不同劑量1,25二羥基維生素預處理對局灶性腦缺血再灌注損傷的保護作用

許峰峰, 劉信龍, 徐正平, 楊　冰, 李　明, 張建忠,

肖麗鴻, 廖　環(huán), 丁　強, 李政衛(wèi)

(解放軍第455醫(yī)院, 上海, 200052)

不同劑量1,25二羥基維生素預處理對局灶性腦缺血再灌注損傷的保護作用

許峰峰, 劉信龍, 徐正平, 楊冰, 李明, 張建忠,

肖麗鴻, 廖環(huán), 丁強, 李政衛(wèi)

(解放軍第455醫(yī)院, 上海, 200052)

摘要:目的探討不同劑量1,25二羥基維生素預處理對局灶性腦缺血再灌注損傷的保護作用及機制。方法將60只SD雄性大鼠隨機分為假手術(shù)組、模型組和VD30.5、1.0、1.5 μg/kg預處理組，比較各組神經(jīng)行為評分、炎性因子及TRL2、4水平。結(jié)果與模型組相比，隨著VD3劑量的增加，神經(jīng)行為評分和腦梗死面積均明顯減少, VD3-3組改善最為明顯(P<0.05); 隨著劑量的增高，各實驗組IL-6和TNF-α水平降低越明顯，具有明顯的劑量變化趨勢(P<0.05); IL-10、MDA各組變化差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05); VD3各組TRL2和TRL4均明顯低于模型組，且隨著VD3劑量增加，TRL2和TRL4降低程度明顯增加(P<0.05); 再灌注5 d后觀察各組大鼠存活情況，以VD3-3組為最高83.33%, 差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。結(jié)論VD3對局灶性腦缺血再灌注損傷的保護作用具有劑量依賴性，其機制可能與抑制TLR2、4信號轉(zhuǎn)導通路，減少炎性因子產(chǎn)生有關。

關鍵詞:1,25二羥基維生素D3; 局灶性腦缺血再灌注損傷; TLR2、4; 炎性因子

Protective effect of different dose of

隨著臨床治療手段的提高，血管內(nèi)介入、溶栓、手術(shù)等的開展，使部分缺血性腦血管病患者得到較好治療，但這些手段對隨后發(fā)生的局灶性腦缺血再灌注損傷并無直接幫助，患者預后仍較差[1]。目前局灶性腦缺血再灌注損傷機制并未完全清楚，有學者[2]認為與缺血再灌注過程中氧自由基釋放、神經(jīng)元細胞能量代謝障礙、細胞內(nèi)鈣離子超載、微循環(huán)功能障礙、細胞因子、線粒體功能異常、Kupffer細胞激活及中性粒細胞的活化等因素有關。目前，圍術(shù)期腦缺血再灌注損傷的防治策略包括低溫、改良外科技術(shù)、藥物防治、缺血及藥物預處理、基因治療等方面。但迄今為止，上述眾多的策略尚未妥善解決臨床腦缺血再灌注所致的神經(jīng)功能受損。

最近有學者[3-4]報道活性1,25二羥基維生素D3可通過抗氧化、提高HSP70的表達及對凋亡通路的影響保護腎缺血再灌注損傷，對腦缺血再灌注損傷也有保護作用，但具體機制未見報道。同時，外源性維生素D3在腦缺血再灌注損傷中治療中的作用也無相關報道。本研究擬以大鼠可逆性大腦中動脈閉塞(MCAO)線栓法制作的局灶性缺血再灌注模型為基礎，通過評價不同劑量1,25二羥基維生素D3處理對局灶性腦缺血再灌注損傷的保護作用，現(xiàn)報告如下。

1資料與方法

1.1　試驗動物

健康雄性SD大鼠60只，質(zhì)量250～300 g, 由上海復旦大學實驗動物中心提供，批號20130546。采用隨機數(shù)字表分為假手術(shù)組(Sham組), I/R組和不同劑量VD3組共5組，每組12只。

1.2　建模及干預方法

I/R組采用Longa栓線方法：以10%水合氯醛0.3 mL/kg腹腔麻醉，頸正中切口，暴露右側(cè)頸總動脈(CCA)、頸外動脈(ECA)及頸內(nèi)動脈(ICA)，動脈夾臨時阻斷CCA、ICA，分離ECA遠端，在ECA遠端穿線結(jié)扎，在遠端離斷ECA，用眼科鑷輕輕拉ECA殘端使其與ICA呈一直線，松開ICA動脈夾，從ECA殘端插入備好的4-0硅涂層聚丙烯單絲手術(shù)用縫合線，從分叉處起深度約18 mm, 遇到阻力判斷為阻塞大腦中動脈，停止進線。在ECA殘端穿線，結(jié)扎緊ECA殘端，松開CCA動脈夾。將栓線尾端剪斷留少許約5 mm, 縫合筋膜和皮膚。整個手術(shù)在具有反饋調(diào)節(jié)加熱毯上進行，保持直腸溫度(37±1) ℃,術(shù)后空調(diào)房保暖。栓線栓塞90 min后再灌注，以10%水合氯醛0.3 mL/kg腹腔麻醉，重新打開傷口，將栓線拔出，并重新結(jié)扎ECA殘端，縫合筋膜和皮膚。Sham組僅暴露右側(cè)頸總動脈、頸外動脈及頸內(nèi)動脈，不予以頸內(nèi)動脈栓線處理。術(shù)后大鼠分籠飼養(yǎng)。VD3組于再灌注前8 d每天腹腔注射0.5、1.0、1.5 μg/kg的1,25二羥基維生素D3。

