá)到最高峰（見(jiàn)圖5）。提示，離心運(yùn)動(dòng)可以誘導(dǎo)骨骼肌組織XIAP蛋白表達(dá)上調(diào)。與C組相比，運(yùn)動(dòng)后12 h、24 h和48 h，XIAP的mRNA水平顯著升高，也在24 h到達(dá)最高峰（見(jiàn)圖6）。提示，離心運(yùn)動(dòng)可以誘導(dǎo)骨骼肌組織XIAP基因水平上調(diào)。

圖5 大鼠骨骼肌組織XIAP蛋白表達(dá)變化Figure5 Changes of XIAP protein in skeletal tissue

圖6 大鼠骨骼肌組織XIAP mRNA水平變化Figure6 Changes of XIAP mRNA in skeletal tissue

2.5 骨骼肌組織XIAP和Omi結(jié)合量變化

用免疫共沉淀方法檢測(cè)大鼠骨骼肌組織XIAP和Omi的結(jié)合量變化。結(jié)果顯示，離心運(yùn)動(dòng)后各個(gè)時(shí)間點(diǎn)XIAP和Omi結(jié)合量均明顯高于C組，在運(yùn)動(dòng)后24 h達(dá)到最高峰（見(jiàn)圖7）。提示，離心運(yùn)動(dòng)可以使骨骼肌組織XIAP和Omi相互結(jié)合程度增加。

圖7 大鼠骨骼肌組織XIAP/Omi結(jié)合量變化Figure7 Changes of XIAP/Omi complex in skeletal tissue

3 討論

3.1 一次性離心運(yùn)動(dòng)后骨骼肌細(xì)胞凋亡的變化

在運(yùn)動(dòng)性骨骼肌損傷過(guò)程中，運(yùn)動(dòng)強(qiáng)度、運(yùn)動(dòng)形式及運(yùn)動(dòng)時(shí)間直接影響骨骼肌細(xì)胞凋亡的發(fā)生程度[7-9]，提示細(xì)胞凋亡可能在運(yùn)動(dòng)性骨骼肌損傷中起重要作用。盡管本文缺少肌肉凋亡的直接證據(jù)，但研究證實(shí)，離心運(yùn)動(dòng)可以導(dǎo)致骨骼肌凋亡[10]。前期研究發(fā)現(xiàn)[1-2]，一次性離心運(yùn)動(dòng)可以導(dǎo)致骨骼肌組織細(xì)胞色素c和Smac蛋白表達(dá)顯著上調(diào)，提示有細(xì)胞凋亡的發(fā)生。因此認(rèn)為，本研究的一次性離心運(yùn)動(dòng)誘導(dǎo)的骨骼肌損傷模型中，Caspase-3活化可以反映細(xì)胞凋亡發(fā)生的程度，Caspase-9活性反映骨骼肌線粒體凋亡途徑。本實(shí)驗(yàn)中，選擇離心運(yùn)動(dòng)最容易損傷的慢?。ū饶眶~?。┳鳛橛^察對(duì)象。結(jié)果顯示，大鼠一次性離心運(yùn)動(dòng)后骨骼肌組織Caspase-3活性在運(yùn)動(dòng)后即刻明顯升高，運(yùn)動(dòng)后12 h升至最高，此時(shí)Caspase-3活性高于安靜對(duì)照組68.7%，直至運(yùn)動(dòng)后72 h才趨于正常。提示，一次性離心運(yùn)動(dòng)后即刻可誘發(fā)骨骼肌細(xì)胞凋亡，且凋亡發(fā)生的程度具有時(shí)間依賴性，離心運(yùn)動(dòng)后12 h細(xì)胞凋亡的程度最為明顯，之后至運(yùn)動(dòng)后72 h凋亡的程度逐漸恢復(fù)。運(yùn)動(dòng)性骨骼肌損傷的又一誘因可能是細(xì)胞凋亡。

