EGFR及Mfn2在乳腺癌進(jìn)展中的意義及其相關(guān)性研究

張順禮, 胡繼衛(wèi), 馬　杰, 張景華, 王　宇, 谷　崢, 陳晶晶

(1. 河北省唐山市人民醫(yī)院 乳腺外科, 河北 唐山, 063001; 2. 云南中醫(yī)學(xué)院臨床醫(yī)學(xué)院, 云南 昆明, 650000)

EGFR及Mfn2在乳腺癌進(jìn)展中的意義及其相關(guān)性研究

張順禮1, 2, 胡繼衛(wèi)1, 馬杰1, 張景華1, 王宇1, 谷崢1, 陳晶晶1

(1. 河北省唐山市人民醫(yī)院 乳腺外科, 河北 唐山, 063001; 2. 云南中醫(yī)學(xué)院臨床醫(yī)學(xué)院, 云南 昆明, 650000)

摘要:目的研究外周血線粒體融合蛋白2(Mfn2)在表皮生長因子受體(EGFR)為陽性的乳腺癌患者疾病進(jìn)展中的表達(dá)情況，探討其與EGFR及乳腺癌預(yù)后的關(guān)系。方法選擇EGFR陽性乳腺癌患者44例，檢測其外周血Mfn2 mRNA表達(dá)。隨訪3年出現(xiàn)疾病進(jìn)展時(shí)，再次檢測患者外周血Mfn2 mRNA表達(dá)情況。結(jié)果26例患者出現(xiàn)疾病進(jìn)展，外周血Mfn2陽性表達(dá)組疾病進(jìn)展率為42.1%(8/19), 陰性組疾病進(jìn)展率為72.0%(18/25), 差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05); 疾病進(jìn)展后，陽性組Mfn2陽性率降至52.63%(10/19), 陰性組陽性表達(dá)率為0%; 陽性組出現(xiàn)疾病進(jìn)展患者陽性率為25.00%(2/8), 未進(jìn)展患者陽性率72.72%(8/11), 差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。結(jié)論EGFR、Mfn2在乳腺癌的復(fù)發(fā)、轉(zhuǎn)移中發(fā)揮重要作用，聯(lián)合檢測EGFR、Mfn2可能作為監(jiān)測乳腺癌進(jìn)展、提高乳腺癌復(fù)發(fā)的診斷效率及預(yù)測腫瘤預(yù)后的重要生物學(xué)指標(biāo)。

關(guān)鍵詞:乳腺癌; 表皮生長因子受體; 線粒體融合蛋白-2; 免疫組織化學(xué); 逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈反應(yīng)

乳腺癌是女性最常見的惡性腫瘤之一，全球每年約有57萬例乳腺癌患者發(fā)生遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移[1]。乳腺癌的發(fā)生主要涉及癌基因的激活與抑癌基因的失活。中國學(xué)者陳光慧[2]等研究發(fā)現(xiàn)線粒體融合蛋白2(Mfn2)是一種重要的細(xì)胞增殖抑制因子，也稱為細(xì)胞增殖抑制基因(HSG)。研究認(rèn)為Mfn2可能是一種高效的抑癌基因[3], Mfn2表達(dá)異?；蚬δ苋笔Э赡苁悄[瘤發(fā)生發(fā)展的重要原因[4]。表皮生長因子受體(EGFR)的過度表達(dá)與腫瘤的轉(zhuǎn)移和血管形成有關(guān)[5]。本研究組前期研究發(fā)現(xiàn)EGFR陽性患者中Mfn2 mRNA的表達(dá)率顯著低于EGFR陰性者[6]。為進(jìn)一步研究二者與疾病進(jìn)展的關(guān)系，本研究選取青年乳腺癌EGFR陽性表達(dá)者，分析患者疾病進(jìn)展過程中外周血Mfn2表達(dá)情況，探討EGFR與Mfn2在乳腺浸潤性導(dǎo)管癌患者的疾病發(fā)生發(fā)展中可能的作用及臨床意義，報(bào)告如下。

1資料與方法

選擇2011年1月—2011年10月在唐山市人民醫(yī)院進(jìn)行診斷、治療的所有乳腺癌患者的臨床資料進(jìn)行統(tǒng)計(jì)，入選標(biāo)準(zhǔn): ① 年齡30～35歲，體質(zhì)量指數(shù)20～24.9，已婚; ② 臨床資料完整，有手術(shù)病歷，根據(jù)國際抗癌協(xié)會(huì)乳腺癌TNM分期: Ⅲ期; ③ 病理診斷為浸潤性導(dǎo)管癌明確，并行免疫組化雌激素受體(ER)、孕激素受體(PR)、人表皮生長因子受體2(HER-2)等相關(guān)基因檢測均為陰性; ④ 無其他基礎(chǔ)疾病，所有患者術(shù)前未接受化療、放療。免疫組織化學(xué)法檢測乳腺癌組織，篩選出符合上述標(biāo)準(zhǔn)的EGFR陽性表達(dá)患者44例。根據(jù)手術(shù)及放化療治療后外周血中Mfn2的表達(dá)情況分為Mfn2陽性表達(dá)組19例及陰性表達(dá)組25例，隨訪3年，每3個(gè)月隨訪1次。

