SIRT2在胃癌組織中的表達與臨床預后的關系

張　舟, 楊庭松, 陳　希, 王　群, 張　逖, 房　林

(同濟大學附屬第十人民醫(yī)院 普外科, 上海, 200072)

SIRT2在胃癌組織中的表達與臨床預后的關系

張舟, 楊庭松, 陳希, 王群, 張逖, 房林

(同濟大學附屬第十人民醫(yī)院 普外科, 上海, 200072)

摘要:目的探討胃癌組織中SIRT2的表達及其與臨床病理特征及預后的相關性，并初步研究SIRT2在胃癌細胞中的作用。方法采用Western-blot法檢測胃癌組織和癌旁正常胃黏膜組織中SIRT2蛋白表達的差異；用免疫組織化學法，檢測100例胃癌組織及癌旁正常胃黏膜組織中SIRT2的表達情況，分析其表達水平與臨床病理特征及預后的關系；將SIRT2-siRNA質粒轉染胃癌細胞，通過Transwell實驗觀察下調SIRT2表達對胃癌細胞遷移侵襲能力的影響。結果SIRT2在胃癌組織和癌旁正常胃黏膜組織中陽性表達率分別為67%(67/100)、16%(24/100), 差異有統(tǒng)計學意義(P<0.01)；胃癌組織中SIRT2的高表達與胃癌的淋巴結轉移、臨床分期及患者預后顯著相關；體外細胞實驗顯示下調SIRT2表達可抑制胃癌細胞的遷移和侵襲。結論SIRT2可作為判斷胃癌患者預后的一個獨立指標，并有潛力成為一個胃癌靶向治療的新靶點。

關鍵詞:胃癌; SIRT2; 預后

近年來，在歐美等發(fā)達國家，胃癌的發(fā)病率和死亡率均有所下降，但胃癌仍然是世界上最常見的惡性腫瘤之一[1-2]。表觀遺傳學理論的不斷完善和分子生物技術的迅猛發(fā)展，為研究胃癌的發(fā)生發(fā)展機制以及探索新的治療靶點提供了新契機。沉默信息調節(jié)因子2(Sir2)相關酶類(Sirtuins)是最近發(fā)現(xiàn)的煙酰胺腺嘌呤二核苷酸(NAD+)依賴的第Ⅲ類組蛋白去乙?；割怺3]，可通過對組蛋白、轉錄因子等蛋白質的賴氨酸殘基進行去乙?；揎椬饔脕碚{控靶基因的轉錄和表達[4], 從而參與了機體代謝、細胞分化、凋亡以及腫瘤的發(fā)生發(fā)展等病理生理過程[5]。人類Sirtuins家族中公認的成員有7個，即SIRT1～SIRT7[6]。本研究采用Western-blot法檢測胃癌組織和癌旁正常胃黏膜組織中SIRT2蛋白表達的差異，通過免疫組化法檢測SIRT2表達水平并探討其與臨床病理特征及預后的關系，并采用RNA干擾技術下調SIRT2的表達以初步探索其在胃癌細胞中的作用。

1資料與方法

1.1　一般資料

選擇同濟大學附屬第十人民醫(yī)院普通外科2004年1月—2008年12月行胃癌根治術并具有完整隨訪資料的胃癌患者100例。其中男72例，女28例；年齡41～82歲，平均(58.67±7.29)歲。所有患者既往無其他腫瘤罹患病史；術前均未行放化療等輔助治療；術后標本經病理組織學檢查證實為胃癌。所有臨床組織標本的采集均經同濟大學倫理委員會批準，患者及(或)其家屬知情同意。

1.2　方法

1.2.1Western blot檢測胃癌組織和癌旁正常胃黏膜組織中SIRT2蛋白的表達：隨機選取3對胃癌組織和癌旁正常胃黏膜組織，置研磨器加裂解液中研磨至勻漿，置低溫高速離心機(FL-20, Beckman)中以12 000 r/min, 離心30 min, 取上清，常規(guī)行BCA法蛋白定量。10% SDS-PAGE電泳分離, 4 ℃轉PVDF膜(Sigma公司，美國)2 h, 5% BSA室溫封閉1 h, 加入SIRT2單克隆抗體(Santa Cruz公司，美國)4 ℃孵育過夜，洗膜5 min, 加入HRP標記的二抗(Santa Cruz公司，美國) 37 ℃孵育1 h, 0.05% TBST洗膜5 min, 加入化學發(fā)光試劑(上海博華生物公司)顯色曝光，凝膠成像儀(美國杜邦公司)顯示圖像，掃描圖片，BandScan 5.0軟件分析條帶灰度值。

1.2.2免疫組化染色：胃癌及正常胃黏膜組織標本均經10%甲醛固定，脫水機處理后石蠟包埋, 5 μm切片，采用免疫組化SP法，具體操作步驟按試劑盒說明書進行, DAB顯色及蘇木素復染。所有標本均設陽性對照并用PBS緩沖液代替一抗做陰性對照。SIRT2單克隆抗體和β-actin抗體購自美國Santa Cruz公司, DAB顯色試劑盒及免疫組化SP試劑盒購自上海博華生物公司。