細(xì)胞凋亡的調(diào)控器是線粒體，其功能的正常發(fā)揮依賴于其膜結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定。前期研究顯示[1]，一次離心運(yùn)動(dòng)可以導(dǎo)致骨骼肌線粒體結(jié)構(gòu)發(fā)生病理性變化，顯著上調(diào)VDAC（線粒體通透性轉(zhuǎn)換孔的組成蛋白之一）的蛋白表達(dá)，同時(shí)能使Cyt c蛋白表達(dá)一過(guò)性升高。提示，離心運(yùn)動(dòng)可能通過(guò)線粒體途徑引起骨骼肌細(xì)胞凋亡。反應(yīng)線粒體凋亡途徑的結(jié)果顯示，Caspase-9在離心運(yùn)動(dòng)后也明顯升高，在運(yùn)動(dòng)后即刻即有升高趨勢(shì)，12 h明顯升至最高，之后呈進(jìn)行性下降。該結(jié)果提示，離心運(yùn)動(dòng)引起骨骼肌細(xì)胞凋亡可能有線粒體凋亡途徑的參與。

3.2 一次性離心運(yùn)動(dòng)對(duì)骨骼肌Omi表達(dá)的影響

絲氨酸蛋白酶Omi（又稱HtrA2）主要定位于真核生物線粒體中，隸屬于HtrA（High Temperature Requirement）家族。Omi被認(rèn)為是位于線粒體內(nèi)作用較強(qiáng)的促凋亡蛋白，在應(yīng)激時(shí)Omi被釋放入胞漿，發(fā)揮其依賴Caspases的促凋亡效應(yīng)[11]。但是，與其他線粒體促凋亡蛋白（如細(xì)胞色素C、Smac等）不同的是，Omi還能通過(guò)自身的絲氨酸蛋白酶活性，發(fā)揮非依賴Caspases的促凋亡效應(yīng)[12]。目前，有關(guān)Omi促進(jìn)細(xì)胞凋亡的研究大多在腫瘤[13-14]、心肌[5]、腦[15]組織，而在骨骼肌中鮮有報(bào)道。

本實(shí)驗(yàn)顯示，Omi蛋白表達(dá)在一次性離心運(yùn)動(dòng)后即刻明顯升高，12 h升至最高，之后至72 h逐漸恢復(fù)到安靜對(duì)照組水平。而大鼠骨骼肌組織Omi的mRNA水平結(jié)果顯示，離心運(yùn)動(dòng)后骨骼肌Omi mRNA水平與其蛋白表達(dá)趨勢(shì)相近。Omi mRNA水平在運(yùn)動(dòng)后即刻明顯升高，24 h達(dá)到最高峰，72 h已恢復(fù)到安靜對(duì)照水平。以上結(jié)果提示，Omi在運(yùn)動(dòng)后大鼠骨骼肌組織中的表達(dá)，在蛋白水平和翻譯水平均明顯升高，也具有時(shí)間依賴性。鑒于Omi的促凋亡作用，推測(cè)Omi參與了離心運(yùn)動(dòng)致骨骼肌細(xì)胞凋亡的病理生理過(guò)程，Omi在運(yùn)動(dòng)后早期可能起到促進(jìn)骨骼肌細(xì)胞凋亡的作用。同時(shí)發(fā)現(xiàn)，Omi的蛋白表達(dá)和mRNA水平趨勢(shì)存在一些差異，Omi的蛋白表達(dá)則在運(yùn)動(dòng)后12 h升至最高，而其mRNA水平在24 h達(dá)到最高峰，其原因可能是Omi受到其他抑凋亡蛋白的調(diào)節(jié)。

