RET蛋白在先天性巨結(jié)腸腸壁中的表達(dá)

RET蛋白在先天性巨結(jié)腸腸壁中的表達(dá)

吳小紅

(江蘇大學(xué)附屬宜興市人民醫(yī)院 胃腸外科, 江蘇 宜興, 214200)

關(guān)鍵詞:先天性巨結(jié)腸; RET蛋白; Western-blot法

先天性巨結(jié)腸(HD)是小兒外科常見的消化道畸形疾病，主要以遠(yuǎn)端腸管肌間和黏膜下神經(jīng)節(jié)細(xì)胞缺如并以及此節(jié)段的持續(xù)性收縮為特征。目前，對其確切病因尚不清楚，導(dǎo)致狹窄段神經(jīng)節(jié)細(xì)胞缺如的原因概括起來大致有3種: ① 消化管神經(jīng)嵴細(xì)胞遷移障礙; ② 腸管微環(huán)境因素阻止神經(jīng)節(jié)細(xì)胞的正常發(fā)育; ③ 遺傳因素的影響[1]。當(dāng)今國內(nèi)外對先天性巨結(jié)腸的病因有較多研究，已發(fā)現(xiàn)有5種致病基因，其中RET原癌基因是其主要的致病基因。目前，國內(nèi)外已對RET基因及其表達(dá)產(chǎn)物進(jìn)行了相應(yīng)的研究，但都停留在免疫組化水平。本文運(yùn)用Western-blot技術(shù)檢測RET蛋白在散發(fā)性HD腸壁中的表達(dá)，進(jìn)步了解HD在分子基礎(chǔ)上的發(fā)病機(jī)制，為臨床提供參考。

1資料與方法

1.1　一般資料

收集本院2004年11月—2009年10月手術(shù)切除的經(jīng)病理診斷為HD的病變段結(jié)腸標(biāo)本16例為實(shí)驗(yàn)組，分別取狹窄段、移行段、擴(kuò)張段全層腸壁組織，用無菌生理鹽水沖洗表面污垢后，立即送-80 ℃恒溫冰箱中保存。16例患兒中，男9例，女7例；年齡16 d～14歲，中位年齡7歲；其中新生兒2例，1個(gè)月～9歲12例，14歲2例，長段型4例，普通型5例，短段型7例。所有患者均為散發(fā)性，無家族史，無合并其他主要臟器的先天性畸形或綜合征。同時(shí)，隨機(jī)選取16例非巨結(jié)腸手術(shù)患兒為對照組，年齡8 d～6歲，男女比例1∶1。其中肛門直腸畸形5例(肛門閉鎖2例、直腸閉鎖3例)，均行結(jié)腸造瘺術(shù)，腸套疊行腸吻合術(shù)7例，關(guān)瘺術(shù)4例。取造瘺口處腸壁，并經(jīng)病檢存在神經(jīng)節(jié)細(xì)胞。

1.2　方法

采用Western-blot分析測定，根據(jù)Bradford法測定樣本胞膜蛋白濃度后，取一定量的胞膜蛋白溶液，用5×電泳加樣緩沖液將胞膜蛋白裂解液稀釋成5 μg/μL的溶液100 μL, 95 ℃水浴5 min后，在-80 ℃溫度下保存?zhèn)溆?。?shí)驗(yàn)時(shí)，取10 μL的胞膜蛋白裂解溶液(含等量蛋白50 μg)電泳轉(zhuǎn)膜。10%牛血清封閉1h后，加山羊抗人RET單克隆抗體一抗(Santa cruz公司產(chǎn)品, 1∶400), 4 ℃孵育過夜。PBS沖洗膜3遍后，加驢抗山羊二抗(碧云天生物技術(shù)研究所產(chǎn)品，濃度為1∶2 000), 室溫孵育1 h后, PBS沖洗膜3遍，用DAB顯色試劑顯色。用Image J分析軟件測定條帶的灰度值，用GAPDH條帶的灰度值作內(nèi)對照進(jìn)行校正，分別計(jì)算出各樣本的相對表達(dá)量。

2結(jié)果

2.1　Western-blot法定性及半定量分析

RET蛋白在HD患兒痙攣段表達(dá)減少，在移行段、擴(kuò)張段、對照組的表達(dá)無明顯變化。

2.2　RET蛋白在痙攣段、移行段、擴(kuò)張段和

對照組結(jié)腸腸壁的表達(dá)

痙攣段分別與移行段、擴(kuò)張段和對照組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05); 移行段、擴(kuò)張段、對照組之間相互比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，見表1。

