• <tr id="yyy80"></tr>
  • <sup id="yyy80"></sup>
  • <tfoot id="yyy80"><noscript id="yyy80"></noscript></tfoot>
  • 99热精品在线国产_美女午夜性视频免费_国产精品国产高清国产av_av欧美777_自拍偷自拍亚洲精品老妇_亚洲熟女精品中文字幕_www日本黄色视频网_国产精品野战在线观看 ?

    香蕉束頂病毒(BBTV)的快速提取檢測(cè)方法

    2015-02-25 01:59:24張煜隆劉小娟
    武夷科學(xué) 2015年0期
    關(guān)鍵詞:快速檢測(cè)

    江 沄, 孫 薇, 張煜隆,2, 劉小娟,2

    (1.福建農(nóng)林大學(xué)植物保護(hù)學(xué)院, 福建 福州 350002;

    2.福建省植物病毒學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室, 福建 福州 350002)

    香蕉束頂病毒(BBTV)的快速提取檢測(cè)方法

    江沄1, 孫薇1, 張煜隆1,2, 劉小娟1,2

    (1.福建農(nóng)林大學(xué)植物保護(hù)學(xué)院, 福建 福州 350002;

    2.福建省植物病毒學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室, 福建 福州 350002)

    摘要:香蕉束頂病毒(Banana Bunchy Top Virus,BBTV)是香蕉上一種危害嚴(yán)重但又難以防治的病毒。目前只能通過及時(shí)鏟除染病植株來控制傳播,因此快速有效的病毒檢測(cè)技術(shù)是防治BBTV的關(guān)鍵。BBTV為單鏈環(huán)狀DNA病毒,本試驗(yàn)采用優(yōu)化后的DNA提取方法提取感病的香蕉樣品的DNA,并用特異性引物對(duì)提取產(chǎn)物進(jìn)行PCR檢測(cè)。結(jié)果顯示本試驗(yàn)優(yōu)化的方法操作方便、用時(shí)短,并且提取產(chǎn)物能夠用于BBTV快速檢測(cè),從而為BBTV的快速檢測(cè)提供新的方法。

    關(guān)鍵詞:香蕉束頂病毒; DNA提??; 快速檢測(cè)

    香蕉束頂病毒(Banana bunchy top virus,BBTV)是香蕉生產(chǎn)中的一個(gè)最嚴(yán)重的病毒,由它引起的香蕉束頂病威脅著世界上25%的香蕉種植區(qū)(Dale,1987),感染BBTV的香蕉果實(shí)小而且少,甚至不能結(jié)實(shí),該病發(fā)生嚴(yán)重的地區(qū)香蕉生產(chǎn)通常無利可圖。香蕉束頂病毒是單鏈環(huán)狀DNA病毒,目前一致認(rèn)為,BBTV為18-20 nm等軸的二十面體結(jié)構(gòu),基因組至少是由6個(gè)大小約1.0-1.1 kb的環(huán)狀ssDNA組分組成,分別命名1、2、3、4、5、6組份(Hardingetal,1991),都由編碼區(qū)和非編碼區(qū)兩部分構(gòu)成(Xieetal,1995;Beethametal,1999;Burnsetal,1995)。

    香蕉主要通過組培技術(shù)進(jìn)行無性繁殖,一旦種苗帶毒,香蕉病毒的傳播和危害就會(huì)加劇。種植區(qū)一旦有毒株應(yīng)該及時(shí)清除,否則發(fā)病植株會(huì)成為病源使病毒在整個(gè)種植區(qū)蔓延。因此,快速有效的BBTV檢測(cè)技術(shù)是防治BBTV的關(guān)鍵。目前,國(guó)內(nèi)檢測(cè)香蕉病毒的方法主要有酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定(ELISA)法(范國(guó)成等,1999)、PCR法(周莉娟等,2001)及免疫PCR等,國(guó)外有利用多重免疫捕捉PCR檢測(cè)香蕉病毒病的報(bào)道。一些植物病毒的檢測(cè)用到的膠體金免疫層析試紙條法雖然操作方便、反應(yīng)靈敏,但目前還沒有研發(fā)用于檢測(cè)BBTV的試紙條。

    由于香蕉葉片富含多酚、多糖等次生代謝物,因此使用普通的DNA提取方法很難將其基因組DNA分離純化。目前提取富含多酚多糖的香蕉DNA的方法有基于SDS基礎(chǔ)上的改良方法(柴娟等,2014);SDS、CTAB和PVP法(杜道林等,2003);Paterson等人在1993年提出的以多酚物質(zhì)棉花為材料的DNA提取方法等。

    為了提高檢測(cè)香蕉束頂病的效率,本試驗(yàn)通過優(yōu)化DNA的提取方法,建立了一種快速且操作方便的香蕉束頂病的檢測(cè)方法,為生產(chǎn)實(shí)踐提供有力的技術(shù)保障。

    1 試驗(yàn)材料

    1.1試驗(yàn)試劑

    根據(jù)本實(shí)驗(yàn)室人員研發(fā)的專利申報(bào)號(hào)為:201410492569的快速無毒DNA提取方法進(jìn)行優(yōu)化改進(jìn)后開發(fā)的北京德曼特爾生物科技有限公司快速無毒植物基因組DNA提取試劑盒、10×Loading bufer購自寶生物工程(大連)有限公司、2×Es Taq Master Mix 購自北京康為世紀(jì)生物科技有限公司、引物由南京金斯瑞生物科技有限公司合成。