3.3 一次性離心運(yùn)動(dòng)對(duì)骨骼肌XIAP表達(dá)的影響

凋亡抑制蛋白家族是位于細(xì)胞內(nèi)的一系列獨(dú)特抗凋亡蛋白，其中X染色體連鎖的凋亡抑制蛋白（X-linked inhibitor of apoptosis protein，XIAP）是目前發(fā)現(xiàn)最具特征性的、作用最強(qiáng)的凋亡抑制蛋白，它可以通過(guò)BIR2及BIR3結(jié)構(gòu)域抑制Caspase-3、Caspase-7和Caspase-9的活性，以及RING鋅指結(jié)構(gòu)域泛素降解Caspase等多種途徑發(fā)揮抗凋亡作用[16]。XIAP被認(rèn)為是作用最強(qiáng)的內(nèi)源性Caspases抑制因子。細(xì)胞中，XIAP主要受到2種線粒體促凋亡蛋白的調(diào)節(jié)，分別是Smac和Omi。生理情況下，這2種蛋白都位于線粒體中，并且隨著凋亡的發(fā)生由線粒體轉(zhuǎn)位至胞漿，在胞漿中抑制XIAP，促進(jìn)Caspases依賴的細(xì)胞凋亡[17]。

本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，大鼠離心運(yùn)動(dòng)后即刻XIAP蛋白表達(dá)開(kāi)始明顯增加，之后至48 h升至最高，72 h有所下降但仍明顯高于安靜對(duì)照組水平。同時(shí)，采用實(shí)時(shí)定量PCR的方法檢測(cè)XIAP mRNA的轉(zhuǎn)錄水平發(fā)現(xiàn)，運(yùn)動(dòng)后即刻骨骼肌XIAP mRNA水平開(kāi)始上升，12 h明顯升高，至24 h達(dá)到最高峰，之后至72 h已基本恢復(fù)正常。XIAP蛋白表達(dá)和mRNA水平都明顯升高，二者不同是，XIAP蛋白表達(dá)在運(yùn)動(dòng)后48 h到達(dá)最高峰，而mRNA水平則在運(yùn)動(dòng)后24 h升至最高。原因可能是：（1）XIAP mRNA因其穩(wěn)定性差而降解速率快，而蛋白降解速率慢導(dǎo)致有累積效果；（2）基因翻譯成蛋白質(zhì)存在滯后性。

3.4 一次離心運(yùn)動(dòng)對(duì)骨骼肌XIAP和Omi結(jié)合作用的影響

本研究已證實(shí)離心運(yùn)動(dòng)能明顯上調(diào)骨骼肌組織XIAP和Omi的表達(dá)，推測(cè)XIAP和Omi均在運(yùn)動(dòng)誘導(dǎo)的骨骼肌細(xì)胞凋亡中發(fā)揮重要作用?，F(xiàn)已證實(shí)了XIAP是Omi新的絲氨酸蛋白酶底物，Omi可以通過(guò)N-端的AVPI序列與XIAP的BIR2和BIR3結(jié)構(gòu)域結(jié)合，釋放和活化與BIR2結(jié)合的Caspase-3，以及釋放和活化與BIR3結(jié)合的Caspase-9，進(jìn)而發(fā)揮其促凋亡效應(yīng)。此外，Omi對(duì)XIAP的降解是不可逆的酶促反應(yīng)。湯英姿等[18]在活HeLa細(xì)胞中，利用熒光共振能量轉(zhuǎn)移技術(shù)直接證實(shí)XIAP與Omi在部分細(xì)胞中存在相互作用。