表1　RET蛋白在痙攣段、移行段、擴(kuò)張段和

與其他組比較, **P<0.01。

3討論

HD主要病變?yōu)槟c道末端一段腸壁的腸神經(jīng)叢神經(jīng)節(jié)細(xì)胞缺失，受累腸段持續(xù)異常收縮，其上段結(jié)腸仍然保持蠕動(dòng)功能，結(jié)果導(dǎo)致代償性擴(kuò)張、肥厚，最終形成巨結(jié)腸，又稱無神經(jīng)節(jié)細(xì)胞癥。診斷通常結(jié)合主要癥狀、結(jié)腸的放射學(xué)表現(xiàn)、直腸測壓以及直腸活組織檢測的組織學(xué)特征，典型的組織學(xué)特征包括神經(jīng)節(jié)細(xì)胞缺失和粗大的神經(jīng)干[2]。目前研究已表明，HD是一種多基因控制的疾病，一些基因的缺失或突變可導(dǎo)致微環(huán)境變化，引起腸神經(jīng)母細(xì)胞(神經(jīng)嵴胚細(xì)胞)遷移的停頓而導(dǎo)致HD。文獻(xiàn)[3]報(bào)道先天性巨結(jié)腸的病因可能與原癌基因RET、血內(nèi)皮素B受體基因(EDNRB)及其配基血管內(nèi)皮素-3基因(EDN3)有關(guān)。

RET原癌基因作為HD的主要致病基因，定位于染色體10q11.2, 全長約80 kb, 編碼酪氨酸激酶受體，它具有20個(gè)外顯子[4]。RET原癌基因的表達(dá)產(chǎn)物RET蛋白(酪氨酸激酶受體)由3部分組成：細(xì)胞外鏈條聯(lián)結(jié)區(qū)、跨膜區(qū)、細(xì)胞內(nèi)酪氨酸激酶區(qū)，它具有對細(xì)胞生長和分化轉(zhuǎn)導(dǎo)信號(hào)的機(jī)理，即：細(xì)胞外因子與該受體結(jié)合，促使受體形成二聚體，接著，受體構(gòu)型發(fā)生變化，激活膜內(nèi)區(qū)的酪氨酸激酶，使得受體自身磷酸化。同時(shí)，使底物的酪氨酸激酶磷酸化，這樣信號(hào)就通過受體進(jìn)入到細(xì)胞內(nèi)，再進(jìn)一步傳遞給效應(yīng)子、傳遞子或聯(lián)接子，從而影響細(xì)胞的生理活動(dòng)、生長發(fā)育[5]。

RET原癌基因作為HD的致病基因，已被許多實(shí)驗(yàn)所證實(shí), Schuchardt A等[6]利用基因工程技術(shù)剔除RET基因，制備RET純合子缺失的鼠，組織學(xué)發(fā)現(xiàn)該鼠全部消化道神經(jīng)節(jié)細(xì)胞缺如。Pachnis V等[7]發(fā)現(xiàn)當(dāng)神經(jīng)節(jié)細(xì)胞RET蛋白表達(dá)量減少一半時(shí)，節(jié)細(xì)胞就不能移行到腸壁內(nèi)。對HD擴(kuò)張段、移行段、狹窄段行RET基因表達(dá)研究，發(fā)現(xiàn)其表達(dá)是擴(kuò)張段、移行段、狹窄段逐漸下降的[8-9]。由于RET基因的表達(dá)在建立腸神經(jīng)叢中占重要的地位，其在神經(jīng)節(jié)細(xì)胞缺如腸段的表達(dá)減少很可能暗示為神經(jīng)嵴細(xì)胞的一種發(fā)育停滯。國內(nèi)外對家族性、散發(fā)性HD進(jìn)行RET基因突變研究[10-11]，均發(fā)現(xiàn)有RET基因突變，導(dǎo)致所在區(qū)域的氨基酸發(fā)生改變，當(dāng)前已初步明確HD與RET原癌基因的具體聯(lián)系：家族性HDRET基因的突變位點(diǎn)均是RET蛋白產(chǎn)物的細(xì)胞外區(qū)段的編碼區(qū)，而散發(fā)性HDRET基因突變位點(diǎn)均是RET蛋白產(chǎn)物的細(xì)胞內(nèi)區(qū)段的編碼區(qū)[12]。通過對RET蛋白在非HD患兒和非癥狀的HD患兒結(jié)腸中的表達(dá)研究發(fā)現(xiàn)，RET蛋白在正常對照組的每個(gè)樣本都有表達(dá)，表明RET在胚胎發(fā)育之后的成熟腸神經(jīng)系統(tǒng)有一定的作用。另外，RET在所有腸管中均有表達(dá)，可證實(shí)RET基因與整個(gè)腸神經(jīng)系統(tǒng)的正常發(fā)育和功能有關(guān)，而RET蛋白在非癥狀的HD患兒結(jié)腸擴(kuò)張段、移行段、痙攣段逐漸減少，且擴(kuò)張段、移行段和正常(非HD患兒)結(jié)腸平滑肌組織中的表達(dá)無顯著差異，這種異常分布可能與腸神經(jīng)系統(tǒng)的發(fā)育異常引起RET基因突變，從而引起RET蛋白表達(dá)減少有關(guān)。

