正交試驗(yàn)法優(yōu)選桃紅四物湯醇提工藝

★　姚亮　李珊珊　于凡　彭代銀　(安徽中醫(yī)藥大學(xué)　合肥 230031)

正交試驗(yàn)法優(yōu)選桃紅四物湯醇提工藝

★姚亮*第一作者：姚亮，男，碩士研究生。Tel：18256979928，E-mail：766816651@qq.com。李珊珊于凡彭代銀*通信作者：彭代銀，男，教授，博士生導(dǎo)師。研究方向：中藥學(xué)。Tel：0551-65169189，E-mail：pengdy@ahtcm.edu.cn。(安徽中醫(yī)藥大學(xué)合肥 230031)

摘要：目的:優(yōu)選桃紅四物湯的醇提工藝。方法:以總黃酮含量和浸膏得率為考察指標(biāo)，以乙醇濃度、乙醇用量、提取時(shí)間、提取次數(shù)為考察因素，采用正交試驗(yàn)優(yōu)選桃紅四物湯的最佳醇提工藝。結(jié)果:桃紅四物湯的最佳醇提工藝為加6倍量80%乙醇提取三次，每次1.5h。結(jié)論:優(yōu)選出的桃紅四物湯的醇提工藝合理、穩(wěn)定，可為其工業(yè)化生產(chǎn)提供參考。

關(guān)鍵詞：桃紅四物湯；醇提工藝；正交試驗(yàn)；總黃酮；浸膏得率

桃紅四物湯源自于清代吳謙之《醫(yī)宗金鑒·婦科心法要訣》，由桃仁、紅花、熟地、當(dāng)歸、白芍、川芎6味中藥組方而成，具有養(yǎng)血活血、祛瘀生新之效，臨床上用于血瘀兼有血虛證特別是婦科血瘀證的治療[1]。古代醫(yī)家將其用于治療婦人瘀血內(nèi)阻、月經(jīng)失調(diào)等證，現(xiàn)代常用于血瘀引起的多種病癥，對(duì)冠心病、糖尿病、痛經(jīng)、子宮出血等均有較好療效，所治病癥涉及內(nèi)、外、婦、兒各科[2]。藥理學(xué)研究表明，桃紅四物湯還具有抗血栓[3]、改善心功能、抗血小板聚集、改善微循環(huán)、抗氧化、降低血脂等作用[4]，應(yīng)用前景廣闊，具有進(jìn)一步研究和開發(fā)的價(jià)值。在臨床用藥形式上桃紅四物湯多以湯劑為主，雖療效確切，但存在穩(wěn)定性差、易霉變、服用不便、攜帶困難等缺點(diǎn)[5]，使其的應(yīng)用和推廣受到限制，需要改革劑型。根據(jù)此方的臨床實(shí)際應(yīng)用情況及組方藥物的理化性質(zhì)及成分，可考慮采用顆粒劑、膠囊劑、片劑等口服劑型。但由于本方日服劑量相當(dāng)于原藥材51克，且藥材提取物得膏率較大，不易制成膠囊、片劑，故考慮制成顆粒劑。為確保顆粒劑的質(zhì)量及療效，本研究對(duì)桃紅四物湯的醇提工藝進(jìn)行優(yōu)選。由于組方中桃仁、紅花、當(dāng)歸、川芎四味藥的脂溶性成分較多[6-8]，故對(duì)以上四味藥采用乙醇作為溶劑進(jìn)行提取，以浸膏得率和總黃酮含量作為指標(biāo)考察桃紅四物湯的最佳醇提工藝。

1材料

1.1藥物及試劑桃仁(安徽濟(jì)人藥業(yè)有限公司，批號(hào):130331);紅花(安徽濟(jì)人藥業(yè)有限公司，批號(hào):130406);當(dāng)歸(安徽濟(jì)人藥業(yè)有限公司，批號(hào):130625);川芎(安徽濟(jì)人藥業(yè)有限公司，批號(hào):130519)；蘆丁對(duì)照品(批號(hào)：120526-201408)；甲醇為色譜純。