    1.2試驗(yàn)儀器

    5417R 臺(tái)式離心機(jī)(Eppendorf)、T3000 PCR 熱循環(huán)儀(Biometra)、DYY-6C 電泳儀、GeneGenius 凝膠成像系統(tǒng)、核酸蛋白測(cè)定儀(Eppendorf) 、DK-8D 電熱恒溫水槽等。

    1.3樣品

    香蕉病株及香蕉鍵株。

    2試驗(yàn)方法

    2.1模板DNA的提取

    本試驗(yàn)中DNA的提取皆使用購自北京德曼特爾生物科技有限公司快速無毒植物基因組DNA提取試劑盒,并根據(jù)香蕉樣品的特性,對(duì)提取過程進(jìn)行優(yōu)化。

    具體操作步驟如下:

    (1)將洗脫緩沖液EB和緩沖液PL1在65 ℃水浴鍋中預(yù)熱。

    (2)將200 μL柱處理液CL加入DNA吸附柱SC,10 000 rpm室溫離心1 min,棄廢液。

    (3)取一定重量的樣品剪碎后放入2mL離心管,并加入滅過菌的4 mm小鋼珠2粒。將樣品用液氮速凍后放入鋁盒中上下晃動(dòng)10 s。重復(fù)4-6次至植物組織成粉末狀。(注:若樣品打成粉末狀后沒有馬上加緩沖液PL1,則需將樣品放置于4 ℃冰箱中保存,以免影響提取效果。)

    (4)加入100 μL 65 ℃預(yù)熱的緩沖液PL1,室溫放置2-3 min,期間不斷上下顛倒混勻數(shù)次,保證緩沖液PL1充分浸潤(rùn)樣品。

    (5)加入600 μL緩沖液PL2,室溫放置2-3 min,期間不斷上下顛倒混勻數(shù)次。

    (6)用磁鐵吸出離心管內(nèi)的鋼珠,10 000 rpm室溫離心1 min。

    (7)轉(zhuǎn)移上清液到步驟2處理過的DNA吸附柱SC中,10 000 rpm室溫離心1 min,棄廢液。

    (8) 往DNA吸附柱SC中加入300 μL緩沖液PL2 ,10 000 rpm室溫離心1 min,棄廢液。

    (9) 往DNA吸附柱SC中加入650 μL漂洗液WB ,10 000 rpm室溫離心1 min,棄廢液。

    (10)10 000 rpm室溫離心1 min。

    (11)把DNA吸附柱SC轉(zhuǎn)移到新的1.5 mL離心管中,開蓋,室溫放置2 min,加入30 μL預(yù)熱的洗脫緩沖液EB,靜置2 min。

    (12) 洗脫DNA,12 000 rpm室溫離心1 min。

    2.2PCR檢測(cè)

    用2.1中方法提取出的帶病香蕉總DNA為模板,采用譚小勇等(2010)的 BBTV檢測(cè)引物P1:ATGTGGTATGCTGGATGTTC ,P2 :GTTCATATTTCCCGCTTTGA 進(jìn)行PCR檢測(cè),反應(yīng)體系為:DNA模板2 μL 、P1和P2各1 μL 、 2×Es Taq Master Mix 10 μL 、RNase-free ddH2O 6 μL 。PCR反應(yīng)程序?yàn)椋侯A(yù)變性94 ℃ 6 min、變性94 ℃ 35 s、退火56 ℃ 30 s、延伸72 ℃ 38 s,運(yùn)行35個(gè)循環(huán)后, 72 ℃ 10 min終延伸,16 ℃保存。

    3試驗(yàn)結(jié)果

    3.1香蕉組織基因組DNA提取結(jié)果

    使用優(yōu)化后的快速無毒植物基因組DNA提取方法提取20mg、30mg、50mg、70mg、100mg新鮮香蕉葉片,取10μL電泳結(jié)果如圖1所示,濃度及OD值如表1所示。電泳圖顯示不同樣品的泳道都有清晰的基因組DNA條帶,OD值結(jié)果顯示提取產(chǎn)物的濃度和純度都比較高,說明本文使用的DNA提取方法能有效的提取香蕉的DNA。SDS、CTAB和PVP法中SDS法提取量最大(杜道林等,2003)。因此將SDS法提取的香蕉葉片DNA同本試驗(yàn)優(yōu)化的DNA提取方法所提取的香蕉葉片DNA作比較,取10 μL電泳結(jié)果如圖2所示??梢姳驹囼?yàn)優(yōu)化的方法提取的DNA電泳條帶要比SDS法提取的DNA亮,說明本文的DNA提取效果要好于SDS法的提取效果。

    表1 不同重量香蕉樣品DNA提取結(jié)果Table1 DNAextractionresultsofdifferentweightbananasamples樣品重量濃度(ng/μL)OD值20mg108.11.9730mg121.11.9950mg135.81.8470mg124.32.02100mg160.82.01

    3.2PCR檢測(cè)BBTV

    根據(jù)3.1中的提取結(jié)果顯示,重量為50 mg的香蕉葉提取效果最好,根據(jù)實(shí)際操作情況,50 mg的量的香蕉葉在試驗(yàn)操作中最為方便,因此在本試驗(yàn)PCR檢測(cè)中使用50 mg的量提取DNA作為模板進(jìn)行檢測(cè)。

    染病植株新鮮葉片、新鮮莖稈、枯萎葉片、枯萎莖稈PCR檢測(cè)結(jié)果如圖3所示。由于枯葉、枯桿較鮮葉、鮮桿水分散失較多,因此在取樣時(shí)只需取同50 mg的鮮葉或鮮桿面積相同即可。

