HPLC法測(cè)定江香薷中游離型與結(jié)合型黃酮的含量*

★　李晶　余良忠　虞金寶　(江西省中醫(yī)藥研究院　南昌 330077)

* 基金項(xiàng)目：江西省科技支撐計(jì)劃項(xiàng)目(2011 BBG 70030-3)。

HPLC法測(cè)定江香薷中游離型與結(jié)合型黃酮的含量*

★李晶*第一作者：李晶(1981-)，女，副研究員。研究方向：中藥分析及中藥制劑。E-mail:savon@sina.com。余良忠虞金寶*通信作者：虞金寶，研究員。Tel:0791-88501404，E-mail:yjb2217@163.com。(江西省中醫(yī)藥研究院南昌 330077)

* 基金項(xiàng)目：江西省科技支撐計(jì)劃項(xiàng)目(2011 BBG 70030-3)。

摘要：目的：建立江香薷藥材中游離型與結(jié)合型黃酮的含量測(cè)定方法。方法：色譜條件：色譜柱：Dikma Diamonsil C18(2)(250mm×4.6mm，5μm)；流動(dòng)相：甲醇-0.1%磷酸(54∶46)；流速：1.0mL/min;檢測(cè)波長(zhǎng)：350nm；柱溫：30℃，理論板數(shù)按木犀草素峰和山奈素峰計(jì)算應(yīng)不低于3 000。結(jié)果：木犀草素、山奈素分別在2.436～121.8μg/mL，1.562～78.1μg/mL范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。木犀草素和山奈素加樣回收率分別為100.30%，100.72%；RSD分別為1.61%，1.45%。結(jié)論：HPLC方法操作簡(jiǎn)單，重現(xiàn)性好，可用于江香薷藥材的質(zhì)量控制。

關(guān)鍵詞：江香薷；木犀草素；山奈素；高效液相色譜法

香薷為唇形科植物石香薷MoslachinensisMaxim.或江香薷Moslachinensis“Jiangxiangru”的干燥地上部分。前者習(xí)稱青香薷，后者習(xí)稱江香薷[1]。江香薷產(chǎn)于江西、廣西、湖南等地，其中以江西產(chǎn)量最大。香薷味辛，微溫，為傳統(tǒng)的辛溫解表藥，主要用于夏季惡寒發(fā)熱，頭痛無汗，腹痛吐瀉等暑濕感冒癥狀。現(xiàn)代藥理研究表明江香薷有抗病原微生物、消炎、解熱、鎮(zhèn)痛、解痙免疫增強(qiáng)等作用[2-5]。江香薷藥材含揮發(fā)油、黃酮類、萜類、有機(jī)酸類、甾體等多種化合物[6-7]。傳統(tǒng)臨床用藥方式多為水煎服，藥物發(fā)揮清熱解表療效的成分主要為水溶性成分，但目前對(duì)其非揮發(fā)性成分研究較少，僅有少量針對(duì)其中黃酮類成分的研究報(bào)道，并且在其定量測(cè)定研究中，均為測(cè)定其中游離型黃酮，未有對(duì)結(jié)合型黃酮的含量測(cè)定研究報(bào)道，而植物體內(nèi)黃酮類成分的存在形式有游離型與結(jié)合型兩種，并且以游離形態(tài)存在的黃酮類成分含量普遍較低，因此本次實(shí)驗(yàn)通過研究測(cè)定多來源江香薷中游離型和結(jié)合型黃酮(以木犀草素和山奈素為檢測(cè)指標(biāo))的含量，為江香薷藥材及其相關(guān)制劑的質(zhì)量控制提供依據(jù)。

1材料

Waters高效液相色譜儀(美國(guó)Waters公司：1500二元梯度泵及柱溫箱、2487雙波長(zhǎng)紫外檢測(cè)器、empower化學(xué)工作站)；SimplicityTM個(gè)人型超純水系統(tǒng)(Millipore公司)，CQ-250超聲波清洗儀(上海船舶電子設(shè)備研究所)，AG-135電子天平(梅特勒-托利多)，AL-204電子天平(梅特勒-托利多)。

香薷藥材：分別來源于湖南紹陽(yáng)(花前、花期)、江西弋陽(yáng)(野生、花前、花期、果期)、江西余江(野生、種植)。

木犀草素對(duì)照品(含量測(cè)定用，批號(hào)：111520-200504，中國(guó)藥品生物制品檢定所)，山奈素對(duì)照品(含量測(cè)定用，批號(hào)：110861-200808，中國(guó)藥品生物制品檢定所)；甲醇(色譜純)，其它試劑均為分析純。

