重慶地區(qū)膀胱癌人群IL-23R rs10889677位點(diǎn)單核苷酸多態(tài)性與膀胱癌易感性的相關(guān)性分析

曹全富, 葉　錦, 付成偉, 馮慶興, 張　軍, 張克勤

(第三軍醫(yī)大學(xué)大坪醫(yī)院野戰(zhàn)外科研究所 泌尿外科, 重慶, 400042)

重慶地區(qū)膀胱癌人群IL-23R rs10889677位點(diǎn)單核苷酸多態(tài)性與膀胱癌易感性的相關(guān)性分析

曹全富, 葉錦, 付成偉, 馮慶興, 張軍, 張克勤

(第三軍醫(yī)大學(xué)大坪醫(yī)院野戰(zhàn)外科研究所 泌尿外科, 重慶, 400042)

摘要:目的分析白介素23受體(IL-23R)基因rs10889677位點(diǎn)單核苷酸多態(tài)性(SNPs)與重慶地區(qū)膀胱癌人群易感性的相關(guān)性。方法選取來自重慶地區(qū)的膀胱癌組患者210例和健康對照組人群200例，采用聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)-限制性片段長度多態(tài)性(PCR-RFLP)技術(shù)檢測IL-23R rsl10889677位點(diǎn)SNPs并分析其與膀胱癌的關(guān)系。結(jié)果IL-23R基因rs10889677位點(diǎn)存在三種基因型(AA型、AC型和CC型)，在膀胱癌組和對照組中的基因型頻率分布差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=17.45,P<0.01); 膀胱癌組攜帶等位基因A的頻率(75.71%)明顯增高對照組基因型(65.50%), 差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義[χ2=19.28,P<0.01, OR=1.952, 95%CI(1.451～2.620)]。結(jié)論IL-23R rs10889677位點(diǎn)基因多態(tài)性與重慶地區(qū)膀胱癌易感性相關(guān)。

關(guān)鍵詞:白介素-23受體; 單核苷酸多態(tài)性; 易感性; 相關(guān)性; 膀胱癌

膀胱癌是一種嚴(yán)重危害人類健康的惡性腫瘤，其發(fā)病率為中國泌尿系腫瘤第一位，且有逐年增長趨勢[1]。國內(nèi)外研究[2-3]證實(shí)慢性炎癥與惡性腫瘤的發(fā)生密切相關(guān)，二者在多方面具有相似性，如免疫細(xì)胞浸潤、基質(zhì)金屬蛋白酶活性升高、血管增生和脈管系統(tǒng)密度提高[4]。白介素23受體(IL-23R)基因是與炎癥、腫瘤等疾病發(fā)病相關(guān)的細(xì)胞因子[5]。但I(xiàn)L-23R基因rs10889677位點(diǎn)SNPs是否與重慶地區(qū)膀胱癌人群發(fā)病有關(guān)尚不明確，故本研究將采用聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)-限制性片段長度多態(tài)性(PCR-RFLP)技術(shù)對IL-23R基因rs10889677位點(diǎn)進(jìn)行SNPs檢測并分析該位點(diǎn)SNPs與重慶地區(qū)人群膀胱癌的相關(guān)性，為探索IL-23R基因與膀胱癌的發(fā)病機(jī)制提供理論依據(jù)。

1資料與方法

選擇2010年10月—2013年5月年本院泌尿外科收治的重慶地區(qū)210例膀胱癌患者為病例組，經(jīng)病理確診。其中男158例，女52例，平均年齡(64.5±10.5)歲，吸煙者92例，不吸煙者118例；上述病例均為初診膀胱癌患者，不包括膀胱癌復(fù)發(fā)患者，未經(jīng)化療、放療，并且無任何其他腫瘤病史；腫瘤組織病理診斷為膀胱移行細(xì)胞癌，其中淺表性(Ta期～T1期)為148例，浸潤性(T2期～T4期)為62例。對照組200例，來自本院同期健康體檢者，其中男116例，女84例，平均年齡(62.7±9.5)歲，吸煙者74例，不吸煙者126例，無慢性疾病、無泌尿系統(tǒng)疾病、無任何惡性腫瘤家族史，最終排除診斷膀胱腫瘤及其他部位惡性腫瘤。上述2組研究對象均未接受其他免疫抑制劑治療，未合并其他自身免疫性疾病、病毒性肝炎和HIV感染。全部研究對象經(jīng)本院倫理委員會(huì)同意，簽署知情同意書。

PCR引物由上海生工生物科技有限公司合成，Dream TaqTM Green PCR Master Mix(2x)、限制性內(nèi)切酶均購自美國Fermentas公司，MarkerDP500TM為大連寶生物生物工程有限公司生產(chǎn)。主要儀器有PCR擴(kuò)增儀為德國Eppendorf公司產(chǎn)品，高速低溫離心機(jī)購自德國Eppendorf公司，電泳儀產(chǎn)自北京六一儀器廠，全自動(dòng)凝膠成像儀購自美國SYNGENE公司。