1.2儀器紫外-可見分光光度計(jì)(UV757CRT型，上海精科儀器有限公司)；十萬(wàn)分之一分析天平(AB135-S型，梅特勒公司)；電子天平(PL601-S型，梅特勒公司)；旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(SHB-Ⅲ型，上海亞榮生化儀器廠)；水浴鍋(HH-S2型，常州普天儀器制造有限公司)；真空干燥箱(DZF-6050型，上海博訊實(shí)業(yè)有限公司)。

2方法與結(jié)果

2.1總黃酮含量測(cè)定[9]

2.1.1對(duì)照品溶液的制備取120℃干燥至恒重的蘆丁對(duì)照品適量，精密稱定，加甲醇制成每1mL含0.2mg的溶液，即得。

2.1.2供試品溶液的制備按處方比例稱取桃仁9g，紅花6g，當(dāng)歸9g，川芎6g，按醇提L9(34)正交試驗(yàn)進(jìn)行乙醇回流提取，濾液濃縮后置真空干燥箱干燥至恒重，計(jì)算浸膏得率。取干浸膏粉適量，精密稱定，至50mL容量瓶中，加甲醇至刻度，搖勻，濾過，即得。

2.1.3最大吸收波長(zhǎng)的確定將蘆丁對(duì)照品溶液在400～600nm波長(zhǎng)范圍內(nèi)進(jìn)行掃描，發(fā)現(xiàn)在506nm波長(zhǎng)處有最大吸收峰，故選擇506nm作為檢測(cè)波長(zhǎng)。

2.1.4標(biāo)準(zhǔn)曲線的測(cè)定分別取上述蘆丁對(duì)照品溶液1.0,2.0,3.0,4.0,5.0,6.0mL置于25mL容量瓶中，各加水至6mL，加5%亞硝酸鈉溶液1mL，搖勻，放置6min，加10%硝酸鋁溶液1mL，搖勻，放置6min，加4.3%氫氧化鈉溶液10mL，再加水至刻度，搖勻，放置15min，以相應(yīng)的試劑為空白，按照紫外-可見分光光度法，在506nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度，以吸光度為縱坐標(biāo)，濃度為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得回歸方程為：Y=14.014X-0.019 4(r=0.999 9)，線性范圍為0.008～0.048 mg/mL。

2.1.5精密度考察取一定濃度的對(duì)照品溶液4mL，按2.1.4項(xiàng)下操作，連續(xù)測(cè)定6次吸光度值，其RSD值為0.12%，表明本方法的精密度良好。

2.1.6重復(fù)性考察取供試品溶液4mL，按2.1.4項(xiàng)下操作，連續(xù)測(cè)定6次吸光度值，其RSD值為0.20%，表明本方法的重復(fù)性符合要求。

2.1.7穩(wěn)定性考察吸取供試品溶液4mL，按2.1.4項(xiàng)下操作，分別于顯色后0,5,10,15,20,25,30min測(cè)定吸光度，其RSD為1.25%，表明供試品溶液在顯色后30min內(nèi)吸光度穩(wěn)定。

2.1.8加樣回收率取同一樣品約40.3mg，精密稱定6份，按2.1.4.2溶液的制備方法制備供試品溶液，取4mL供試品溶液，采用加樣回收試驗(yàn)，分別加入2mL蘆丁對(duì)照品溶液(0.2mg/mL)，置于25mL容量瓶中，按2.1.4項(xiàng)下步驟進(jìn)行操作測(cè)定其吸光度，平行操作6份，計(jì)算其平均加樣回收率為98.2%，RSD為0.87%，結(jié)果表明方法回收率良好。

2.1.9總黃酮測(cè)定法分別吸取對(duì)照品溶液與供試品溶液各4mL，按2.1.4項(xiàng)下方法顯色后置紫外-可見分光光度計(jì)中測(cè)定即得。

2.2浸膏得率測(cè)定分別按醇提和水提正交試驗(yàn)提取后濾過，得醇提液或水提液，濾液濃縮，置已干燥至恒重的蒸發(fā)皿中，水浴蒸干后置真空干燥箱60℃干燥至恒重，計(jì)算浸膏得率(浸膏得率=干浸膏質(zhì)量/藥材質(zhì)量×100%)。

