ID1在3種膠質(zhì)母細胞瘤細胞系中的表達及其意義

任　力, 魏子龍, 邱永明, 蘭　津, 郭　品

(1. 上海市浦東醫(yī)院 神經(jīng)外科, 上海, 201399; 2. 上海交通大學醫(yī)學院附屬仁濟醫(yī)院 神經(jīng)外科, 上海, 200127)

ID1在3種膠質(zhì)母細胞瘤細胞系中的表達及其意義

任力1, 魏子龍1, 邱永明2, 蘭津2, 郭品2

(1. 上海市浦東醫(yī)院 神經(jīng)外科, 上海, 201399; 2. 上海交通大學醫(yī)學院附屬仁濟醫(yī)院 神經(jīng)外科, 上海, 200127)

摘要:目的研究DNA結(jié)合分化抑制因子1(ID1)在3種膠質(zhì)母細胞瘤細胞系中的表達水平，探討其表達水平差異與放療敏感性之間可能存在的聯(lián)系。方法利用Real-time PCR以及蛋白質(zhì)印跡法分別檢測T98G、A172、U251 這3種膠質(zhì)母細胞瘤細胞系中ID1的mRNA以及蛋白表達水平，比較其表達差異。結(jié)果3種膠質(zhì)母細胞瘤細胞中, IDl mRNA表達情況為T98G

關鍵詞:DNA結(jié)合分化抑制因子; 膠質(zhì)母細胞瘤; 放療敏感性; 蛋白質(zhì)印跡法

膠質(zhì)母細胞瘤是星形細胞腫瘤中惡性程度最高的膠質(zhì)瘤，屬WHO IV級，占成人顱內(nèi)腫瘤的25%。膠質(zhì)母細胞瘤生長速度快、病程短、預后差，病程超過1年者僅占10%。膠質(zhì)母細胞瘤以手術、放療、化療及其他綜合治療為主，放射治療是治療膠質(zhì)母細胞瘤的主要手段之一，但在不同患者中療效差異較大，這可能與腫瘤細胞對輻射的敏感性不同有關，這也被稱為輻射敏感性差異[1]。在作者先前的研究中發(fā)現(xiàn)，3種膠質(zhì)母細胞瘤細胞系對放射治療的敏感性為: T98G

1材料與方法

1.1　材料

實驗所用的人腦膠質(zhì)母細胞瘤細胞A172、T98G、U251購自美國菌種保藏中心(ATCC)。T98G培養(yǎng)基為含10%胎牛血清的MEM培養(yǎng)液，購自Invitrogen公司。A172和U251培養(yǎng)基為含10%的胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液，購自Invitrogen公司。Trizol總RNA提取試劑、RT-PCR試劑盒(BcaBESTTM RNA PCR Kit和SYBR Premix Ex TaqTM)均購于Takara公司；Real-time PCR引物由Takara公司設計合成。DEPC水自行配制，高壓滅菌，室溫保存。胰蛋白酶、DMSO、抗生素(青霉素、鏈霉素等)購自美國Solarbio公司。ECL顯色試劑盒購自美國Pierce公司, NC膜購自密理博公司，暗盒、膠片、顯色液等購自碧云天公司。IDl抗體購自美國Santa Cruze公司。

1.2　方法

1.2.1細胞培養(yǎng)：所有細胞都置于5% CO2培養(yǎng)箱中37 ℃培養(yǎng)。培養(yǎng)上述3種細胞A172、T98G、U251，使之處于對數(shù)生長期的階段。

1.2.2Real-time PCR法檢測3種人腦膠質(zhì)母細胞瘤細胞中IDl mRNA的相對定量：目的基因IDl擴增引物序列為正向5′-ACGACATGAACGGCTGTTACTCAC-3′，反向5′-CTCCAACTGAAGGTCCCTGATGTAG-3′, 125 bp。內(nèi)參基因β-actin的擴增引物序列為正向5′-ATTGCCGACAGGATGCAGA-3′, 反向5′-GAGTACTTGCGCTCAGGAGGA-3′, 89 bp。按標準方法提取總RNA, 反轉(zhuǎn)錄合成cDNA，Real-time PCR反應及融解曲線分析，計算mRNA的相對定量。

1.2.3蛋白質(zhì)印跡法檢測3種人腦膠質(zhì)母細胞瘤細胞中IDl蛋白的表達：胰蛋白酶、DMSO、抗生素(青霉素、鏈霉素等)購自美國Solarbio公司。ECL顯色試劑盒購自美國Pierce公司, NC膜購自密理博公司，暗盒、膠片、顯色液等購自碧云天公司。IDl抗體購自美國Santa Cruze公司。待細胞長滿后，將細胞用預冷的PBS洗3次，每孔加入30 μL細胞裂解液，冰上裂解30 min, 4 ℃, 12 000 g離心20 min, 將上清轉(zhuǎn)移到新的EP管中。用考馬斯亮藍法(Brandford)測定蛋白含量。15% SDS-聚丙烯凝膠(PAGE)電泳，轉(zhuǎn)膜，膜的封閉，抗原抗體反應，掃膜。