PCR引物：引物的設(shè)計(jì)及合成由上海生工北京測序部負(fù)責(zé)完成。引物序列如下: Mfn2引物上游5′-AGGGACTTGCCTCTCTTCTC-3′, 下游5′-TCCACCATCCATCCTTCTAC-3′; HGADPH引物上游5′-GGGAAACTGTGGCGTGAT-3′, 下游5′-TGGGTGTCGCTGTTGAAGT-3′。

總RNA提取：分別采集患者放化療結(jié)束后及隨訪結(jié)束后(或出現(xiàn)疾病進(jìn)展后)靜脈血液標(biāo)本3～5 mL，EDTA管抗凝。人淋巴細(xì)胞分離液分離有核細(xì)胞，采用TRNzol試劑按說明書操作，經(jīng)氯仿分層，異丙醇沉淀，75%乙醇洗滌，提取總RNA。2%瓊脂糖凝膠電泳檢測RNA的完整性，紫外分光光度計(jì)測定其濃度和純度。

cDNA合成：取總RNA2 μL, 根據(jù)逆轉(zhuǎn)錄試劑盒進(jìn)行cDNA第一鏈的合成，反應(yīng)條件: 1 g/L模板總RNA 2 μL, 0.5 g/L Oligo(dT) 181 μL, RNasefree ddH2O 9 μL, 70 ℃水浴5 min, 冰浴30 s, 再于試管內(nèi)加入5倍Reaction Buffer 4 μL, RNase Inhibitor 1 μL, dNTP Mix 2 μL, 反應(yīng)混合物于37 ℃水浴5 min, 最后加入1 μL MMuLV RT(200 U/μL), 終體積為20 μL, 42 ℃水浴60 min, 70 ℃加熱10 min結(jié)束反應(yīng)，-20 ℃冷凍保存。

PCR擴(kuò)增：取第一鏈cDNA 2.0 μL按PCR試劑盒組建反應(yīng)，反應(yīng)體系總體積25 μL。第一鏈cDNA 2.0 μL, 10 μmol上游引物1 μL, 10 μmol下游引物1 μL, 2倍PCR Master Mix 12.5 μL, ddH2O 8.5 μL。PCR產(chǎn)物經(jīng)2%瓊脂糖凝膠電泳，EB染色，紫外燈下照相。

所有患者進(jìn)行定期隨訪，RT-PCR法檢測疾病進(jìn)展前后外周血Mfn2 mRNA的表達(dá)，比較外周血Mfn2陽性組、陰性組疾病進(jìn)展率及疾病進(jìn)展前后Mfn2陽性表達(dá)率變化。

2結(jié)果

2.1　RT-PCR檢測Mfn2 mRNA表達(dá)

HGADPH產(chǎn)物為296 bp，Mfn2的PCR產(chǎn)物瓊脂糖凝膠電泳可見大小約143 bp左右的特異性條帶，見圖1, 符合目的基因片段大小。

注:1.DNAmarker;2.外周血Mfn2mRNA陽性表達(dá)圖1 PCR擴(kuò)增后Mfn2mRNA的表達(dá)

2.2　外周血Mfn2陽性組及陰性組疾病進(jìn)展率比較

至2014年10月，共26例乳腺癌患者疾病臨床證實(shí)遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移或局部復(fù)發(fā)，外周血Mfn2陽性表達(dá)組疾病進(jìn)展率為42.1%(8/19), 陰性組疾病進(jìn)展率為72.0%(18/25), 差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。

2.3　疾病進(jìn)展后2組患者M(jìn)fn2陽性表達(dá)率比較

在限定除外其他相關(guān)因素影響下，疾病進(jìn)展后，陽性組Mfn2陽性率降至52.63%(10/19), 陰性組陽性表達(dá)率為0; 陽性組發(fā)生疾病進(jìn)展患者M(jìn)fn2陽性率為25.00%(2/8), 未進(jìn)展患者陽性率72.72%(8/11), 差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。