    圖1不同重量香蕉樣品DNA提取的凝膠電泳 圖2兩種方法DNA提取的凝膠電泳

    Figure 1Gel electrophoresis of DNA extraction of Figure 2Gel electrophoresis of DNA

    different weight banana samples extraction by two methods

    M.DNA Marker III; 1-5.重量分別為20 mg、30 mg、 M.DNA Marker III;1、2.SDS法提取的香蕉葉片DNA;

    50 mg、70 mg、100 mg新鮮香蕉葉片DNA 3、4.本試驗(yàn)方法提取的香蕉葉片DNA

    圖3 PCR產(chǎn)物的凝膠電泳Figure 3 Gel electrophoresis of PCR products1、2.新鮮葉片PCR產(chǎn)物; 3、4.新鮮莖稈PCR產(chǎn)物;5、6.枯萎葉片PCR產(chǎn)物; 7、8.枯萎莖稈PCR產(chǎn)物

    圖4 不同模板的PCR的凝膠電泳Figure 4 Gel electrophoresis of PCR with different templatesM.DNA Marker III; 1-3.模板為SDS法提取的染病香蕉葉片DNA; 4-6.模板為SDS法提取的健康香蕉葉片DNA; 7-9.模板為本文的DNA提取方法提取的染病香蕉葉片DNA; 10-12.模板為本文的DNA提取方法提取的健康香蕉葉片DNA

    用SDS法和本文的DNA提取方法提取染病香蕉葉片DNA和健康香蕉葉片DNA,并以之為模板進(jìn)行PCR,對(duì)比結(jié)果如圖4所示。可見兩種方法的PCR結(jié)果基本一致,并且以本文的DNA提取方法提取的DNA為模板的PCR電泳條帶要稍亮一些,說明本文優(yōu)化的DNA提取方法能夠提取出質(zhì)量好的香蕉DNA。

    4結(jié)果分析

    優(yōu)化后的快速無毒植物基因組DNA提取方法提取出的香蕉基因組DNA經(jīng)過電泳后,條帶清晰;從表1的數(shù)據(jù)來看,五個(gè)樣品的濃度都超過100 ng/μl,OD值幾乎都在1.8-2.0之間,或是極為接近這一區(qū)間,這樣的試驗(yàn)結(jié)果說明此方法提取效率很高同時(shí)提取質(zhì)量還很好。

    使用優(yōu)化后的快速無毒植物基因組DNA提取方法提取出的香蕉基因組DNA作為模板進(jìn)行的PCR結(jié)果也十分理想,不僅得到了大小一致的條帶,而且條帶清晰,尤其是新鮮葉片和新鮮莖稈的結(jié)果十分理想,而枯萎葉片和枯萎莖稈的條帶沒有新鮮的亮,但也大小正確,同樣能都檢測(cè)出植株帶病。

    5討論

    由于BBTV沒有具體的治療方法,且危害不同的國(guó)家地區(qū),危害范圍廣,造成了極大的經(jīng)濟(jì)損失。目前BBTV的預(yù)防方法主要是通過組培技術(shù)生產(chǎn)無毒種苗。及時(shí)清除種植區(qū)的毒株,防止發(fā)病植株成為病源使病毒在整個(gè)種植區(qū)蔓延。因而快速、有效并準(zhǔn)確的檢測(cè)出BBTV在生產(chǎn)實(shí)踐中非常重要。本試驗(yàn)就是在此背景下優(yōu)化出一種快速、有效、且準(zhǔn)確的檢測(cè)方法。

    本試驗(yàn)在DNA的提取上采用了快速無毒植物基因組DNA提取試劑盒的方法,同時(shí)在試驗(yàn)過程中針對(duì)香蕉的植物學(xué)特性對(duì)其中的一些操作進(jìn)行了合理的優(yōu)化,比如:在打碎樣品時(shí)不能讓樣品離開液氮在鋁盒中晃動(dòng)太久,否則溫度升高,樣品中的多酚多糖等物質(zhì)會(huì)影響DNA的提取質(zhì)量。因此縮短單次打碎樣品的時(shí)間,提高打碎樣品的次數(shù)。同樣,若打成粉末狀的樣品不能及時(shí)進(jìn)行后續(xù)步驟,也應(yīng)低溫保存;加入緩沖液PL1后多放置一分鐘左右,使其裂解更為充分;加入600 μL緩沖液PL2后多放置1 min左右,能夠更加充分的去除多酚多糖等。從而使該DNA提取方法更適合香蕉基因組DNA的提取。

    在傳統(tǒng)的檢測(cè)方法中,ELISA使用的抗體本質(zhì)是蛋白質(zhì),香蕉中所含的單寧會(huì)使蛋白質(zhì)變性,從而在很大程度上影響試驗(yàn)結(jié)果,降低準(zhǔn)確性;PCR檢測(cè)離不開的DNA需要從香蕉中提取出來。普通的DNA提取方法很難從富含多酚多糖的香蕉中提取出DNA,相對(duì)來說提取效果較好的SDS法、CTAB法也存在高毒、耗費(fèi)時(shí)間長(zhǎng)、液氮研磨易交叉污染等缺陷。本試驗(yàn)中采用并優(yōu)化的快速無毒植物基因組DNA提取方法經(jīng)過試驗(yàn)證明有如下幾個(gè)優(yōu)點(diǎn):一是能很好的克服多酚多糖的干擾提取出高質(zhì)量的香蕉基因組DNA;二是本方法使用的是2 mL離心管配合鋼珠打碎樣品,可以很好的避免液氮研磨交叉污染的問題;三是能在香蕉枯萎的葉片和莖稈中提取出基因組DNA,并且能夠進(jìn)行PCR檢測(cè)。而感染BBTV植株會(huì)出現(xiàn)枯死癥狀,那么通過枯死的部位也能夠進(jìn)行檢測(cè);四是試驗(yàn)步驟簡(jiǎn)單、耗時(shí)短、效率高。