2結(jié)果

3種細胞系中，IDl mRNA表達情況為T98G

圖1 3種細胞系中ID1的mRNA的表達情況

圖2 3種細胞系中ID1蛋白的表達情況

3討論

放射治療是治療膠質(zhì)母細胞瘤的主要手段之一[7]，如何增強此類患者的放射治療效果是當前相關領域的研究熱點之一[8]。最初主要從放射劑量的角度考慮來增強放射治療效果，當放射劑量從50 Gy增加到60 Gy的時候，治療效果有明顯提高。而從60 Gy提高到70 Gy的時候，放射治療的效果無明顯改善。所以，試圖單純從提高劑量這個角度，無法增強放射治療的效果。隨著分子生物學以及腫瘤基因?qū)W的不斷進展，尋找新的腫瘤治療靶點成為目前研究者關注的重點[9]。對影響放射治療敏感性的相關因子研究成為近年來腫瘤放射治療的熱點之一。在對膠質(zhì)母細胞瘤放射治療的研究中，亦是如此[10]。

眾所周知，同一輻射劑量對不同細胞造成的損傷有很大的不同。在相同劑量照射下，不同的細胞所受的損傷會有所不同，這可能與細胞對輻射的敏感性不同造成的，這也被稱為輻射敏感性差異[10]。因此患不同腫瘤的患者，甚至患有同一種類型腫瘤的不同患者，其放療療效也大不相同。如能在放療前預先知道其輻射敏感性的高低，則有利于放療方案的制定和決策，從而有針對性地提高各個患者的療效，并可更合理的分配醫(yī)療資源。因此，研究腫瘤細胞中與放療敏感性相關的因素就顯得尤為重要。

ID蛋白是螺旋-環(huán)-螺旋(HLH)轉(zhuǎn)錄因子家族成員之一，它與堿性HLH蛋白等轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合成異二聚體后，抑制bHLH與DNA的結(jié)合，下調(diào)轉(zhuǎn)錄因子的活性，從而抑制細胞分化，促進細胞增殖[11]。ID蛋白通常分布于胚胎及未分化成熟的組織中，成人體內(nèi)在胸腺、生殖腺中有微量表達，正常細胞內(nèi)蛋白量隨著細胞分化過程逐漸降低。早期關于ID蛋白的研究主要集中于它對細胞分化的調(diào)節(jié)作用，但是隨著研究的不斷深入，人們發(fā)現(xiàn)ID蛋白在多種惡性腫瘤中呈異常高表達趨勢，且其表達水平與腫瘤細胞的惡性程度、腫瘤的發(fā)展及不良預后密切相關，提示惡性腫瘤ID基因的表達異常，可能是腫瘤侵襲性表型、預后差的標志，并有望成為腫瘤治療的靶標[12-13]。ID1是目前研究的最多最深入的蛋白，在許多原始的成纖維細胞中，ID1通過激活Ras/Raf/MEK途徑促進增殖從而逃避衰老[14]。ID1蛋白異常表達于多種腫瘤組織中，與腫瘤的生長、侵襲、血管生成及預后等密切相關[4]。在各類腫瘤細胞中，ID1都是腫瘤增殖的正性調(diào)控基因，可通過抑制細胞分化，促進細胞增殖[15]。

本研究從mRNA水平、蛋白質(zhì)水平雙重證實3種膠質(zhì)母細胞瘤細胞系中ID1的表達情況為：T98G

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Expression and its significance of ID1

in three types glioblastoma cell line

REN Li1, WEI Zilong1, QIU Yongming2, LAN Jin2, GUO Pin2

(1.DepartmentofNeurosurgeryShanghaiPudongHospital,Shanghai, 201399; 2.Department

ofNeurosurgeryRenjiHospitalAffiliatedtoSchoolofMedicineinShanghaiJiaotong

University,Shanghai, 200127)

ABSTRACT:ObjectiveTo explore the expression level of Inhibitor of DNA-binding-1/ inhibitor of differentiation-1 (ID-1) in glioblastoma cell line and to analyze the relationship between ID-1 expression level and radiosensitivity. MethodsReal-time PCR and immunoblotting were used to detected the expression level of ID1 in 3 kinds of glioblastoma cell line (T98G, A172 and U251) and the expression differences were compared. ResultsThe sequence of the mRNA expression level of ID1 in 3 kinds of glioblastoma cell line was T98G

KEYWORDS:Inhibitor of DNA-binding-1/ inhibitor of differentiation-1 (ID-1); glioblastoma; radiosensitivity; immunoblotting

通信作者:魏子龍, E-mail: weizilong2007@163.com

基金項目:上海市浦東新區(qū)衛(wèi)生和計劃生育委員會科技發(fā)展專項基金(PW2013A-19)

收稿日期:2014-12-23

中圖分類號:R 730.26

文獻標志碼:A

文章編號:1672-2353(2015)09-062-03

DOI:10.7619/jcmp.201509018