β-咔啉類生物堿對人胃癌SGC-7901細胞增殖、凋亡的影響及機制探討

樊玉祥, 曾凡業(yè), 張洪亮

(新疆醫(yī)科大學(xué)附屬中醫(yī)醫(yī)院 腫瘤科, 新疆 烏魯木齊, 830000)

β-咔啉類生物堿對人胃癌SGC-7901細胞增殖、凋亡的影響及機制探討

樊玉祥, 曾凡業(yè), 張洪亮

(新疆醫(yī)科大學(xué)附屬中醫(yī)醫(yī)院 腫瘤科, 新疆 烏魯木齊, 830000)

摘要:目的觀察β-咔啉類生物堿對體外培養(yǎng)的人胃癌SGC-7901細胞增殖及凋亡的影響，并探討其作用機制。方法不同濃度β-咔啉類生物堿處理人胃癌SGC-7901細胞48 h后，檢測細胞增殖、凋亡情況，并以熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)(RT-PCR)和蛋白印跡法(Western blot)分別測定細胞中抑癌基因PTEN、蛋白激酶B(AKT)基因mRNA及其蛋白表達。結(jié)果不同濃度的β-咔啉類生物堿均能抑制人胃癌SGC-7901細胞的增殖，其中40 μg/mL濃度的抑制效果較其他濃度及5-Fu干預(yù)組更顯著(P<0.01), 并可誘導(dǎo)細胞凋亡。不同濃度β-咔啉類生物均可引起PTEN mRNA和蛋白表達增加, AKT mRNA和蛋白表達減少，其中40 μg/mL濃度的調(diào)節(jié)效果較其他濃度及5-Fu干預(yù)組更顯著(P<0.01)。結(jié)論β-咔啉類生物堿可抑制人胃癌SGC-7901細胞增殖，誘導(dǎo)凋亡，其作用機制可能是通過上調(diào)PTEN及下調(diào)AKT蛋白的表達實現(xiàn)。

關(guān)鍵詞:β-咔啉類生物堿; 人胃癌SGC-7901細胞; 抑癌基因PTEN; 蛋白激酶B; 細胞凋亡

β-咔啉類生物堿是從新疆地產(chǎn)藥材駱駝蓬種子中所提取出的生物堿，國內(nèi)研究發(fā)現(xiàn)β-咔啉類生物堿有較廣的抗腫瘤譜，且毒副作用小[1-3]。目前雖有駱駝蓬的粗提取物應(yīng)用于臨床腫瘤的治療，但其抗腫瘤機制尚未闡明。PTEN于1997年被克隆并命名，其編碼的蛋白在胞漿中表現(xiàn)出雙重特異性磷酸酶活性，是迄今為止發(fā)現(xiàn)的第一個具有磷酸酶活性的抑癌基因，在細胞凋亡、細胞周期阻滯、細胞遷移過程起關(guān)鍵性作用[4]。蛋白激酶B(AKT)與人類病毒癌基因v-AKT高度同源，研究表明其在早、中、晚期胃癌組織中的表達水平均較正常胃黏膜組織高[5]。本實驗通過觀察β-咔啉類生物堿對人胃癌SGC-7901細胞增殖作用的影響及凋亡的過程，從而探討β-咔啉類生物堿體外抗腫瘤的機制。