    本試驗(yàn)優(yōu)化的快速提取檢測(cè)香蕉束頂病的方法通過試驗(yàn)證明能夠快速、有效、且準(zhǔn)確的提取并檢測(cè)出香蕉束頂病。

    參考文獻(xiàn)

    柴娟,馮仁軍,史后蕊,任夢(mèng)云,王靜毅,張銀東.2014.一種快速提取香蕉葉片總核酸、總RNA和總DNA的新方法.熱帶作物學(xué)報(bào),35(1):104-109.

    杜道林,馬文儒,蘇 杰,周 鵬,鄭學(xué)勤.2003.SDS、CTAB和PVP法提取香蕉基因組DNA的比較研究.海南師范學(xué)院學(xué)報(bào)(自然科學(xué)版),1671-8747.

    范國(guó)成,陳菁瑛,周樂峰,吳如健,陳景耀.1999.應(yīng)用酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定技術(shù)檢測(cè)香蕉束頂病毒.福建農(nóng)業(yè)學(xué)報(bào),14(1):19-22.

    譚小勇,阮小蕾,吳麗婷,翟國(guó)會(huì),李華平.2010.香蕉3種病毒的多重PCR檢測(cè)體系.園藝學(xué)報(bào),37(5):829-834.

    肖火根,胡晉生.1999.香蕉束頂病毒PCR檢測(cè)技術(shù)研究.華南農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào),20(1):5-8.

    張海保,朱西儒,劉鴻先.1997.香蕉束頂病毒(BBTV)侵染對(duì)寄主內(nèi)源激素的影響.植物病理學(xué)報(bào),27(1):79-83.

    張曉雷.2009.四種檢疫性植物病毒的膠體金免疫層析試紙條的研究.安徽農(nóng)業(yè)大學(xué)碩士學(xué)位論文.

    周莉娟,鄭偉文.2001.PCR法檢測(cè)香蕉束頂病毒.福建農(nóng)業(yè)學(xué)報(bào),16(4):45-48.

    Beetham PR,Harding RM,Dale JL.1999.Banana bunchy top virus DNA-2 to -6 are monocistronic.Arch.Virol.,(144): 89-105.

    Burns TM,Harding RM,Dale JL.1995.The genome organiza-tion of banana bunchy top virus: analysis of six ssDNA components.J.Gen.Virol.,76(6): 1471-1482.

    Dale JL.1987.Banana bunchy top:An economically important tropical plant virus disease.Advances in Virus Research,33:301-325.

    Hafner GJ,Harding RM,Dale JL.1997.A DNA primer associ-ated with banana bunchy top virus.Journal of General Virology,78(Pt 2): 479-486.

    Harding RM,Burns TM,Dale JL .1991.Virus-like particles as-sociated with banana bunchy top disease contain small single-stranded DNA.J.Gen.Virol.,72(Pt 2):225-230.

    Paterson AH,Brubaker CL,Wendel JF.1993.A rapid method for extraction of cotton(Gossypiumspp.)genomic DNA suitable for RFLP or PCR analysis.Plant Molecular Biology Reporter,11(2): 122-127.

    Xie WS,Hu JS.1995.Molecular cloning,sequence-analysis,and detection of banana bunchy top virus in Hawaii.Phytopathology,85: 339-347.

    (責(zé)任編輯:陳曉雯)

    江沄,孫薇,張煜隆,劉小娟.2015.香蕉束頂病毒(BBTV)的快速提取檢測(cè)方法.武夷科學(xué),31:170-175.

    A rapid method for extraction and detection of

    Banana Bunchy Top Virus (BBTV)

    Yun JIANG1, Wei SUN1, Yu-Long ZHANG1,2, Xiao-Juan LIU1,2

    (1.CollegeofPlantProtection,FujianAgricultureandForestryUniversity,Fuzhou,Fujian350002,China;

    2.FujianProvincalKeyLaboratoryofPlantVirology,Fuzhou,Fujian350002,China)

    Abstract:Banana Bunchy Top Virus (BBTV)is a serious and difficult-treating virus in banana. The best way to control BBTV is rooting out virus-effected plants, and detecting the virus rapidly and efficiently becomes very important. BBTV is a single stranded ring DNA virus. In this experiment DNA of banana samples was extracted by a optimized method, and then detection of BBTV by PCR . The results showed that the method optimized is easy to be operated with short time, and the extracted products can be used for the rapid detection of BBTV, which provides a new method for the rapid detection of BBTV.