2方法與結(jié)果

2.1色譜條件的選擇色譜柱：Dikma Diamonsil C18(2)(4.0mm×250mm,5μm)，流動(dòng)相：甲醇-0.1%磷酸(54∶46)，流速：1mL/min，檢測(cè)波長(zhǎng)350nm，柱溫：30℃，理論板數(shù)按木犀草素峰和山奈素峰計(jì)算應(yīng)不低于3 000。在此條件下對(duì)照品、供試品在相同時(shí)間呈現(xiàn)相同色譜峰，見圖1-2。

圖1　藥材供試品溶液色譜圖

圖2　對(duì)照品溶液色譜圖

2.2線性關(guān)系的考察精密稱取木犀草素和山奈素對(duì)照品各適量，分別加70%乙醇制成每1mL含木犀草素0.609mg、山奈素0.781 mg的對(duì)照品溶液。取對(duì)照品溶液適量，加70%乙醇分別稀釋成每1mL含木犀草素和山奈素為2.436、1.562；3.045、1.952 5；6.090、3.905；12.18、7.81；30.45、19.525；60.9、39.05；121.8、78.1μg的混合對(duì)照品溶液，分別吸取10μL，注入液相色譜儀中，按上述色譜條件測(cè)定，將濃度與峰面積進(jìn)行回歸，得木犀草素回歸方程為:Y=74 934X-77 777.07r=0.999 9(n=7),在2.436～121.8μg/mL范圍內(nèi)木犀草素濃度與峰面積呈良好的線性關(guān)系；山奈素回歸方程為:Y=129 626.7X-65 648.4r=0.999 9(n=7),在1.562～78.1μg/mL范圍內(nèi)木犀草素濃度與峰面積呈良好的線性關(guān)系。

2.3精密度試驗(yàn)精密吸取木犀草素、山奈素混合對(duì)照品溶液10L，按上述色譜條件，連續(xù)進(jìn)樣6次，測(cè)定對(duì)照品溶液中峰面積值，計(jì)算對(duì)照品峰面積值的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)差分別為1.96%、1.87%。

2.4穩(wěn)定性試驗(yàn)精密吸取供試品溶液10μL，按上述色譜條件，分別在0,2,4,6,8,12 h進(jìn)行測(cè)定，結(jié)果總黃酮中木犀草素、山奈素峰面積的RSD分別為1.98%、2.07%。表明總黃酮采用的提取方法穩(wěn)定可行。

2.5重復(fù)性試驗(yàn)取香薷藥材粉(過40目篩)各1.0g，共7份，按供試品溶液制備項(xiàng)下方法制成供試品溶液，按上述色譜條件進(jìn)行測(cè)定，結(jié)果總黃酮中木犀草素、山奈素的平均含量分別為：1.601 4mg/g，0.458 5mg/g,RSD分別為1.69%、1.04%。

2.6加樣回收率試驗(yàn)取香薷藥材粉(過40目篩)約1.0g，共6份，精密稱定，置具塞三角瓶中，精密加入70%乙醇25mL，稱定重量，回流提取2h，放冷，再次稱重，以70%乙醇補(bǔ)足減失重量，搖勻，濾過，精密吸取續(xù)濾液5mL，再精密加入木犀草素對(duì)照品(0.304 5 mg/mL) 1mL、山奈素對(duì)照品(0.031 24 mg/mL) 3mL，70%乙醇1mL，余照含量測(cè)定項(xiàng)下實(shí)驗(yàn)，精密吸取10μL注入液相色譜儀中進(jìn)行含量測(cè)定，計(jì)算回收率，結(jié)果：木犀草素平均回收率=100.3%，RSD=1.61%；山奈素平均回收率=100.72，RSD=1.45%(n=6)。

2.7樣品測(cè)定

2.7.1游離型黃酮的含量測(cè)定取香薷藥材粉(過40目篩)約1.0g，精密稱定，置100mL容量瓶中，精密加入70%乙醇25mL，稱定重量，水浴回流提取2h，放冷，再次稱定重量，加70%乙醇補(bǔ)足減失重量，搖勻，濾過，取續(xù)濾液通過微孔濾膜(0.45μm)，精密吸取10L注入液相色譜儀中進(jìn)行含量測(cè)定，計(jì)算，即得，結(jié)果見表1。

2.7.2結(jié)合型黃酮的含量測(cè)定精密吸取“7.1”項(xiàng)下續(xù)濾液10mL，加入3mL鹽酸，水浴回流提取2h，放冷，轉(zhuǎn)移至25mL容量瓶中，以70%乙醇分多次洗滌圓底燒瓶并入容量瓶中，加70%乙醇補(bǔ)足至刻度，搖勻，濾過，取續(xù)濾液通過微孔濾膜(0.45μm)，精密吸取10μL注入液相色譜儀中進(jìn)行含量測(cè)定，計(jì)算，即得，結(jié)果見表1。