1材料與方法

1.1　材料

1.1.1主要試劑: β-咔啉類生物堿(北京中醫(yī)藥大學(xué)劉永剛教授惠贈), CCK-8溶液(碧云天生物技術(shù)研究所)，DNA Ladder抽提試劑盒(碧云天生物技術(shù)研究所), Hoechst 33258染色液(碧云天生物技術(shù)研究所)，即用型細胞和組織總RNA提取試劑(英國Invitrogen公司)，瓊脂糖(上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司)，高靈敏度飛克級化學(xué)發(fā)光液Super Signal West Prico Chemiluminescent Substrate(美國Thermo Scientific公司), BCA蛋白濃度測定試劑盒(北京生化科技有限公司)，β-actin(英國abcam公司)，蛋白預(yù)染Marker(美國Thermo Scientific公司)，山羊抗兔IgG抗體，過氧化酶抑制物(美國Thermo Scientific公司), AKT蛋白抗體(英國abcam公司)，PTEN蛋白抗體(英國abcam公司)，Chemiscope 3000化學(xué)發(fā)光成像儀系統(tǒng)(上海勤翔科學(xué)儀器有限公司)，蛋白轉(zhuǎn)膜儀(美國Bio-Rad公司)。

1.1.2細胞來源：人胃癌SGC-7901細胞(中國科學(xué)院上海生命科學(xué)研究院細胞資源中心)。常規(guī)培養(yǎng)于含10%胚胎牛血清培養(yǎng)液中，置于5% CO2、37 ℃的孵育箱中培養(yǎng)及傳代。

1.2　細胞活性的檢測

取對數(shù)生長期SGC7901細胞，96孔板中加入RPMI-1640培養(yǎng)液，配制 5×104個/mL濃度的細胞懸液200 μL/孔, 37 ℃、5% CO2培養(yǎng)24 h 貼壁；后加入200 μL不同濃度(0、10、20、40 μg/ mL)的β-咔啉類生物堿與5 μg/mL陽性對照藥物5-氟尿嘧啶(5-Fu)，每組5個重復(fù), 37 ℃共培養(yǎng)48 h, 按照CCK-8說明書檢測細胞活性。

1.3　細胞凋亡的檢測

1.3.1Hoechst 33258熒光染色法：取1 mL處于對數(shù)生長期的SGC-7901細胞，按1×106個/mL的濃度接種25 cm2的細胞培養(yǎng)瓶內(nèi)。常規(guī)培養(yǎng)24 h后，以不同濃度的β-咔啉類生物堿(0、20、40 μg/mL)與40 μg/mL陽性對照藥物5-Fu分別干預(yù)48 h后終止培養(yǎng)。以0.25%胰酶消化細胞, 1 200 r/min的速度離心5 min, 用PBS緩沖液洗滌并懸浮細胞，取一滴懸液于載玻片上吹散，加3∶1甲醇/冰醋酸固定液固定10 min, 自然晾干后加入5 mg/L熒光染液Hochest33258避光染色45 min, 再用雙蒸水洗3次，自然晾干，置于正置熒光顯微鏡下觀察并拍攝。

1.3.2DNA Ladder法：不同濃度藥物干預(yù)48 h后收集細胞，按DNA Ladder 提取試劑盒說明書提取細胞DNA, 1.2%的瓊脂糖凝膠、100 V、25 min條件電泳，觀察凋亡梯狀條帶。

1.4　PTEN mRNA與AKT mRNA的檢測

不同濃度藥物干預(yù)48 h后收集細胞，按照Trizol試劑盒說明書操作，提取總RNA。并檢測RNA濃度, A260/A280, 電泳檢測RNA完整性以合成cDNA。PTEN上游引物5′-TTTGAAGACCATAACCCACC-3′, 下游引物5′-ATTACACCAGTTCGTCCCTT-3′, 擴增產(chǎn)物134 bp, AKT上游引物5′-GTCATCGAACGCACCTTCCA-3′, 下游引物5′-AGCTTCAGGTACTCAAACTC-3′, 擴增產(chǎn)物218 bp。以β-actin為內(nèi)參，計算表達量。