采集研究對象外周血2 mL(血常規(guī)管抗凝)，采用全血DNA提取試劑盒提取基因組DNA，按說明書操作，在紫外分光光度儀上(OD260/OD280)進(jìn)行核酸定量，最后將提取的DNA稀釋至20 ng/μL, -20 ℃保存待用。

rs10889677的PCR引物參照文獻(xiàn)[6]設(shè)計(jì)，由上海生工公司合成。rs10889677位點(diǎn)PCR引物序列為F: 5′-CTGTGCTCCTACCATCACCA-3′, R: 5′-TGCTGTTTTTGTGCCTGTATG-3′。25 μL PCR反應(yīng)體系包括DNA 20 μL, 上下游引物(1.0 μmol/L)各1 μL, Dream TaqTM PCR Master Mix(2×)12.5 μL, 滅菌去離子水8.5 μL。PCR反應(yīng)為先95 ℃ 2 min, 接著95 ℃ 20 s, 52 ℃ 30 s, 72 ℃ 30 s, 35個(gè)循環(huán)，最后72 ℃ 10 min。PCR擴(kuò)增產(chǎn)物用DraI限制性酶37 ℃酶切過夜, 20 μL反應(yīng)體系包括PCR產(chǎn)物10 μL、限制性內(nèi)切酶(10 U/μL) 1 μL, 反應(yīng)緩沖液2 μL, 滅菌去離子水7 μL。酶切產(chǎn)物用3 g/dl瓊脂糖凝膠電泳，通過凝膠電泳成像分析系統(tǒng)觀察、判定基因型。

根據(jù)已知的引物對能否擴(kuò)增目的片段，來確定該等位基因的存在與否，即分別經(jīng)不同的引物對擴(kuò)增2次后，PCR產(chǎn)物經(jīng)電泳確定基因型；為了提高PCR-RFLP方法的準(zhǔn)確性，隨機(jī)抽取10%標(biāo)本，送上海生工進(jìn)行測序驗(yàn)證，結(jié)果吻合。

2結(jié)果

2.1　一般資料

2組的性別、年齡、體質(zhì)量、BMI、吸煙狀態(tài)差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P均>0.05), 具有可比性。見表1。

表1　2組一般資料比較

2.2　IL-23R rs10889677位點(diǎn)多態(tài)性與膀胱癌發(fā)病相關(guān)性分析

經(jīng)卡方檢驗(yàn)，膀胱癌組與對照組中rs10889677位點(diǎn)基因型和基因頻率具有顯著差異(P<0.01); 膀胱癌攜帶等位基因A的頻率(75.71%)明顯增高對照組基因型(65.50%), 差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義[χ2=19.28,P<0.01, OR=1.952, 95%CI(1.451～2.620)]。見表2。

表2　IL-23R rs10889677位點(diǎn)基因型及等位基因

3討論

目前越來越多的研究證實(shí)慢性炎癥是腫瘤發(fā)生的病理基礎(chǔ)。慢性炎癥促進(jìn)細(xì)胞增殖，其中在富含炎性細(xì)胞、生長因子和DNA損傷誘導(dǎo)劑的微環(huán)境中更可以明顯增加癌癥發(fā)病的風(fēng)險(xiǎn)[7]。炎性因子、生長因子、炎癥趨化因子、活性氧(ROS)和環(huán)氧合酶2(COX2)的相互作用，在炎癥發(fā)生發(fā)展的中以一種復(fù)雜的方式發(fā)揮交互作用[8]。膀胱癌是遺傳因素和環(huán)境因素長期共同作用的結(jié)果，慢性炎癥可能作為膀胱癌發(fā)生的危險(xiǎn)因素也已得到證實(shí)[9]。IL-23R是一個(gè)新的促紅細(xì)胞生成素受體家族成員，由IL-11和IL-23R兩個(gè)亞基構(gòu)成[10]。IL-23通過結(jié)合細(xì)胞膜表面 IL-23R復(fù)合物發(fā)揮其生物效應(yīng)，刺激細(xì)胞內(nèi)信號傳導(dǎo)系統(tǒng)來誘導(dǎo)細(xì)胞激活。IL-23有促炎癥反應(yīng)活性，通過STAT3信號通路激活并刺激記憶性CD4+T細(xì)胞增殖，趨化炎癥細(xì)胞聚集與遷移，在多種炎癥病灶中都有p40和p19mRNA高表達(dá)[11]。IL-23可以誘導(dǎo)激活的CD4+記憶T細(xì)胞產(chǎn)生IFN-7; 也能激發(fā)樹突狀細(xì)胞和單核細(xì)胞產(chǎn)生IL-1和腫瘤壞死因子(TNF)，參與先天性免疫反應(yīng)；并能刺激樹突狀細(xì)胞自分泌產(chǎn)生IL-12[12]。而IL-12只激活Th0細(xì)胞(幼稚T細(xì)胞)和自然殺傷細(xì)胞產(chǎn)生以IFN-γ為主的細(xì)胞因子[13]。IL-23誘導(dǎo)的炎癥反應(yīng)過程如血管生成和巨噬細(xì)胞、中性粒細(xì)胞的浸潤是細(xì)菌感染的有效防御機(jī)制[5]。但是這個(gè)調(diào)節(jié)通路似乎對于腫瘤的預(yù)防并不合適，反而為腫瘤提供了一個(gè)保護(hù)性環(huán)境。