表1　香薷藥材中游離型和結(jié)合型黃酮的含量測(cè)定(n=2) 　mg·g-1

3討論

3.1香薷藥材的非揮發(fā)性成分研究發(fā)現(xiàn)主要成分有黃酮類、烴類、甾醇類、高級(jí)脂肪酸類、酚類等，其中黃酮類成分主要有木犀草素、山奈素、槲皮素、金圣草黃素和芹菜素[1-5]。香薷非揮發(fā)性成分主要為黃酮類，具有抗菌、抗病毒活性[8-9]，與其“解熱、鎮(zhèn)痛”功效相對(duì)應(yīng)。因此本次實(shí)驗(yàn)選用了木犀草素、山奈素為檢測(cè)指標(biāo)，對(duì)多來源的江香薷藥材進(jìn)行游離型黃酮和結(jié)合型黃酮的含量測(cè)定方法研究。

3.2實(shí)驗(yàn)中分別比較了超聲提取與回流提取效果，采用70%乙醇、95%乙醇、50%甲醇和純甲醇對(duì)提取溶劑進(jìn)行篩選并對(duì)溶劑用量(25，50，75mL)、提取時(shí)間(1，2，3h)進(jìn)行篩選；在水解條件的摸索中，分別比較了鹽酸用量(1，2，3mL)及水解時(shí)間(1，2，3h)提取效果。結(jié)果表明，游離型黃酮以采用70%乙醇25mL回流提取2h效果最好，結(jié)合型黃酮測(cè)定采用取游離型黃酮續(xù)濾液10mL加鹽酸2mL水解2h測(cè)定最佳。

3.3實(shí)驗(yàn)研究過程中，分別比較了不同植株莖葉中的黃酮含量，結(jié)果顯示香薷葉中黃酮含量明顯高于莖中含量。根據(jù)表2含量測(cè)定結(jié)果顯示，不同產(chǎn)地香薷藥材的液相色譜出峰時(shí)間基本相似，但不同成分的含量相差較大。各來源藥材中游離型黃酮含量差異較小，結(jié)合型黃酮以湖南紹陽(yáng)產(chǎn)地最高，江西弋陽(yáng)產(chǎn)的野生香薷含量次之，其他來源藥材中，余江香薷野生品含量較種植品含量低，分析原因可能為種植品質(zhì)量可控，植株較野生品粗壯，產(chǎn)葉量豐富。同理各產(chǎn)地花前花后果期黃酮含量變化可能也由于植株含葉莖比例變化所致。這個(gè)結(jié)論與藥典中規(guī)定香薷采收期為“夏季莖葉茂盛時(shí)采收”相符。但是，由于采樣的局限性，黃酮含量與植株莖葉含量的相關(guān)性還有待進(jìn)一步確認(rèn)。

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征稿啟事

《江西中醫(yī)藥》所設(shè)的重點(diǎn)欄目有《明醫(yī)心鑒》、《滕王閣醫(yī)話》等?！睹麽t(yī)心鑒》以介紹名老中醫(yī)經(jīng)驗(yàn)和中醫(yī)臨證心得為主，重點(diǎn)刊載中醫(yī)關(guān)于疑難病的診療經(jīng)驗(yàn)，要求觀點(diǎn)、方法新，經(jīng)驗(yàn)獨(dú)到?！峨蹰w醫(yī)話》主要反映中醫(yī)教學(xué)、科研、臨床的一得之見，要求以小見大，有感而文，語言生動(dòng)流暢，可讀性強(qiáng)，富于知識(shí)性、趣味性。

Determination of Free and Combined Flavone inMoslaeChinensisJiangxiangru by HPLC

LI jing, YU Liang-zhong, YU Jin-bao

JiangxiInstitutionoftradionalChinesemedicalandPharmaceuticalsciences,Nanchang330077,China.

Abstract:Objective: To establish a method of HPLC for determination free and combined flavone in Moslae Chinensis 'jiangxiangru'. Methods: Using a Dikma Diamonsil C18(2)column (4.6mm×250mm,5μm), the mobile phases were consisted of acetonitrile-0.1%H3PO4(54∶46), with 1.0mL/min flow rate. The detection wavelength was 350nm.The column tempera was 30 centigrade. Results:There were good linearities in the range 2.436～121.8 g/mL of Luteolin (r=0.999 9) and 1.526～78.1 g/mL of Kaempferol (r=0.999 9). The average recovery of Luteolin and Kaempferol were 100.30% and 100.72% in total flavone(n=6); RSD were 1.61% and 1.45% in total flavone. Conclusion: The methods established are feasible and reproducible,and can be used to control the quality of Moslae Chinensis'jiangxiangru'.

Key words:Moslae Chinensis 'jiangxiangru'；Luteolin；Kaempferol；HPLC

收稿日期：(2014-08-05)編輯：曾文雪

中圖分類號(hào)：R286.0

文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：B