    Key words:Banana Bunchy Top Virus (BBTV); DNA extraction; rapid detection

    中圖分類號(hào):Q781

    文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼:A

    文章編號(hào):1001-4276-(2015)01-0170-06

    作者簡(jiǎn)介:江沄(1994-),女,學(xué)士。Email:243002689@qq.com。

    基金項(xiàng)目:福建省自然科學(xué) (2010J01073)。

    收稿日期:2015-03-03; 發(fā)表日期:2015-10-31

    猜你喜歡
    快速檢測(cè)
    免疫檢測(cè)技術(shù)在中藥質(zhì)量快速評(píng)價(jià)中的應(yīng)用
    低溫肉制品中3 種食源性致病菌多重聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)快速檢測(cè)方法的建立
    肉類研究(2017年2期)2017-03-13 15:43:43
    基于近紅外光譜法的藜麥脂肪含量快速檢測(cè)
    利福平和異煙肼耐藥基因突變快速檢測(cè)方法在結(jié)核病中的應(yīng)用
    淺談化學(xué)發(fā)光免疫分析方法與應(yīng)用進(jìn)展
    淺析食品安全檢測(cè)中關(guān)于微生物快速檢測(cè)的方法
    上杭縣近年果蔬農(nóng)藥殘留快速檢測(cè)結(jié)果分析
    大腸菌群冷水凝膠快速檢測(cè)試紙片的研發(fā)
    表面增強(qiáng)拉曼光譜法定量檢測(cè)食品中香豆素
    水相分子印跡光子晶體水凝膠傳感器檢測(cè)尿液中的痕量嗎啡
    男女之事视频高清在线观看| 真人一进一出gif抽搐免费| 久久久国产成人精品二区| 中文字幕久久专区| 麻豆久久精品国产亚洲av| 精品国产三级普通话版| a级毛片在线看网站| 亚洲欧美精品综合久久99| 可以在线观看毛片的网站| 熟女电影av网| 1024香蕉在线观看| www.www免费av| 美女扒开内裤让男人捅视频| 国产精品一区二区精品视频观看| 久久久国产欧美日韩av| 久久久精品欧美日韩精品| 成人av在线播放网站| 两个人看的免费小视频| 不卡一级毛片| 国产黄a三级三级三级人| 毛片女人毛片| 脱女人内裤的视频| 日本免费一区二区三区高清不卡| 色综合站精品国产| 久久久久性生活片| 少妇的逼水好多| av在线蜜桃| 精品乱码久久久久久99久播| 一本一本综合久久| 一级毛片精品| 18禁观看日本| 国产精品自产拍在线观看55亚洲| 女人被狂操c到高潮| 好看av亚洲va欧美ⅴa在| 亚洲 国产 在线| 亚洲精品粉嫩美女一区| 国产淫片久久久久久久久 | a在线观看视频网站| svipshipincom国产片| 日韩精品中文字幕看吧| 久久99热这里只有精品18| 亚洲av第一区精品v没综合| 色视频www国产| 国产精品av视频在线免费观看| 黄色视频,在线免费观看| 国产精品久久视频播放| 亚洲成av人片免费观看| 亚洲成a人片在线一区二区| 校园春色视频在线观看| 精品福利观看| 亚洲av美国av| 99在线视频只有这里精品首页| 怎么达到女性高潮| www.自偷自拍.com| 成在线人永久免费视频| 18禁裸乳无遮挡免费网站照片| 18美女黄网站色大片免费观看| 亚洲熟妇熟女久久| 99国产精品一区二区蜜桃av| 久99久视频精品免费| 欧洲精品卡2卡3卡4卡5卡区| 欧美大码av| 窝窝影院91人妻| 国产精品99久久久久久久久| av福利片在线观看| 亚洲一区二区三区色噜噜| 日韩成人在线观看一区二区三区| 久久中文看片网| 日本免费a在线| 久久午夜亚洲精品久久| 成人鲁丝片一二三区免费| 亚洲天堂国产精品一区在线| 色综合婷婷激情| 亚洲熟女毛片儿| 欧美av亚洲av综合av国产av| 亚洲av免费在线观看| 国产精品女同一区二区软件 | 欧美日韩一级在线毛片| 欧美国产日韩亚洲一区| 国内精品美女久久久久久| 亚洲18禁久久av| 亚洲欧美日韩高清专用| 在线国产一区二区在线| 91av网一区二区| 久久久水蜜桃国产精品网| 19禁男女啪啪无遮挡网站| 久久久久久久久中文| 亚洲av中文字字幕乱码综合| 国产私拍福利视频在线观看| 久久久久久大精品| 嫩草影院入口| 国产成人aa在线观看| 法律面前人人平等表现在哪些方面| 成人一区二区视频在线观看| 国产精品国产高清国产av| 精品一区二区三区视频在线观看免费| 成人三级黄色视频| 免费高清视频大片| 最近最新中文字幕大全免费视频| av女优亚洲男人天堂 | 身体一侧抽搐| 一a级毛片在线观看| or卡值多少钱| 