本研究首次探討了重慶地區(qū)膀胱癌人群IL-23R基因rs10889677位點(diǎn)多態(tài)性與膀胱癌遺傳易感性的關(guān)系。研究發(fā)現(xiàn)IL-23R rs10889677基因型可增加膀胱癌的患病風(fēng)險(xiǎn)。此外，作者也觀察到攜帶等位基因A的人群更傾向性于患有膀胱癌?；蛐蛄兄袉蝹€(gè)核苷酸的替代、插入或缺失，都會(huì)引起編碼氨基酸的改變或?qū)е罗D(zhuǎn)錄的mRNA剪接的改變，影響基因表達(dá)與蛋白質(zhì)的功能從而導(dǎo)致疾病的發(fā)生。IL-23Rrs10889677單核苷酸多態(tài)性可能促使受體的過表達(dá)，IL-23R與蛋白酪氨酸激酶(JK2)相連，同時(shí)也促進(jìn)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)和轉(zhuǎn)錄激活子(STAT3)以配體依賴方式結(jié)合，使其磷酸化和隨之而來的二聚化，觸發(fā)下游基因的表達(dá)，如IL-17及IL-22[14]。IL-23R可誘導(dǎo)幼稚的CD4+T細(xì)胞向Thl7細(xì)胞亞群分化[15], Thl7細(xì)胞在受到刺激后可高表達(dá)IL-17, 有利于病原體的清除組織炎癥。IL-17是一個(gè)強(qiáng)促炎癥細(xì)胞因子，組織中過量表達(dá)的IL-17會(huì)引起慢性炎癥反應(yīng)與組織損傷[16]。因此, IL-23R可能促進(jìn)炎癥、癌癥的患病風(fēng)險(xiǎn)[17-18]。全基因組研究發(fā)現(xiàn)，rs10889677與口腔癌[19]、乳腺癌[20]和卵巢癌[2]的發(fā)生有密切關(guān)系。此外, IL-23R基因多態(tài)性與食管癌、胃癌等的研究已證實(shí)IL-23R可能與某些炎癥相關(guān)的腫瘤易感性有關(guān)。Zhang等[2]研究發(fā)現(xiàn), IL-23R可通過交替剪接產(chǎn)生剪接異構(gòu)體，并優(yōu)先在肺癌中表達(dá)，進(jìn)而推測該表達(dá)可能有助于細(xì)胞逃避機(jī)體的免疫監(jiān)視或攻擊，使IL-23R可能在某些癌癥的發(fā)生、發(fā)展過程中發(fā)揮作用。Chen和Hsich[21]的研究證實(shí)，IL-23R信號通路中STAT3調(diào)控多種與細(xì)胞增殖及凋亡有關(guān)的功能蛋白的表達(dá)，STAT3的異常活化是引起某些癌癥的原因之一。所有這些發(fā)現(xiàn)表明，rs10889677的單核苷酸多態(tài)性可能有助于IL-23信號通路的調(diào)節(jié)并最終導(dǎo)致易感某些疾病。盡管如此，IL-23R的單核苷酸多態(tài)性和IL-23R的轉(zhuǎn)錄和表達(dá)還需待進(jìn)一步研究。

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Analysis in correlation between polymorphism of

IL-23R gene rs10889677 and susceptibility

of bladder cancer in Chongqing area

CAO Quanfu, YE Jin, FU Chengwei, FENG Qingxing, ZHANG Jun, ZHANG Keqin

(DepartmentofUrinarySurgery,DapingHospitalofTheThirdMilitaryMedical

University,Chongqing, 400042)

ABSTRACT:ObjectiveTo analyze the correlation between the polymorphism of IL-23R gene rs10889677 SNPs and susceptibility of bladder cancer in Chongqing area. MethodsA total of 210 bladder cancer patients (bladder cancer group) and 200 healthy people (control group) were selected. The rs10889677 SNPs was analyzed by restriction fragment length poly(PCR-RFLP), and its relationship with bladder cancer was analyzed as well．ResultsThere were three kinds of genotypes in IL-23R gene rs10889677 (AA, AC and CC). In the three single nucleotide polymorphisms of IL-23R, the distributions of genotype and allele frequencies of rs10889677 differed significantly between the bladder cancer group and the control group. The frequency of allele A of rs10889677 in the bladder cancer group was 75.71%, which was significantly higher than 65.50% in the control group, and there was significant difference [χ2=19.28,P<0.01, odds ratio=1.952, 95% confidence interval (1.451～2.620)]. ConclusionThe rs10889677 of IL-23R gene is associated with susceptibility of bladder cancer in Chongqing area.

KEYWORDS:interleukin 23 receptor; single nucleotide polymorphisms; susceptibility; correlation; bladder cancer

通信作者:葉錦, Email: yejin7566@hotmail.com

收稿日期:2015-01-11

中圖分類號:R 737.14

文獻(xiàn)標(biāo)志碼:A

文章編號:1672-2353(2015)09-073-03

DOI:10.7619/jcmp.201509021