HPLC-MS-MS正負(fù)離子切換測定豆芽中4種植物生長調(diào)節(jié)劑殘留量

魏一婷

(廈門出入境檢驗(yàn)檢疫局檢驗(yàn)檢疫技術(shù)中心， 福建 廈門 361100)

HPLC-MS-MS正負(fù)離子切換測定豆芽中4種植物生長調(diào)節(jié)劑殘留量

魏一婷

(廈門出入境檢驗(yàn)檢疫局檢驗(yàn)檢疫技術(shù)中心， 福建 廈門 361100)

摘要:建立了高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法(HPLC-MS-MS)同時測定豆芽中4種植物生長調(diào)節(jié)劑(6-芐基腺嘌呤、赤霉酸、對氯苯氧乙酸、咪酰胺)殘留的方法。樣品加入少量無水硫酸鈉后采用含1%(V/V)乙酸的乙腈溶液提取，QuEChERS(PSA+C18)凈化。在ESI源下進(jìn)行正負(fù)離子切換掃描檢測，以保留時間和特征離子對定性，外標(biāo)法定量。結(jié)果表明4種待測物質(zhì)在1.0-200 μg/L范圍內(nèi)線性關(guān)系良好，定量離子對的相關(guān)系數(shù)大于0.9990。方法定量限(S/N=10)赤霉酸為20 μg /kg，其余三種均為2.5-5.0 μg/kg,方法回收率為81.3%-102.5%。本文提供了質(zhì)譜中正負(fù)離子切換同時檢測多個植物生長調(diào)節(jié)劑殘留的方法，可滿足一針進(jìn)樣同時測定，前處理方法簡便，回收率高，可應(yīng)用于豆芽中4種植物生長調(diào)節(jié)劑殘留的日常檢測。

關(guān)鍵詞:豆芽；高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法(HPLC-MS-MS)；植物生長調(diào)節(jié)劑

豆芽是深受人們喜愛的蔬菜，其富含Vc、氨基酸、視黃醇、膳食纖維等對人體有益的成分，而且脂肪、膽固醇含量很低，適合“三高”人群食用，有利于調(diào)節(jié)不健康的膳食結(jié)構(gòu)。但是近年來，隨著毒豆芽事件頻頻曝光，民眾對豆芽的安全食用性表現(xiàn)出越來越多的擔(dān)憂和不信任。所謂毒豆芽，外表看似新鮮，但是至少含4種違法添加劑，包括植物生長調(diào)節(jié)劑、殺菌劑、激素添加劑等。這些添加劑使豆芽個頭均勻，顏色白凈，且絕大多數(shù)沒有根須，看起來很漂亮，但這些添加劑殘留在人體內(nèi)積累所產(chǎn)生的有害作用卻是不容忽視的(唐莉娟等，2009)。

目前國內(nèi)外有關(guān)豆芽中植物生長調(diào)節(jié)劑殘留量的檢測方法報道較少，以氣相色譜法(常宇文等，2007)、液相色譜法(夏慧等，2011)、氣相色譜-質(zhì)譜法(陳衛(wèi)軍等，2012)、液相色譜-質(zhì)譜法 (劉春生等，2014；黃何何等，2014；林黛琴等，2013；柳菡等，2013;Maetal.，2013；Zhangetal.，2012) 為主。這些方法有其特定的優(yōu)點(diǎn)，亦有各自的缺點(diǎn)。比如氣相色譜及氣相色譜-質(zhì)譜法存在前處理需進(jìn)行衍生反應(yīng)，操作繁瑣等問題，而液相色譜選擇性較差，靈敏度低且難以確證。因此液相色譜-質(zhì)譜法以其前處理操作簡單，選擇性高及靈敏度佳等優(yōu)勢，成為廣泛使用的檢測方法。

為了保障公眾食品安全，滿足準(zhǔn)確快捷檢測出毒豆芽中植物生長調(diào)節(jié)劑殘留量的要求，本文通過優(yōu)化質(zhì)譜參數(shù)和色譜條件，考察流動相、提取方法和基質(zhì)效應(yīng)等因素，整合建立了HPLC-MS-MS 同時測定豆芽中6-芐基腺嘌呤、赤霉酸、對氯苯氧乙酸，咪酰胺等4種植物生長調(diào)節(jié)劑殘留量的分析方法。