3討論

乳腺癌的發(fā)生是一個(gè)復(fù)雜的多因素、多步驟的病理生理過程[7-8]。青年乳腺癌具有發(fā)展快、侵襲性高、預(yù)后差等特點(diǎn)[9]。有文獻(xiàn)報(bào)道Mfn2在乳腺癌組織中的表達(dá)水平較正常組織降低，Mfn2低表達(dá)可能與乳腺癌的發(fā)生有關(guān)，且通過下調(diào)Mfn2表達(dá)量可能會(huì)增加乳腺癌患病風(fēng)險(xiǎn)[10]。研究發(fā)現(xiàn)Mfn2表達(dá)異?；蚬δ苋笔Э赡苁悄[瘤發(fā)生的重要原因[11]。隨著Mfn2抑制細(xì)胞增殖作用的發(fā)現(xiàn)，人們開始關(guān)注它在抗腫瘤方面發(fā)揮的作用[12]。付玉環(huán)等[13]研究發(fā)現(xiàn)乳腺癌Mfn2表達(dá)率較癌旁正常乳腺下降，且乳腺癌Mfn2表達(dá)與組織學(xué)分級(jí)、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和雌激素受體有關(guān)，可作為判斷乳腺癌生物學(xué)行為的良好指標(biāo)。EGFR及其配體EGF可啟動(dòng)Ras-Raf-MAPK信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑，其對(duì)細(xì)胞生長、增殖、發(fā)育分化及癌細(xì)胞產(chǎn)生起重要作用,EGFR高表達(dá)會(huì)促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的增殖、黏附、轉(zhuǎn)移以及血管生成，抑制腫瘤細(xì)胞的凋亡，進(jìn)而促進(jìn)腫瘤的進(jìn)展，而該途徑可被Mfn2抑制，導(dǎo)致EGFR表達(dá)下調(diào)[15]。Ratchford等[14]研究指出EGFR高表達(dá)的腫瘤患者易發(fā)生轉(zhuǎn)移，且復(fù)發(fā)率高、存活期短。

本研究組前期研究結(jié)果顯示乳腺癌EGFR陽性患者M(jìn)fn2表達(dá)率顯著低于EGFR陰性者，故本研究通過入組篩選，選擇EGFR受體陽性乳腺癌患者，降低或去除其他多因素的影響,定期隨訪其3年內(nèi)疾病進(jìn)展情況，結(jié)果顯示，乳腺癌組織EGFR受體陽性情況下，外周血Mfn2表達(dá)陰性組疾病進(jìn)展率顯著高于外周血中Mfn2表達(dá)陽性組，與文獻(xiàn)報(bào)道一致[16], 疾病進(jìn)展后，陽性組Mfn2陽性率降低，陽性組疾病進(jìn)展患者陽性率明顯低于未進(jìn)展患者陽性率。分析認(rèn)為，EGFR的高表達(dá)可能會(huì)引起Mfn2表達(dá)異?；蚬δ苋笔В瑥亩痣S訪3年后乳腺患者疾病進(jìn)展后的外周血Mfn2 mRNA的陽性表達(dá)率下降，而外周血Mfn2陽性表達(dá)一定程度上可抑制EGFR及其配體EGF啟動(dòng)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑，從而使EGFR表達(dá)下調(diào)，在一定程度上減緩腫瘤進(jìn)展。

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Significance and the relevance study of EGFR

and Mfn2 in the progression of breast cancer

ZHANG Shunli1, 2, HU Jiwei1, MA Jie1, ZHANG Jinghua1, WANG Yu1,

GU Zheng1, CHEN Jingjing1

(1.DepartmentofBreastCancer,TangshanPeople′sHospital,Tangshan,Hebei, 063001;

2.SchoolofClinicalMedicine,YunnanUniversityofTCM,Kunming,Yunnan, 650000)

ABSTRACT:ObjectiveTo study the expression of peripheral blood Mitochondria fusion protein-2 (Mfn2) in the disease progression of breast cancer patients with positive epidermal growth factor receptor (EGFR) and to explore its relationship with EGFR and the prognosis of patients with breast cancer. MethodsEGFR expression in the cancerous tissue of patients with breast cancer was detected by histoimmunochemical method, in which 44 patients with positive expression of EGFR were selected. The expression of peripheral blood mfn2 mRNA was detected, which was re-detected when disease progressed after 3 years-follow-up. ResultsOf all patients, 26 patients had disease progression. The disease progression rates in positive and negative expression groups of peripheral blood Mfn2 were 42.1% (8/19) and 72.0% (18/25), respectively, and the difference was significant (P<0.05). After disease progression, the positive expression rates of Mfn2 in positive and negative expression groups decreased to 52.63% (10/19) and 0%. And the positive rates of patients with disease progression in positive expression group and non-disease progression group were 25.00% (2/8) and 72.72% (8/11), respectively, and the differences were significant (P<0.05). ConclusionEGFR and Mfn2 play an important role in the recurrence and metastasis of breast cancer, and their joint detection can be used as an critical biological marker for the surveillance of disease progression and promote the diagnostic rate of the recurrence and the prognosis of breast cancer.

KEYWORDS:breast cancer; epidermal growth factor receptor; Mitochondria fusion protein-2; histoimmunochemical method; reverse transcription-polymerase chain reaction

通信作者:張景華, E-mail: jhzh2010@163.com

基金項(xiàng)目:中國高校醫(yī)學(xué)期刊臨床專項(xiàng)資金(11321419)

收稿日期:2014-12-25

中圖分類號(hào):R 737.9

文獻(xiàn)標(biāo)志碼:A

文章編號(hào):1672-2353(2015)09-059-03

DOI:10.7619/jcmp.201509017