1.5　PTEN和AKT蛋白表達的檢測

不同濃度藥物干預(yù)48 h后收集細胞，經(jīng)液氮研磨后加入500 μL RIPA裂解液，充分混勻，冰上放置30 min后勻漿器勻漿，冰上放置30 min, 12 000 r/min的速度在4 ℃條件下離心15 min, 收集上清，加入5×SDS-PAGE loading buffer，沸水加熱處理5 min, 使蛋白充分變性, 4 ℃條件下, 12 000 r/min的速度離心10 min，取上清備用。BCA法測定總蛋白濃度，用ECL ChemiScope 3000化學(xué)發(fā)光儀檢測、拍照，計算目的蛋白的積分光密度值，以β-actin為內(nèi)參，計算其表達豐度。

1.6　觀察指標

觀察不同濃度β-咔啉類生物堿對SGC-7901細胞增殖、凋亡的影響，及不同濃度下PTEN mRNA、AKT mRNA及蛋白的表達水平差異。

2結(jié)果

2.1　β-咔啉類生物堿對SGC-7901細胞增殖的影響

除48 h時10 μg/mL濃度β-咔啉類生物堿干預(yù)下的OD值與陰性對照組無顯著差異外(P>0.05), 其余各時間點及不同濃度β-咔啉類生物堿干預(yù)下的細胞OD值均低于陰性對照組，5-Fu干預(yù)組也低于陰性對照組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05或P<0.01)。24 h時，隨藥物濃度增加，OD值逐漸降低，兩兩比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01), 5-Fu干預(yù)組低于10、20 μg/mL濃度(P<0.01)，高于40 μg/mL濃度(P<0.01); 48 h時, 40 μg/mL濃度藥物干預(yù)下的OD值低于其他2組(P<0.01)，而10 μg/mL和20 μg/mL濃度之間差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05), 5-Fu干預(yù)組高于40 μg/mL濃度(P<0.01), 與其他濃度無統(tǒng)計學(xué)差異(P>0.05)。此外，陰性對照組及不同藥物濃度下的OD值在48 h時均較24 h降低，差異有顯著意義(P<0.05或P<0.01)。見表1。

濃度/(μg/mL)24hOD值48hOD值01.85±0.291.39±0.22▲101.49±0.06*1.21±0.14▲▲201.32±0.05**##1.07±0.10*▲▲400.63±0.01**##△△0.52±0.02**##△△▲▲5-Fu1.19±0.04**##△△▽▽1.01±0.21*▽▽

與0 μg/mL比較, *P<0.05，**P<0.01;

與10 μg/mL比較, ##P<0.01; 與20 μg/mL比較,

△△P<0.01; 與40 μg/mL比較，▽▽P<0.01;

與同一濃度下24 h比較, ▲P<0.05, ▲▲P<0.01。

2.2　β-咔啉類生物堿對人胃癌SGC-7901細胞凋亡的影響

正常人胃癌SGC-7901細胞核染色特點為：核染色疏松細致，核仁大而清晰。不同濃度的β-咔啉類生物堿處理后的SGC-7901細胞在熒光顯微鏡下觀察：細胞核固縮，核內(nèi)染色質(zhì)在局部區(qū)域內(nèi)凝集，致密濃染，部分可見核碎裂，出現(xiàn)凋亡小體。見圖1。由DNA Ladder電泳圖可見，隨著β-咔啉類生物堿濃度的增加，集中在100 bp處的片段越來越多，細胞凋亡越來越嚴重，5-Fu也有一定的效果。見圖2。

(A. 0 μg/mL; B. 10 μg/mL; C. 20 μg/mL; D. 40 μg/mL; E. 5 μg/mL 5-Fu)

圖1不同濃度及5μg/mL5-Fu干預(yù)48 h后細胞核染色特點400倍

2.3　PTEN、AKT基因mRNA的表達水平

與陰性對照組比較，不同濃度β-咔啉類生物堿及40 μg/mL濃度5-Fu干預(yù)下的PTEN基因mRNA顯著上調(diào)(P<0.01), AKT基因mRNA顯著下調(diào)(P<0.01)。不同藥物濃度干預(yù)組之間PTEN及AKT基因mRNA均有差異，而5-Fu干預(yù)組的PTEN基因mRNA高于10 μg/mL濃度β-咔啉類生物堿干預(yù)組(P<0.01), 低于20、40 μg/mL濃度β-咔啉類生物堿干預(yù)組(P<0.01); 5-Fu干預(yù)組的AKT基因mRNA低于10 μg/mL濃度β-咔啉類生物堿干預(yù)組(P<0.01), 高于40 μg/mL濃度β-咔啉類生物堿干預(yù)組(P<0.01)。見表2。