1 材料與方法

1.1試劑與儀器

ABI/SCIEX的4000Q TRAP質(zhì)譜，配Agilent 1200高效液相色譜儀(美國Agilent)，電噴霧離子源( ESI)；IKA T25 Basic均質(zhì)器(德國IKA)；離心機(jī)(上海安亭科學(xué)儀器廠)；固相萃取裝置(美國Supelco)；氮吹儀(美國Caliper)；渦旋混勻器(IKA 3 Basic，德國IKA)；Milli Q超純水系統(tǒng)(美國Millipore)。

乙腈和甲醇(色譜純，德國Merck)；甲酸(色譜純，德國Merck)，乙酸銨(色譜純，F(xiàn)luka)，乙酸、無水硫酸鈉和氫氧化鈉為分析純；乙二胺-N-丙基硅烷(PSA)和C18填料(40 μm)，實(shí)驗(yàn)用水符合GB/T 6682規(guī)定要求。

標(biāo)準(zhǔn)品：6-芐基腺嘌呤(0.1 g 99.0%, Dr.Ehrenstorfer)、赤霉酸(0.1 g 98.0%, Dr.Ehrenstorfer)、對氯苯氧乙酸(0.25 g 99.5%，Dr.Ehrenstorfer)、咪酰胺(0.25 g 98.5%，Dr.Ehrenstorfer)。

稱取適量標(biāo)準(zhǔn)品，分別用甲醇配制成100 mg/L的儲備液并儲存在-4 ℃ 冰箱中。根據(jù)實(shí)驗(yàn)需要，用乙腈稀釋標(biāo)準(zhǔn)儲備液，配成適當(dāng)濃度的標(biāo)準(zhǔn)工作溶液。

1.2樣品前處理

稱取10 g(精確至0.01 g)樣品于50 mL離心管中，加入10 mL 1%乙酸乙腈溶液，勻漿2 min后，加入脫水試劑(2 g無水硫酸鈉)，渦旋振蕩1 min，以4 000 r/min離心3 min，取2.0 mL上清液于分散固相萃取管(50 mgPSA+100 mgC18)中，渦旋混勻1 min，后于16 000 r/min速率下離心5 min，所得上清液經(jīng)0.2 μm有機(jī)濾膜過濾后，待測定。

1.3色譜條件

T3色譜柱(waters Atlantis?T3 3 μm；2.1 mm×150 mm)；流動相A為0.1%甲酸水，B為乙腈；洗脫程序：0-2.0 min，5%B-20%B；2.0-6.0 min，20%B；6.0-6.1 min，20%B -65%B；6.1-9.5 min，65%B；9.5-9.6 min，65%B -70%B；9.6-12.0 min，70%B；12-12.1 min，70%B -5%B；12.1-17.0 min，5%B。進(jìn)樣量為0.5μL，流速400 mL/min，柱溫箱溫度：30 ℃。

1.4質(zhì)譜條件

ESI正負(fù)離子分段采集，4種待測物的監(jiān)測離子及錐孔電壓、碰撞室入口電壓、碰撞能量、碰撞室出口電壓等參數(shù)如表1所示。

表1　4種植物生長調(diào)節(jié)劑質(zhì)譜分析條件

注：其中*表示定量離子

2結(jié)果與分析

2.1質(zhì)譜條件優(yōu)化

使用針泵進(jìn)樣分析目標(biāo)化合物的標(biāo)準(zhǔn)溶液，優(yōu)化4種植物生長調(diào)節(jié)劑的質(zhì)譜條件?；衔镞M(jìn)入一級質(zhì)譜后，可產(chǎn)生穩(wěn)定的[M+H]+離子或[M-H]-離子。其中6-芐基腺嘌呤可產(chǎn)生[M+H]+離子，也可以形成穩(wěn)定的[M-H]-離子，但[M+H]+離子的靈敏度明顯更高。在綜合考慮靈敏度與分段掃描等因素后，最終選用對氯苯氧乙酸、赤霉酸的[M-H]-離子為母離子，咪酰胺、6-芐基腺嘌呤的[M+H]+離子為母離子；確定了化合物母離子后，在Product Ion模式下，母離子進(jìn)入二級質(zhì)譜，對化合物母離子施加一定量的碰撞能量(CE)，母離子發(fā)生斷裂或重排等反應(yīng)產(chǎn)生不同的子離子碎片。最后在MRM模式下，優(yōu)化目標(biāo)物離子碎片的最佳條件。6-芐基腺嘌呤，赤霉酸，對氯苯氧乙酸，咪酰胺4種植物生長調(diào)節(jié)劑的MRM色譜圖見圖1。