毛片女人毛片| 国产伦在线观看视频一区| 国产精品久久久av美女十八| 亚洲五月天丁香| 亚洲天堂国产精品一区在线| 精品电影一区二区在线| 偷拍熟女少妇极品色| 欧美成人免费av一区二区三区| 手机成人av网站| 男女做爰动态图高潮gif福利片| 国模一区二区三区四区视频 | 亚洲中文av在线| 免费在线观看成人毛片| 欧美日韩瑟瑟在线播放| 久久天堂一区二区三区四区| 中文字幕精品亚洲无线码一区| 久久久久免费精品人妻一区二区| 久久精品国产亚洲av香蕉五月| 18禁裸乳无遮挡免费网站照片| 免费在线观看日本一区| 搡老岳熟女国产| 一个人观看的视频www高清免费观看 | 岛国视频午夜一区免费看| 亚洲成人精品中文字幕电影| 日日干狠狠操夜夜爽| av黄色大香蕉| 人人妻,人人澡人人爽秒播| 免费看美女性在线毛片视频| 亚洲国产中文字幕在线视频| 在线观看66精品国产| 亚洲精品美女久久久久99蜜臀| 国产精品美女特级片免费视频播放器 | 亚洲美女黄片视频| 99久久无色码亚洲精品果冻| 看免费av毛片| 国产三级中文精品| 成人午夜高清在线视频| 啦啦啦韩国在线观看视频| 女人高潮潮喷娇喘18禁视频| 日本一二三区视频观看| 国产伦在线观看视频一区| av欧美777| 国产成人影院久久av| 日日摸夜夜添夜夜添小说| 男女午夜视频在线观看| 禁无遮挡网站| 熟妇人妻久久中文字幕3abv| 日韩欧美一区二区三区在线观看| 99久久国产精品久久久| 麻豆成人av在线观看| 九色成人免费人妻av| 欧美黄色淫秽网站| av在线蜜桃| 欧美性猛交╳xxx乱大交人| 一卡2卡三卡四卡精品乱码亚洲| 麻豆成人av在线观看| 久久香蕉国产精品| 亚洲精品乱码久久久v下载方式 | a级毛片a级免费在线| 狂野欧美激情性xxxx| 国产视频一区二区在线看| 国产一区二区激情短视频| 成人无遮挡网站| 法律面前人人平等表现在哪些方面| 免费在线观看视频国产中文字幕亚洲| 99久久精品国产亚洲精品| 精品午夜福利视频在线观看一区| 精品久久久久久久久久久久久| 一本综合久久免费| 欧美+亚洲+日韩+国产| 国产av不卡久久| 性色avwww在线观看| 国产成人啪精品午夜网站| 国产精品乱码一区二三区的特点| 欧美日本亚洲视频在线播放| 琪琪午夜伦伦电影理论片6080| 国产真实乱freesex| 91老司机精品| 全区人妻精品视频| 午夜免费观看网址| 欧美在线一区亚洲| 成人亚洲精品av一区二区| 不卡av一区二区三区| 国产精品一及| 婷婷丁香在线五月| 一进一出抽搐gif免费好疼| 18禁美女被吸乳视频| 亚洲av成人精品一区久久| 村上凉子中文字幕在线| 真人一进一出gif抽搐免费| 国产免费男女视频| 久久久水蜜桃国产精品网| 99久国产av精品| 欧美三级亚洲精品| 欧美在线一区亚洲| 99国产精品99久久久久| 久久中文看片网| 欧美色欧美亚洲另类二区| 在线观看66精品国产| or卡值多少钱| 高潮久久久久久久久久久不卡| 欧美av亚洲av综合av国产av| 久99久视频精品免费| 亚洲av五月六月丁香网| 久久精品综合一区二区三区| 制服人妻中文乱码| 啦啦啦免费观看视频1| 真人一进一出gif抽搐免费| 老司机深夜福利视频在线观看| 亚洲,欧美精品.| aaaaa片日本免费| 亚洲人成网站在线播放欧美日韩| 一夜夜www| 亚洲人成网站高清观看| 国产伦精品一区二区三区视频9 | 99久久国产精品久久久| 国产极品精品免费视频能看的| 国产黄色小视频在线观看| 观看免费一级毛片| 国产不卡一卡二| 精品熟女少妇八av免费久了| 女同久久另类99精品国产91| 精品免费久久久久久久清纯| 少妇的逼水好多| 国产欧美日韩一区二区三| 亚洲欧美激情综合另类| 欧美一区二区精品小视频在线| 免费搜索国产男女视频| 国产成+人综合+亚洲专区| 黄片小视频在线播放| 欧美丝袜亚洲另类 | 嫁个100分男人电影在线观看| 国产激情偷乱视频一区二区| 美女黄网站色视频| 校园春色视频在线观看| 婷婷精品国产亚洲av在线| 久久久久九九精品影院| 老司机深夜福利视频在线观看| АⅤ资源中文在线天堂| 一本精品99久久精品77| 中文字幕人成人乱码亚洲影| 国产日本99.