表2不同藥物濃度干預(yù)下PTEN、AKT基因mRNA

濃度/(μg/mL)PTENAKT01.01±0.151.00±0.04101.28±0.150.59±0.06**202.75±0.23**##0.38±0.04**##404.64±0.36**##△△0.22±0.02**##△△5-Fu2.12±0.21**##△▲▲0.33±0.01**##▲▲

與0μg/mL比較，**P<0.01; 與10μg/mL比較,

##P<0.01; 與20μg/mL比較, △P<0.05,

△△P<0.01; 與40μg/mL比較, ▲▲P<0.01。

2.4　PTEN、AKT蛋白的表達水平

Western Blotting結(jié)果顯示，干預(yù)48 h后，PTEN蛋白條帶亮度隨β-咔啉類生物堿濃度增加而增加，而AKT的條帶亮度逐漸減弱。見圖3。

圖2 不同濃度藥物干預(yù)下SGC-7901細胞的瓊脂糖凝膠電泳

圖3 WesternBlotting檢測PTEN、AKT蛋白的表達

3討論

胃癌目前仍是亞洲地區(qū)第二大致死性疾病[6-7], 在中國發(fā)病率居消化道腫瘤第一位，早期胃癌的治療手段主要以外科手術(shù)切除為主。但是手術(shù)治療和(或)其聯(lián)合放化療治療進展期胃癌仍存在巨大的困難[8], 如手術(shù)風險、痛苦，放化療的毒副反應(yīng)等，患者往往難以耐受。近年來中藥在抗腫瘤方面作用機制的研究的越來越受到多方學(xué)者的重視。前期研究表明，新疆藥材駱駝蓬中提取的去氫駱駝蓬堿和駱駝蓬堿混合生物堿具有促進胃癌SGC-7901細胞凋亡的作用[9]。本實驗所使用的β-咔啉類生物堿采用電噴霧質(zhì)譜儀這一重要手段進行提取[10], 對駱駝蓬生物總堿經(jīng)行純化，在藥物層面最大限度地排除了干擾因素，也是對“單體復(fù)方”這一概念進行有益的探索[11-12]。

細胞的凋亡是由體內(nèi)外因素觸發(fā)細胞內(nèi)預(yù)存的死亡程序而導(dǎo)致的細胞程序性死亡，是從細胞外細胞到細胞內(nèi)信號通路再到凋亡相關(guān)基因和酶的復(fù)雜過程[13]。其形態(tài)學(xué)上有特征性改變：如胞漿濃縮，核染色質(zhì)固縮，細胞核碎裂，甚至形成凋亡小體。本次實驗中通過Hoechest33258細胞核染色法在熒光顯微鏡下觀察細胞核形態(tài)學(xué)改變，該方法較為直觀。在分子層面上，細胞凋亡改變之一就是細胞染色體DNA有控的斷裂與降解。DNA的有控降解是一種內(nèi)源性核酸內(nèi)切酶作用的結(jié)果，該酶在核小體連接部位切斷染色體DNA，由于片段長短成倍數(shù)關(guān)系，這種降解表現(xiàn)在瓊脂糖凝膠電泳中呈現(xiàn)特異性梯狀ladder圖譜，成為細胞凋亡的特異性指標。