為了分析XIAP和Omi在骨骼肌細(xì)胞凋亡中的作用機(jī)制，本研究使用免疫共沉淀的方法驗(yàn)證了骨骼肌中XIAP和Omi之間是否存在相互結(jié)合作用。結(jié)果顯示，與安靜對(duì)照組相比，大鼠骨骼肌組織XIAP和Omi的結(jié)合量在離心運(yùn)動(dòng)后各時(shí)間點(diǎn)分別增高了2.52倍、6.92倍、9.22倍、8.07倍和8.36倍。提示，在離心運(yùn)動(dòng)誘導(dǎo)的骨骼肌細(xì)胞凋亡過(guò)程中，XIAP與Omi存在相互結(jié)合作用。這就意味著，在離心運(yùn)動(dòng)誘導(dǎo)骨骼肌細(xì)胞凋亡過(guò)程中，Omi可能一方面通過(guò)直接結(jié)合XIAP來(lái)終止XIAP對(duì)Caspase-9或Caspase-3的抑制作用，導(dǎo)致凋亡的發(fā)生；另一方面，通過(guò)自身的絲氨酸蛋白酶活性直接降解XIAP，發(fā)揮非依賴于Caspase途徑的促凋亡效應(yīng)。

4 結(jié)論

離心運(yùn)動(dòng)能夠激活骨骼肌組織Caspase-9和Caspase-3的活性，誘導(dǎo)Omi和XIAP的表達(dá)上調(diào)，促進(jìn)XIAP與Omi相互結(jié)合，Omi可能在促使凋亡過(guò)程中發(fā)揮重要介導(dǎo)作用。

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MechanismofOmiinEccentricExercise-inducedSkeletalMuscleInjuryinRat

ZHAO Xiaoqin1，SUN Junzhi2，BAI Shengchao3，LI Junping3，ZHOU Yue3，WANG Ruiyuan3
（1.School of PE，Taiyuan University of Technology，Taiyuan 030024，China；2.Dept.of Journal，Chengdu Sport University，Chengdu 610041，China；3.Sport Science College，Beijing Sport University，Beijing 100084，China）

Objective：The aim of the present study is to investigate the change of Omi in skeletal tissue injury after eccentric exercise and the underlying mechanism.Methods：36 Adult SD rats，8 weeks aged，were randomly divided into two groups：control group and five kinds exercise groups which included 0 h after exercise，12 h after exercise，24 h after exercise，48 h after exercise and 72 h after exercise.The exercise groups were made to run on amotor-driven for one-off eccentric exercise.The rats were sacrificed in batches at different time points after exercise，then the soleues were saved to measure.Caspase-3 and-9 were determined by flurometric immunosorbent enzyme assay method.Protein and mRNA levels of Omi，XIAP were determined by Western blot and Real time PCR，respectively.The combination of XIAP and Omi was determined by Co-IP.Results：Compared with those in control group，Caspase-3 and-9 activity were significantly increased after eccentric exercise；Protein expression and mRNA levels of Omi，XIAP were significantly increased after eccentric exercise.Eccentric exercise improved the combination of XIAP and Omi.Conclusions：Eccentric exercise can increase the expression of Omi and XIAP，improve the combination of XIAP and Omi，induce enhanced Caspase-9 and-3 activity and then induce skeletal muscle cell apoptosis.

eccentric exercise；skeletal muscle；cell apoptosis；OMI；XIAP

G 804.2

：A

：1005-0000（2015）02-110-05

10.13297/j.cnki.issn1005-0000.2015.02.004

2015-01-27；

2015-03-15；錄用日期：2015-03-16

國(guó)家自然科學(xué)基金項(xiàng)目（項(xiàng)目編號(hào)：31471133）；中央高?；究蒲袠I(yè)務(wù)費(fèi)專項(xiàng)資金資助課題（項(xiàng)目編號(hào)：2014SYS005）；太原理工大學(xué)人才基金資助項(xiàng)目（項(xiàng)目編號(hào)：tyut-rc201452a）

趙曉琴（1982-），女，山西古交人，博士，講師，研究方向?yàn)檫\(yùn)動(dòng)對(duì)骨骼肌損傷的影響。

1.太原理工大學(xué)體育學(xué)院，山西太原030024；2.成都體育學(xué)院期刊部，四川成都610041；3.北京體育大學(xué)運(yùn)動(dòng)人體科學(xué)學(xué)院，北京100084。