免费观看| 中文亚洲av片在线观看爽| 免费看美女性在线毛片视频| 在线国产一区二区在线| 中文字幕人妻丝袜一区二区| 级片在线观看| 亚洲成人中文字幕在线播放| 免费在线观看亚洲国产| 18禁观看日本| 精品一区二区三区视频在线 | 久久99热这里只有精品18| av片东京热男人的天堂| 亚洲专区中文字幕在线| 亚洲欧美日韩高清专用| 亚洲中文字幕日韩| 中亚洲国语对白在线视频| 国产亚洲精品一区二区www| 波多野结衣高清作品| 色av中文字幕| 欧美av亚洲av综合av国产av| 国产视频内射| 嫩草影视91久久| 久久性视频一级片| 亚洲专区国产一区二区| 最近视频中文字幕2019在线8| 亚洲天堂国产精品一区在线| 久久精品国产亚洲av香蕉五月| 欧美黄色淫秽网站| av中文乱码字幕在线| 久久久色成人| 午夜福利在线观看免费完整高清在 | 日韩欧美 国产精品| 啪啪无遮挡十八禁网站| 757午夜福利合集在线观看| 综合色av麻豆| 国产伦精品一区二区三区四那| 国产精品av视频在线免费观看| 夜夜夜夜夜久久久久| 国内精品美女久久久久久| 久久亚洲真实| 激情在线观看视频在线高清| 日本a在线网址| 亚洲av中文字字幕乱码综合| 久久久久久久久久黄片| 国产aⅴ精品一区二区三区波| www日本黄色视频网| 久久久久性生活片| 日韩欧美国产一区二区入口| 欧美日韩一级在线毛片| 一区二区三区高清视频在线| 香蕉国产在线看| 亚洲精品一卡2卡三卡4卡5卡| 99国产综合亚洲精品| 成人欧美大片| 亚洲熟妇中文字幕五十中出| 久久久精品大字幕| 99精品欧美一区二区三区四区| 91麻豆av在线| 亚洲国产精品999在线| 99热6这里只有精品| 悠悠久久av| 黄片大片在线免费观看| 亚洲成人免费电影在线观看| 噜噜噜噜噜久久久久久91| 国产成人一区二区三区免费视频网站| tocl精华| 美女被艹到高潮喷水动态| 午夜福利高清视频| 亚洲九九香蕉| 在线国产一区二区在线| 国产精品爽爽va在线观看网站| 亚洲欧美日韩高清在线视频| 日韩欧美三级三区| xxx96com| 天堂动漫精品| 一级毛片高清免费大全| 国产午夜精品久久久久久| 人妻久久中文字幕网| 色哟哟哟哟哟哟| 久久精品国产亚洲av香蕉五月| 欧美日本亚洲视频在线播放| 极品教师在线免费播放| 老司机午夜福利在线观看视频| www.自偷自拍.com| 美女 人体艺术 gogo| 亚洲人成网站在线播放欧美日韩| 麻豆av在线久日| 国产乱人伦免费视频| 最近最新中文字幕大全免费视频| 色老头精品视频在线观看| 国内毛片毛片毛片毛片毛片| 亚洲一区二区三区不卡视频| 亚洲性夜色夜夜综合| 丁香六月欧美| 国产精品日韩av在线免费观看| 99热这里只有是精品50| 亚洲精品美女久久久久99蜜臀| 两个人看的免费小视频| 亚洲熟妇中文字幕五十中出| 亚洲 欧美一区二区三区| 亚洲国产欧洲综合997久久,| 免费在线观看日本一区| 亚洲国产欧美人成| 波多野结衣巨乳人妻| 国产一区二区在线av高清观看| 国产在线精品亚洲第一网站| 长腿黑丝高跟| 啦啦啦韩国在线观看视频| 亚洲精品美女久久久久99蜜臀| 男女那种视频在线观看| 天堂√8在线中文| 欧美一级a爱片免费观看看| 日韩欧美三级三区| 中文字幕久久专区| 国产一区二区激情短视频| 成人一区二区视频在线观看| 久久精品综合一区二区三区| 久久精品国产综合久久久| 露出奶头的视频| 精品久久久久久久人妻蜜臀av| 国产午夜精品久久久久久| 成人一区二区视频在线观看| 欧美性猛交黑人性爽| 丁香六月欧美| 黄色视频,在线免费观看| 亚洲国产日韩欧美精品在线观看 | 欧美xxxx黑人xx丫x性爽| 国产精品1区2区在线观看.| 亚洲精华国产精华精| 国产精品一区二区精品视频观看| 十八禁人妻一区二区| 夜夜看夜夜爽夜夜摸| 午夜福利视频1000在线观看| 国产高潮美女av| 成人性生交大片免费视频hd| 亚洲 国产 在线| x7x7x7水蜜桃| 丁香欧美五月| 日本在线视频免费播放| 精品乱码久久久久久99久播| 国产精品电影一区二区三区| 中文字幕熟女人妻在线| 两性午夜刺激爽爽歪歪视频在线观看| 亚洲av熟女| 欧美日韩精品网址| 久久久久国内视频| 成年女人看的毛片在线观看| 欧美日韩福利视频一区二区| 人人妻人人澡欧美一区二区| 成年女人毛片免费观看观看9| 18禁黄网站禁片免费观看直播| 成人三级做爰电影| 久久精品aⅴ一区二区三区四区| www.精华液| 婷婷六月久久综合丁香| 中文在线观看免费www的网站| 日韩欧美三级三区| 丁香六月欧美| 免费观看人在逋| 日韩国内少妇激情av| 久久久久久久精品吃奶| 亚洲熟女毛片儿| 精品欧美国产一区二区三| 三级国产精品欧美在线观看 | 国产真人三级小视频在线观看| 国产精品久久电影中文字幕| 日韩欧美三级三区| 天堂av国产一区二区熟女人妻| 中文字幕熟女人妻在线| 在线十欧美十亚洲十日本专区| 免费搜索国产男女视频| 动漫黄色视频在线观看| 女警被强在线播放| 亚洲自拍偷在线| 校园春色视频在线观看| 在线免费观看的www视频| 亚洲av成人精品一区久久| 变态另类丝袜制服| 在线国产一区二区在线| 最近最新中文字幕大全免费视频| 女同久久另类99精品国产91| 在线观看日韩欧美| 亚洲真实伦在线观看| 欧美一级毛片孕妇| 亚洲激情在线av| 91老司机精品| 亚洲av电影在线进入| 国产伦在线观看视频一区| av视频在线观看入口| 久久国产精品影院| 亚洲国产色片| 国产三级在线视频| 国产精品 欧美亚洲| 在线免费观看的www视频| 国产激情欧美一区二区| 欧美日韩乱码在线| 精品不卡国产一区二区三区| 