1.2.3細胞培養(yǎng)、傳代及轉染：胃癌BGC-823細胞株由上海生物化學與細胞生物學研究所提供，常規(guī)37 ℃、5% CO2條件下培養(yǎng)與傳代。取處于對數生長期的BGC-823細胞，棄去培養(yǎng)液，調整細胞濃度至1×105/mL接種6孔板，置入37 ℃、5% CO2培養(yǎng)孵育箱中培養(yǎng)，待細胞密度達到60%～80%, 按LipfectamineTM2000脂質體試劑盒說明書將SIRT2-siRNA質粒(Santa Cruz公司，美國)轉染胃癌細胞，并設置陰性對照組。

1.2.4Transwell細胞遷移、侵襲實驗：收集細胞，待測細胞培養(yǎng)至對數生長期，用無血清培養(yǎng)基懸浮細胞，計數并調整濃度為1×105/mL，在Transwell Chamber(BD Biosciences公司，美國)(孔徑=8 μm)下室加入600～800 μL含10% FBS的培養(yǎng)基，上室加入100～150 μL細胞懸液，繼續(xù)在孵箱培養(yǎng)24 h, 用鑷子小心取出Chamber, 吸干上室液體，移到預先加入約800 μL甲醇的孔中，室溫固定30 min, 取出Chamber，吸干上室固定液，移到預先加入約800 μL Giemsa染液(上海江萊生物科技公司)的孔中，室溫染色15～30 min; 清水沖洗浸泡數次，取出Chamber，吸去上室液體，用濕棉棒擦去上室底部膜表面上的細胞，揭下膜，底面朝上晾干，移至載玻片上用中性樹膠封片。顯微鏡下取5個隨機視野計數，統(tǒng)計結果。細胞侵襲實驗即將Matrigel基質膠(BD Biosciences公司，美國)在4 ℃過夜融化，用4 ℃預冷的無血清培養(yǎng)基稀釋Matrigel基質膠至終濃度1 mg/mL, 冰上操作，在Chamber上室底部中央垂直加入100 μL稀釋后的Matrigel, 37 ℃溫育4～5 h使其干成膠狀，后續(xù)步驟同遷移實驗。

1.3　評價標準

免疫組化結果判定：以細胞質內有棕黃色顆粒者為染色陽性。觀察切片中5個高倍視野，腫瘤細胞染色陽性率>25%為陽性，≤25%為陰性。陽性細胞按著色強度和范圍分級：標本陽性細胞呈淡黃色或陽性細胞率為25%～50%為弱陽性, 50%～75%為中度陽性，>75%為強陽性。

2結果

2.1　SIRT2在胃癌組織和癌旁正常胃黏膜組織中的表達差異

胃癌組織中SIRT2蛋白表達水平顯著高于癌旁正常胃黏膜組織，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05), 見圖1。

注:NC為癌旁正常胃黏膜組織,GC為胃癌組織,*P<0.05圖1 胃癌組織和癌旁胃正常黏膜組織中SIRT2蛋白的表達

2.2　胃癌組織中SIRT2的陽性表達及其與臨床病理特征的關系

SIRT2陽性染色定位于細胞漿內，陽性顯色為不均質棕色顆粒。胃癌組織和癌旁正常胃黏膜組織中SIRT2的陽性表達率分別為67%(67/100)、16%(24/100), 差異具有統(tǒng)計學意義(χ2=37.28,P<0.01)。T0～T1期患者中SIRT2高表達者占61.4%, T2～T3期占78.5%; Ⅰ～Ⅱ期患者中SIRT2高表達者占46.2%, Ⅲ～Ⅳ期占67.7%, SIRT2的高表達與胃癌的淋巴結轉移(P=0.004)及臨床分期(P=0.01)顯著相關。

2.3　胃癌組織中SIRT2的陽性表達與臨床預后的關系

將SIRT2弱陽性和陰性表達者定義為低表達組，將SIRT2中度陽性及強陽性定義為高表達組。統(tǒng)計結果顯示胃癌患者SIRT2高表達組59例，中位生存時間1.6年；而低表達組41例，中位生存時間2.2年，差異有統(tǒng)計學意義(P=0.02)。