PTEN對腫瘤細胞的侵襲和轉(zhuǎn)移具有調(diào)控作用，溫玉剛等[14]報道，PTEN表達缺失與AKT蛋白表達上調(diào)相關(guān)。胃癌組織中PTEN基因啟動因子過度甲基化可引起該基因的失活，且腫瘤的惡性程度與甲基化呈正相關(guān)。AKT參與與細胞增殖或凋亡相關(guān)的多條信號通路，如AKT/mTOR信號通路是細胞增殖相關(guān)的重要信號通路，AKT可通過激活下游mTOR基因表達促進胃癌細胞生長[15]，而PI3K/AKT途徑在抵抗Fas調(diào)節(jié)凋亡機制中起重要作用，可導(dǎo)致體外細胞的凋亡[16], AKT活性增強與包括胃癌在內(nèi)的眾多惡性腫瘤的發(fā)生發(fā)展關(guān)系密切[17]。

本實驗表明，β-咔啉類生物堿對體外培養(yǎng)的SGC-7901細胞的增殖具有一定抑制作用，藥物濃度越高抑制作用越明顯，并可誘導(dǎo)其凋亡。同時，β-咔啉類生物堿及陽性對照藥物5-Fu均可引起PTEN基因mRNA顯著上調(diào)，AKT基因mRNA顯著下調(diào)，其中40 μg/mL濃度的調(diào)節(jié)結(jié)果最為顯著，顯著優(yōu)于其他濃度及5-Fu, 提示β-咔啉類生物堿可能破壞PTEN/AKT二者之間的平衡，導(dǎo)致PTEN抑癌機制占優(yōu)勢，使細胞向凋亡方向發(fā)展，最終實現(xiàn)抗腫瘤的效果。

參考文獻

[1]武姍姍, 張洪亮. 駱駝蓬研究現(xiàn)狀[J]. 新疆中醫(yī)藥, 2011, 29(6): 61.

[2]劉俊玲, 烏慶超, 王朝輝, 等. 去氫駱駝蓬堿誘導(dǎo)急性白血病Jurkat細胞凋亡及其機制[J]. 光明中醫(yī), 2012, 227(2): 242.

[3]Cinelli M A, Morrell A, Dexheimer T S, et al. Design, synthesis, and biological evaluation of 14-substituted aromathecins as topoisomerase I inhibitors[J]. J Med Chem, 2008, 51(15): 4609.

[4]Papa A, Wan L, Bonora M, et al. Cancer-associated PTEN mutants act in a dominant-negative manner to suppress PTEN protein function[J]. Cell, 2014, 157(3): 595.

[5]周詩瓊, 陳洪雷, 姚峰, PTEN、PI3K和Akt蛋白在胃癌組織中的表達及其臨床意義[J]. 武漢大學(xué)學(xué)報: 醫(yī)學(xué)版, 2006, 27(4): 432.

[6]Japanese Gastric Cancer Association. Japanese gastric cancer treatment guidelines 2010 (ver. 3)[J]. Gastric cancer, 2011, 14(2): 113.

[7]Emoto S, Ishigami H, Yamashita H, et al. Clinical significance of CA125 and CA72-4 in gastric cancer with peritoneal dissemination[J]. Gastric Cancer, 2012, 15(2): 154.

[8]Arkenau H T. Gastric cancer in the era of molecularly targeted agents: current drug development strategies[J]. J Cancer Res Clin Oncol, 2009, 135(7): 855.

[9]樊玉祥, 何文婷, 李沫函, 等. 三種不同方法檢測β-咔啉類生物堿所致的人胃癌SGC-7901細胞凋亡[J]. 實驗與檢驗醫(yī)學(xué), 2013, 31(6): 541.

[10]Scalbert, A, Brennan, L, Feihn, O, et al. Mass spectrometry Based Metabolmics and Recommendations for Future Progress with Particular Focus on nutrition Research[J]. Metabolomics, 2009, 5(3): 435.