2.2色譜條件優(yōu)化

液相色譜-質(zhì)譜分析中，水相使用最多的有甲酸水溶液、乙酸銨水溶液等，有機(jī)相通常使用乙腈，0.5%甲酸乙腈、乙酸銨乙腈溶液。通過實(shí)驗(yàn)結(jié)果對比，發(fā)現(xiàn)采用0.1%甲酸水和乙腈作為流動相時，目標(biāo)物的分離度和峰型較好，對于負(fù)離子兩個物質(zhì)，特別是赤霉酸的影響也較小，信號響應(yīng)值大約下降30%。若使用乙腈-水作為流動相，則在ESI正模式下檢測的化合物響應(yīng)值下降50%，故本實(shí)驗(yàn)采用0.1%甲酸水和乙腈作為流動相。

圖1　4種植物生長調(diào)節(jié)劑的MRM總離子流圖

2.3提取溶劑的選擇

根據(jù)四種目標(biāo)化合物的化學(xué)性質(zhì)，本實(shí)驗(yàn)對比了甲醇、1%乙酸甲醇、乙腈、1%乙酸乙腈、含1% 1 mol/L NaOH的乙腈五種溶劑的提取效率，結(jié)果如圖2所示。研究結(jié)果表明，1%乙酸乙腈的提取效率總體較高，對赤霉酸和對氯苯氧乙酸來說，由于結(jié)構(gòu)中含有羧基，酸性條件能抑制羧基在溶液中電離成離子形態(tài)，從而提高回收率。因此本實(shí)驗(yàn)采用1%乙酸乙腈作為提取溶劑。

圖2　不同溶劑提取效率對比

2.4凈化條件的優(yōu)化

固相萃取(SPE)是最常用的前處理凈化方法之一，雖然SPE 技術(shù)對微量或痕量目標(biāo)化合物的提取、分離能力較強(qiáng)，但其操作比較繁瑣、耗時，且成本較高，不適于大批量樣品的快速篩查(陳衛(wèi)軍等，2012)。本實(shí)驗(yàn)采用QuEChERS的提取方法，考察了PSA，C18，GCB這三種常用的吸附劑材料對4種目標(biāo)化合物的吸附作用。實(shí)驗(yàn)表明，PSA對于對氯苯氧乙酸具有一定的吸附作用，該作用隨著PSA使用量的增大而增大；C18對6-芐基腺嘌呤、赤霉酸有輕微的吸附作用；GCB對4種目標(biāo)化合物均有較強(qiáng)的吸附作用。由于PSA主要作用力是極性相互作用及弱離子交換作用，可以有效去除樣品中有機(jī)酸、脂肪酸等干擾物，C18具有強(qiáng)非極性作用，對極性較弱的脂肪酸、烯烴類、色素等大分子基質(zhì)干擾物有較好的吸附效果。所以本實(shí)驗(yàn)在綜合考量下，選用PSA+C18作為吸附劑并做了進(jìn)一步的考察。實(shí)驗(yàn)表明，當(dāng)PSA使用量為50 mg，C18使用量為100 mg時，4種植物生長調(diào)節(jié)劑回收率均大于80%，故本實(shí)驗(yàn)最終選定50 mgPSA+100 mgC18為凈化吸附劑。

2.5線性關(guān)系、檢出限和定量限

為了降低待測物的基質(zhì)效應(yīng)，提高定量的準(zhǔn)確性，本實(shí)驗(yàn)采用空白基質(zhì)添加不同濃度的目標(biāo)化合物配成標(biāo)準(zhǔn)溶液，線性范圍、曲線方程見表2，由表2可以看出，這4種目標(biāo)化合物的線性關(guān)系良好，相關(guān)系數(shù)基本在0.9990以上，保證了定量的可靠性。4種目標(biāo)化合物的方法檢出限(LOD)和定量限(LOQ)依照S/N=3，S/N=10的原則結(jié)合樣品前處理的稀釋倍數(shù)推算。

表2　目標(biāo)化合物的線性范圍、線性方程、相關(guān)系數(shù)、方法檢出限和定量限

表3　回收率和精密度測定結(jié)果(n=6)

2.6方法回收率與精密度

本實(shí)驗(yàn)分別選用了綠豆芽、黃豆芽進(jìn)行了3個水平濃度的添加回收實(shí)驗(yàn)，6次平行實(shí)驗(yàn)的結(jié)果如表3。4種目標(biāo)化合物的回收率范圍為81.3%-102.5%，RSD范圍在4.2%-12.1%之間，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)GB/T 27404-2008附表規(guī)定，當(dāng)待測組分含量小于0.1 mg/kg時，回收率的參考范圍為60%-120%，故本方法的準(zhǔn)確性和精密度均符合標(biāo)準(zhǔn)要求。