另外，實(shí)驗(yàn)還發(fā)現(xiàn)，RET蛋白在HD患兒無神經(jīng)節(jié)細(xì)胞腸管中的表達(dá)顯著減少，可能是由于遠(yuǎn)端結(jié)腸內(nèi)能表達(dá)RET蛋白的固有神經(jīng)節(jié)細(xì)胞缺乏，表明RET基因可能是維持正常腸神經(jīng)系統(tǒng)功能的必要基因，具體表現(xiàn)是：RET蛋白表達(dá)減少，引起腸管痙攣、腸腔狹窄，造成功能障礙，但是否引起腸神經(jīng)節(jié)細(xì)胞缺乏等尚有待進(jìn)一步研究。這些結(jié)果都與國內(nèi)相關(guān)研究機(jī)構(gòu)的研究相一致。

參考文獻(xiàn)

[1]Purr-p, Ohshiro-k, Wester-t, et al. Hirschsprug′s disease: search for etiology[J]. Semin-Pediatr-Surg, 1998, 7(3): 140.

[2]Barshack I, Fridman E, Goldberg I, et al. The loss of calretinin expression indicates aganglionosis in Hirschsprung′s disease[J]. J Clin Pathol, 2004, 57(7): 712.

[3]Shimotake T, Tomiyama H, Aoi S, et al. Discrepancy between macroscopic and microscopic transitional zones in Hirschsprung’s disease with reference to the type of RET/GDNF/SOX10 gene mutation [J]. J Pedi Surg, 2003, 38(5): 698.

[4]Glovann Romeo, Patrizie Ronchetto, Yinluo, et al. Point mutations affecting the tyrosin Kinase domain of the Ret Proto-oncogene in Hirschsprung’s disease: search for etiology[J]. Semin-Pediatr-Surg, 1998，7(3): 140.

[5]徐寧志. 信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的概況、進(jìn)展及應(yīng)用[J]. 診斷病理學(xué)雜志, 1998, 5(2), 125.

[6]Schuchardt A, D Agativ, Larsson-Blowtery, et al. Defects in the Kidney and enteric nevious system of mice lacking the tyrosine kinase receptor RET[J]. Nature, 1994, 367: 380.

[7]Pachnis V, Mankoo Bs, Costantini F. Expression of c-ret proto-oncogene during mouse embryo genesis[J]. Development, 1993, 119: 1005.

[8]Takeshi Kusafuka, prempuri, Dublin, et al. Altered RET Gene mRNA Expression in Hirschsprung′s disease[J]. J Pediatr Surg, 1997, 32(43): 600.

[9]詹江華, 房志勤, 谷繼卿, 等. 先天性巨結(jié)腸RET基因轉(zhuǎn)錄水平的研究[J]. 中華小兒外科雜志, 1999, 20(1): 5.

[10]Attie-T, Pelet-A, Edrey-P, et al. Diversity of RET proto-oncogene mutations in familial and sporadic Hirschsprung′s disease[J]. Hum-Mol-Genet, 1995, 4(8): 1381.

[11]許娟, 魏明發(fā), 史慧芬, 等. 先天性巨結(jié)腸RET基因突變的研究[J]. 中華小兒外科雜志, 1999, 20(1): 78.

[12]武君, 王慧貞, 吉士俊, 等. 先天性巨結(jié)腸癥原癌基因RET結(jié)構(gòu)的PCR-SSCP分析[J]. 中華小兒外科雜志, 1998, 9(4): 95.

收稿日期:2014-12-08

中圖分類號(hào):R 574.62

文獻(xiàn)標(biāo)志碼:A

文章編號(hào):1672-2353(2015)09-164-02

DOI:10.7619/jcmp.201509055