[11]程堅, 張新民, 沈自尹, 等. 一種中藥單體小復(fù)方對變應(yīng)性鼻炎模型小鼠的免疫調(diào)節(jié)作用[J]. 中西醫(yī)結(jié)合學(xué)報, 2011, 9(12): 1360.

[12]王瑞, 何偉, 張衛(wèi)星, 等. 不同劑量中藥單體復(fù)方對(6o)Co-γ致雄小鼠生精功能障礙的治療作用[J]. 中國男科學(xué)雜志, 2010, 24(2): 23.

[13]Giansanti V, Torriglia A, Scovassi A I. Conversation between apoptosis and autophagy:“Is it your turn or mine?”[J]. Apoptosis, 2011, 16(4): 321.

[14]溫玉剛, 王權(quán), 周崇治, 等. 胃癌抑癌基因PTEN突變對PI3K/AKT通路的影響[J]. 中華實驗外科雜志, 2010, 27(10): 1466.

[15]Du W, Wang S, Zhou Q, et al. ADAMTS9 is a functional tumor suppressor through inhibiting AKT/mTOR pathway and associated with poor survival in gastric cancer[J]. Oncogene, 2013, 32(28): 3319.

[16]Kumar D, Shankar S, Srivastava R K. Rottlerin induces autophagy and apoptosis in prostate cancer stem cells via PI3K/Akt/mTOR signaling pathway[J]. Cancer lett, 2014, 343(2): 179.

[17]晏淼, 朱正秋, 卞保祥, 等. Akt/mTOR信號通路蛋白在胃癌組織中的表達及其臨床意義[J]. 中國全科醫(yī)學(xué), 2011, 14(10C): 3442.

Exploration on influence and mechanism of

β-carbolines alkaloid on human gastric cancer

SGC-7901 cell proliferation and apoptosis

FAN Yuxiang, ZENG Fanye, ZHANG Hongliang

(DepartmentofOncology,AffiliatedTCMHospitalofXinjiangMedicalUniversity,

Urumchi,Xinjiang, 830000)

ABSTRACT:ObjectiveTo observe the influence of β-carbolines alkaloid on in-vitro cultured human gastric cancer SGC-7901 cell proliferation and apoptosis and to explore its functional mechanism. MethodsHuman gastric cancer SGC-7901 cells were treated with different-concentration β-carbolines alkaloid for 48 hours so as to detect the cell proliferation and apoptosis, and fluorescence quantitative polymerase chain reaction (RT-PCR) and Western blot analysis were conducted to detect the expressions of anti-oncogene PTEN mRNA and protein kinase B (AKT) gene mRNA as well as their proteins in cells. ResultsDifferent-concentration β-carbolines alkaloid could inhibit the proliferation of human gastric cancer SGC-7901 cells, in which the efficacy treated with 40 μg/mL was evidently higher than other concentrations and 5-Fu intervention group (P<0.01) and it could also induce cell apoptosis. Different-concentration β-carbolines alkaloid could increase the expressions of PTEN mRNA and its protein and reduce the expressions of AKT mRNA and its protein, in which the efficacy of treatment with 40 μg/mL was evidently higher than other concentrations and 5-Fu intervention group (P<0.01). Conclusionβ-carbolines alkaloid can inhibit the human gastric cancer SGC-7901 cell proliferation and induce cell apoptosis, and the functional mechanism may be achieved by up-regulating PTEN protein and down-regulating AKT protein.

KEYWORDS:β-carbolines alkaloid; human gastric cancer SGC-7901 cell; anti-oncogene PTEN; protein kinase B; cell apoptosis

通信作者:張洪亮, E-mailzhanghongliang@csco.org.cn

基金項目:新疆名醫(yī)名方與特色方劑學(xué)實驗室開放基金課題(XJDX0910-2013-6)

收稿日期:2014-12-15

中圖分類號:R 735.2

文獻標志碼:A

文章編號:1672-2353(2015)09-041-05

DOI:10.7619/jcmp.201509012