3小結(jié)與討論

現(xiàn)有資料表明，國內(nèi)外關(guān)于豆芽中生長調(diào)節(jié)劑殘留量的測定項(xiàng)目比較單一，方法集中在氣相色譜法、液相色譜法、氣相色譜-質(zhì)譜法、液相色譜-質(zhì)譜法等。其中，氣相色譜法、氣相-質(zhì)譜法靈敏度高，但前處理通常需衍生反應(yīng)，操作繁瑣費(fèi)時，不適用于大批樣品的檢測；液相色譜法靈敏度較低，選擇性較差，易出現(xiàn)假陽性(陳衛(wèi)軍等，2012)。這些不足大大降低了豆芽中植物生長調(diào)節(jié)劑的檢測效率，給市場監(jiān)管帶來種種不便。而液相色譜-質(zhì)譜法前處理無需衍生，一針進(jìn)樣，可同時檢測豆芽中4種植物生長調(diào)節(jié)劑，周期較短，選擇性好，精密度高，在豆芽中植物生長調(diào)節(jié)劑殘留檢測上的優(yōu)勢顯而易見。

QuEChERS提取方法是今年來國際上最新發(fā)展起來的一種快速樣品前處理技術(shù)，本實(shí)驗(yàn)將其運(yùn)用于豆芽中4種植物生長調(diào)節(jié)劑殘留檢測的前處理，與傳統(tǒng)的溶劑提取-SPE凈化方法相比，該方法大大降低了檢測成本且減少了有機(jī)溶劑的使用，更加經(jīng)濟(jì)快捷安全。

本實(shí)驗(yàn)建立了以PSA和C18進(jìn)行QuEChERS凈化，4000Q在ESI正負(fù)模式切換下同時測定豆芽中4種植物生長調(diào)節(jié)劑殘留的方法。優(yōu)化了樣品的提取和凈化等前處理步驟以及色譜質(zhì)譜條件，考察了方法檢出限、回收率、精密度等方法學(xué)指標(biāo)。結(jié)果表明，該方法操作簡單，效率快捷，靈敏度高，選擇性強(qiáng)、回收率良好，完全滿足檢測豆芽中6-芐基腺嘌呤，赤霉酸，對氯苯氧乙酸，咪酰胺殘留的要求。

致謝：

本研究得到徐敦明研究員的大力支持和指導(dǎo)，特此致謝！

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(責(zé)任編輯：陳曉雯)

魏一婷.2015.HPLC-MS-MS正負(fù)離子切換測定豆芽中4種植物生長調(diào)節(jié)劑殘留量.武夷科學(xué)，31：190-196.

Determination of 4 kinds of plant growth regulator residues in bean sprouts by

positive and negative ion switch of HPLC-MS-MS

Yi-Ting WEI

(InspectionandQuarantineTechnologyCenter,XiamenEntry-ExitInspection

andQuarantineBureau,Xiamen,Fujian361100,China)

Abstract:A method was developed for the simultaneous detection of 4 plant growth regulator residues in bean sprouts by positive and negative ion of HPLC-MS-MS. The samples added by a small amount of Sodium sulfate were extracted with Acetonitrile containing 1% Acetic acid (V/V), and purified with QuEChERS (PSA+C18). By the ion source of ESI, the positive and negative ion switch was detected, the retention time and the characteristic ion pair were qualitative, and the external standard method was quantitative. The results showed that the calibration curves of 4 kinds of materials tested were good linearity in the range of 10-200 μg/L, and the correlation coefficients of quantitative ion pair were more than 0.9990. The method quantitative limit (S/N=10) of Gibberellin was 20 μg/kg, the other three were 2.5-5.0 μg/kg, and the average recoveries were 81.3%-102.5%. In this paper, a method for simultaneous detection of 4 plant growth regulator residues by positive and negative ion switch in the Liquid tandem mass spectrometer can be used for the simultaneous determination of a needle into the samples. The method is simple and effective,which can meet the requirements for the determination of 4 plant growth regulator residues in bean sprouts.

Key words:bean sprout； high performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry (HPLC-MS-MS)； plant growth regulators

中圖分類號:O657.63;TS255.7

文獻(xiàn)標(biāo)識碼:A

文章編號：1001-4276-(2015)01-0190-07

作者簡介：魏一婷(1986-)，女，學(xué)士。研究方向：食品安全檢測。Email：270607045@qq.com。

收稿日期：2015-09-09; 發(fā)表日期：2015-10-31