2.4　下調SIRT2表達對胃癌細胞的遷移和侵襲能力的影響

下調SIRT2表達后的胃癌細胞遷移及侵襲能力顯著減弱(P<0.05或P<0.01), 見圖2。

圖2細胞遷移和侵襲實驗

3討論

Sirtuins與惡性腫瘤的發(fā)生發(fā)展密切相關。Cha等[7]研究發(fā)現(xiàn)胃癌組織中SIRT1基因的表達與腫瘤分期、淋巴及轉移、組織類型、p53表達具有相關性，并且其表達水平與總體生存率和無復發(fā)生存率呈負相關。Chen等[8]研究發(fā)現(xiàn)SIRT1在肝細胞癌組織中高表達，并且其表達與腫瘤的分期呈正相關，而沉默SIRT1基因則可抑制TERT和PTOP基因的表達水平，從而誘導細胞的衰老和凋亡。Zhao等[9]研究發(fā)現(xiàn)SIRT1在胰腺癌組織中高表達，并且其表達水平與腫瘤患者的年齡、腫瘤大小、TNM分期、淋巴結轉移等臨床病理特征具有顯著相關性，而沉默和下調SIRT1基因的表達可通過增加FOXO3a的表達來誘導胰腺癌細胞凋亡，從而抑制腫瘤細胞的增殖。

SIRT2亦參與了某些惡性腫瘤的進展過程，可通過去乙?；揎椖[瘤相關基因調控其表達及生物活性等分子機制來影響腫瘤細胞的生物學功能，并且在不同組織來源的腫瘤中其功能亦不盡相同，可表現(xiàn)為腫瘤發(fā)展的促進子或抑制子[10]。Li[11]等研究表明，沉默下調宮頸癌Hela細胞SIRT2的表達水平可降解p38 MAPK激活依賴的p300和MDM2蛋白，引起p53的聚集增多，進而誘導Hela細胞的凋亡。Zuo等[12]研究發(fā)現(xiàn)沉默下調膽囊癌細胞中SIRT2基因的表達可通過去乙?；揎椇驼{節(jié)肌動蛋白的表達，從而抑制膽囊癌細胞的遷移和侵襲。Hiratsuka等[13]發(fā)現(xiàn)SIRT2在人神經膠質瘤細胞中低表達，并且可通過對微管網絡的調節(jié)而抑制腫瘤細胞的增殖。Kim等[14]發(fā)現(xiàn)SIRT2缺陷雄性小鼠形成了多種消化道腫瘤包括胰腺癌、結腸癌和胃癌等，并且SIRT2可通過促使共激活子APCCDH1和CDC20去乙?；?，參與細胞分裂重要組件—分裂后期促進復合體(APC/C)的活性調控，引起細胞在分裂過程中發(fā)生異常染色體分離導致基因組失穩(wěn)從而發(fā)揮其生物學功能。

本研究中，SIRT2在胃癌組織中顯著高表達，其表達水平與胃癌的淋巴結轉移、臨床分期、預后密切相關，體外細胞實驗揭示下調SIRT2表達可抑制胃癌細胞的遷移和侵襲能力，因此，胃癌組織中SIRT2可能參與了胃癌的侵襲和轉移過程，而抑制其表達可遏制胃癌的進展。

綜上所述，SIRT2可作為判斷胃癌患者預后的一個獨立指標，且有潛力成為一個胃癌靶向治療的新靶點。

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Correlation between SIRT2 expression in gastric

carcinoma tissues and clinical prognosis in

gastric cancer patients

ZHANG Zhou, YANG Tingsong, CHEN Xi, WANG Qun, ZHANG Ti, FANG Lin

(DepartmentofGeneralSurgery,TenthPeople′sHospitalofTongjiUniversity,Shanghai, 200072)

ABSTRACT:ObjectiveTo explore the expression of SIRT2 and the relationship with clinicopathological characteristics and prognosis in patients with gastric cancer, and to investigate the role of SIRT2 in gastric carcinoma cells preliminarily. MethodsThe expressions of SIRT2 in gastric carcinoma tissues and adjacent normal gastric mucosa tissues were detected using Western-blot method. Immunohistochemistry was performed in gastric carcinoma and adjacent normal gastric mucosa tissues from 100 gastric cancer patients to determine the expressions of SIRT2 and the relationships with clinicopathological characteristics and prognosis were analyzed. Then gastric carcinoma cells were transfected with SIRT2-siRNA and the inhibition effect of SIRT2 downregulation on migration and invasion of these cells were observed through transwell experiment. ResultsThe expression rate of SITR2 in gastric carcinoma tissues and adjacent normal gastric mucosa tissues were 67%(67/100) and 16%(24/100) respectively and the difference was significant (P<0.01). High expression of SIRT2 in gastric carcinoma tissue was obviously related with lymph node metastasis, clinical stage and prognosis. Downregulation of SIRT2 expression suppressed the ability of migration and invasion of gastric carcinoma cells. Conclusion SIRT2 can be an independent marker of prognosis in patients with gastric cancer and be a potential target for Gastric Cancer targeted therapy.

KEYWORDS:gastric carcinoma; SIRT2;prognosis

通信作者:房林, E-mail: fanglin_f@126.com

基金項目:中國高校醫(yī)學期刊臨床專項資金(11521781)

收稿日期:2015-01-09

中圖分類號:R 735.2

文獻標志碼:A

文章編號:1672-2353(2015)09-069-04

DOI:10.7619/jcmp.201509020