亚洲人成电影免费在线| 2021天堂中文幕一二区在线观| 精品久久蜜臀av无| 99久久精品热视频| 亚洲 欧美一区二区三区| 天天添夜夜摸| 国产黄片美女视频| 精品欧美国产一区二区三| 日韩欧美国产一区二区入口| 人妻久久中文字幕网| 久久精品国产清高在天天线| 成人一区二区视频在线观看| 在线观看美女被高潮喷水网站 | 精品久久久久久久久久久久久| 亚洲18禁久久av| 色精品久久人妻99蜜桃| 亚洲人成网站在线播放欧美日韩| 国产成人aa在线观看| 久久国产乱子伦精品免费另类| 中出人妻视频一区二区| 精品国产美女av久久久久小说| 国产探花在线观看一区二区| 免费看美女性在线毛片视频| av天堂中文字幕网| 国产美女午夜福利| www日本黄色视频网| 国产aⅴ精品一区二区三区波| 久久香蕉国产精品| 少妇熟女aⅴ在线视频| 这个男人来自地球电影免费观看| 999精品在线视频| 国产视频内射| 国产伦精品一区二区三区视频9 | 国产毛片a区久久久久| 午夜免费激情av| 亚洲 国产 在线| 精品日产1卡2卡| 久久精品国产清高在天天线| 中文字幕高清在线视频| av视频在线观看入口| 精品国产亚洲在线| 在线看三级毛片| 草草在线视频免费看| 高潮久久久久久久久久久不卡| 99国产综合亚洲精品| 黄色日韩在线| 操出白浆在线播放| 色噜噜av男人的天堂激情| 亚洲在线自拍视频| 国产精品av久久久久免费| 黄色日韩在线| 国产麻豆成人av免费视频| 亚洲国产精品999在线| 国产综合懂色| 亚洲av电影在线进入| 精品福利观看| 久99久视频精品免费| 欧美在线黄色| 人妻丰满熟妇av一区二区三区| 嫩草影院精品99| 国产精品99久久99久久久不卡| 午夜精品久久久久久毛片777| 亚洲国产精品sss在线观看| 国产又黄又爽又无遮挡在线| 国产精品自产拍在线观看55亚洲| 在线观看66精品国产| 国产美女午夜福利| av欧美777| 美女被艹到高潮喷水动态| 91在线精品国自产拍蜜月 | 五月玫瑰六月丁香| 好看av亚洲va欧美ⅴa在| 亚洲精华国产精华精| 国产乱人视频| 蜜桃久久精品国产亚洲av| 一二三四社区在线视频社区8| 亚洲自偷自拍图片 自拍| 久久精品亚洲精品国产色婷小说| 午夜福利视频1000在线观看| 村上凉子中文字幕在线| 国产精品 欧美亚洲| 久久天堂一区二区三区四区| 最新美女视频免费是黄的| 国产成年人精品一区二区| svipshipincom国产片| 久久精品夜夜夜夜夜久久蜜豆| 美女扒开内裤让男人捅视频| 精品国产三级普通话版| 99久久精品一区二区三区| 两个人视频免费观看高清| 我的老师免费观看完整版| 91麻豆av在线| 床上黄色一级片| 激情在线观看视频在线高清| 精品熟女少妇八av免费久了| 久久精品夜夜夜夜夜久久蜜豆| 日日摸夜夜添夜夜添小说| 亚洲黑人精品在线| 久久精品人妻少妇| 成年免费大片在线观看| 久久久久久久久久黄片| 99国产精品一区二区三区| 后天国语完整版免费观看| 啦啦啦免费观看视频1| 日本三级黄在线观看| 在线观看一区二区三区| 午夜福利免费观看在线| 99精品在免费线老司机午夜| 国产av不卡久久| 国产av麻豆久久久久久久| 亚洲精品中文字幕一二三四区| 1000部很黄的大片| www.精华液| 噜噜噜噜噜久久久久久91| 国产亚洲精品久久久久久毛片| 欧美3d第一页| 老汉色av国产亚洲站长工具| 国产毛片a区久久久久| 可以在线观看的亚洲视频| 精品国产三级普通话版| 午夜日韩欧美国产| 十八禁人妻一区二区| 村上凉子中文字幕在线| 人妻丰满熟妇av一区二区三区| 欧美激情在线99| 日韩人妻高清精品专区| 欧美国产日韩亚洲一区| 久久中文字幕人妻熟女| 999精品在线视频| 99热这里只有精品一区 | 欧美3d第一页| 长腿黑丝高跟| 一个人看的www免费观看视频| 免费在线观看亚洲国产| 亚洲精品色激情综合| 亚洲国产精品合色在线| 一进一出抽搐动态| 久久精品国产清高在天天线| 老司机深夜福利视频在线观看| 别揉我奶头~嗯~啊~动态视频| 婷婷六月久久综合丁香| 欧美日韩国产亚洲二区| 好男人在线观看高清免费视频| 国内揄拍国产精品人妻在线| 9191精品国产免费久久| 久久午夜亚洲精品久久| 国产高清激情床上av| 国产熟女xx| 一本一本综合久久| 亚洲国产看品久久| 日韩欧美在线乱码| 性色avwww在线观看| 丁香欧美五月| 少妇的逼水好多| 国产亚洲av嫩草精品影院| 精华霜和精华液先用哪个| 日日摸夜夜添夜夜添小说| 久久久久国内视频| 搡老岳熟女国产| 少妇的逼水好多| 给我免费播放毛片高清在线观看| 男人舔女人下体高潮全视频| 亚洲国产欧美网| 禁无遮挡网站| 日本 av在线| 香蕉久久夜色| 久99久视频精品免费| 久久中文看片网| 婷婷亚洲欧美| 国产亚洲欧美98| 哪里可以看免费的av片| 国产精品乱码一区二三区的特点| 俺也久久电影网| 国产三级中文精品|