2.3醇提正交試驗(yàn)

2.3.1醇提正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)選用乙醇對(duì)桃仁、紅花、當(dāng)歸、川芎進(jìn)行回流提取，以總黃酮含量和浸膏得率為評(píng)價(jià)指標(biāo)進(jìn)行綜合評(píng)價(jià)(浸膏得率和總黃酮含量的權(quán)重系數(shù)分別為0.4，0.6)，以乙醇濃度(A)、乙醇用量(B)、提取時(shí)間(C)、提取次數(shù)(D)為因素，選取三個(gè)水平，按L9(34)表進(jìn)行正交試驗(yàn)，優(yōu)選最佳的醇提工藝條件，醇提正交試驗(yàn)因素水平表見表1。

表1　醇提正交試驗(yàn)因素水平表

表2　醇提正交試驗(yàn)結(jié)果

2.3.2醇提正交試驗(yàn)結(jié)果由直觀分析可得，對(duì)乙醇提取效果的因素影響為A>D>C>B,，最佳工藝的組合為A3B3C2D3。以極差最小的B因素為誤差項(xiàng)進(jìn)行方差分析，結(jié)果顯示A因素與D因素對(duì)醇提工藝具有顯著性影響，結(jié)合生產(chǎn)實(shí)際與成本考慮，選擇乙醇提取的最優(yōu)組合為A3B1C2D3，即乙醇濃度為80%，6倍量提取三次，每次1.5h。

表3　醇提正交方差分析

注：F臨界值：F0.05(2,2)=19。

2.3.3驗(yàn)證試驗(yàn)按處方比例稱取桃仁9g、紅花6g、當(dāng)歸9g、川芎6g，3份，按最優(yōu)醇提工藝進(jìn)行試驗(yàn)，結(jié)果見表4，表明優(yōu)選的工藝合理、穩(wěn)定、可行。

表4　醇提工藝驗(yàn)證試驗(yàn)結(jié)果

3討論

桃紅四物湯由四物湯(熟地、當(dāng)歸、白芍、川芎)加上桃仁、紅花二味中藥組成，臨床用于血瘀兼有血虛證的治療，療效顯著[10]。在桃紅四物湯的提取工藝研究中，根據(jù)組方藥物有效成分的理化性質(zhì)，采用不同的溶劑進(jìn)行提取，首先對(duì)其中含脂溶性成分較多的桃仁、紅花、當(dāng)歸、川芎四味藥的醇提工藝進(jìn)行考察。其中，浸膏得率是工藝優(yōu)選中的傳統(tǒng)指標(biāo)，總黃酮為方中桃仁、紅花、當(dāng)歸、川芎四味藥中的有效成分，通過多指標(biāo)綜合評(píng)分來(lái)全面地評(píng)價(jià)提取工藝，優(yōu)選出桃紅四物湯的最佳醇提工藝，為今后桃紅四物顆粒的研制和開發(fā)提供前期必要的基礎(chǔ)和有利的保障。

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Optimization of Alcohol Extraction Process for Taohong Siwu Decoction by Orthogonal Test

YAO Liang, LI Shan-shan, YU Fan, PENG Dai-yin

AnhuiUniversityofChineseMedicine,Hefei230031,China.

Abstract:Objective: To optimize the ethanol extraction technology for Taohong Siwu Decoction. Methods:With yield of total flavonoids and extract as indexes, orthogonal test was adopted to optimize the ethanol extraction technology by taking the concentration of ethanol,the amount of solvent, extraction time and extraction times as indexes. Results:The optimal process of the ethanol extraction technology was as follows: add 3times with 6 times amount of 80% ethanol, and 1.5h for each time. Conclusion:The optimized ethanol extraction technology was reasonable and feasible, which can be provided as the reference for the industrialized production.

Key words:Taohong Siwu Decoction; Water Extraction Process; Orthogonal Test; Total Flavonoids; Extract

收稿日期：(2014-11-09)編輯：曾文雪

中圖分類號(hào)：R284.2

文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A