1.3　觀察指標和測定方法

1.3.1細胞表面TLR2、4測定：處死動物后固定取腦，分離中樞神經(jīng)單個核細胞，以流式細胞儀進行表面TLR2、4測定。

1.3.2神經(jīng)功能評分：偏側(cè)肢體無力或癱瘓,是腦卒中的典型癥狀。本實驗參照文獻五分制評分標準，對缺血再灌注2、24 h各組小鼠進行神經(jīng)功能評分: 0分：無神經(jīng)功能缺損癥狀; 1分：左前肢不能完全伸直; 2分：向左側(cè)旋轉(zhuǎn); 3分：行走時向左側(cè)傾倒; 4分：不能自主行走或伴有意識水平降低; 5分：死亡。評分在取材前進行。

1.3.3腦梗死體積測定：小鼠斷頭處死，迅速取出腦組織，去除嗅球、小腦及低位腦干，-20 ℃冰凍10 min, 排刀自前極連續(xù)切取2 mm厚度腦冠狀切片4片，置2% 2,3,5-氯化三苯基四氮吐(TTC)(上海精析化工)生理鹽水溶液中37 ℃避光孵育30 min, 10%甲醛中性緩沖液(pH 7.4)固定過夜。微距相機拍攝，Image Proplus5.1圖像分析軟件計算并統(tǒng)計腦梗死體積。

1.3.4IL-6、IL-10、TNF-α和 MDA含量測定：再灌注腦組織應用冰生理鹽水清洗，用超聲波組織粉碎機和0.1 mol/L磷酸緩沖液(pH 7.4)制成1∶10腦組織勻漿液，并分試管放置在-80 ℃冰箱。根據(jù)Buege and Aust提供的方法測定反應脂質(zhì)過氧化產(chǎn)物丙二醛水平，單位: nmol/mgProt; 雙抗體ELISA法測定IL-6、IL-10、TNF-α水平。

1.4　統(tǒng)計學分析

實驗數(shù)據(jù)以均數(shù)±標準差表示，應用Prism 5軟件進行統(tǒng)計分析，采用單因素方差分析(One-way ANOVA)及兩樣本均數(shù)比較的t檢驗,P<0.05表示差異具有統(tǒng)計學意義。

2結(jié)果

2.1　各組大鼠神經(jīng)行為評分和腦梗死體積分析

與假手術(shù)組相比，各組均建立腦缺血再灌注模型成功(P<0.05); 與模型組相比，隨著VD3劑量的增加，神經(jīng)行為評分和腦梗死面積均明顯減少, VD3-3組改善最為明顯(P<0.05)。見表1。

表1　各組大鼠神經(jīng)行為評分和腦梗死體積分析

與假手術(shù)組比較，*P<0.05; 與模型組比較，#P<0.05。

2.2　各組大鼠細胞因子比較

各組與假手術(shù)組IL-6和TNF-α差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.05); 隨著劑量的增高，各實驗組IL-6和TNF-α水平降低越明顯，具有明顯的劑量變化趨勢(P<0.05); IL-10、MDA各組變化差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。見表2。

2.3　各組大鼠TRL2、4比較

VD3各組TRL2和TRL4均明顯低于模型組，且隨著VD3劑量增加, TRL2和TRL4降低程度明顯增加(P<0.05)。見表3。

表2　各組大鼠細胞因子水平比較

與假手術(shù)組比較，*P<0.05; 與模型組比較，#P<0.05。

表3　各組大鼠TRL2、4比較　%

與假手術(shù)組比較，*P<0.05; 與模型組比較，#P<0.05。

2.4　各組大鼠存活情況分析

再灌注5 d后觀察各組大鼠存活情況，模型組存活率為41.46%(5/12), VD3-1組存活率為58.33%(7/12), VD3-2組存活率為66.67%(8/12), VD3-3組存活率為83.33%(10/12), 以VD3-3組為最高，差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。

3討論

國內(nèi)外尚無1,25二羥基維生素D3對局灶性腦缺血再灌注損傷保護的具體機制，特別是在抗氧化、TLR信號通路、NF-κB凋亡信號通路中機制研究方面，缺乏相關文獻報道。但已有研究[5]發(fā)現(xiàn)，活性維生素D3可通過抗氧化、提高HSP70的表達及對凋亡通路的影響保護腎缺血再灌注損傷，1,25(OH)2D3可通過負反饋調(diào)節(jié)衰減巨噬細胞中TLR信號通路導致的炎癥反應，抑制核因子kB(NF-kB)的激活。作者利用1,25二羥基維生素D3對局灶性腦缺血再灌注損傷大鼠模型進行預處理，探索其是否具有保護作用及作用機制。

結(jié)果發(fā)現(xiàn)，高劑量組(1.5 μg/kg)神經(jīng)行為評分和腦梗死面積均明顯減少，說明1,25二羥基維生素D3對I/R大鼠神經(jīng)行為具有明顯保護作用，而且其作用效果有隨濃度增加的趨勢。從存活情況來看，高劑量組存活率也原因高于其他各組。同時，在這些指標中，較低劑量的2組(0.5 μg/kg、1.0 μg/kg)差異并不明顯，作者猜測1,25二羥基維生素D3對局灶性腦缺血再灌注損傷的保護作用有閾劑量的存在，只有當藥物劑量或濃度到達某一水平時，其保護作用才會明顯體現(xiàn)。但由于1,25二羥基維生素D3對I/R的保護作用研究目前尚少，此種猜想尚需進一步研究驗證。

對其TRL2、4和炎性細胞因子的研究則顯示, 1,25二羥基維生素D3能夠降低TRL2、4和IL-10、TNF-α水平。Marsh BJ[6]認為, TLRs可能是炎性細胞因子的上游觸發(fā)位點。當I/R狀態(tài)下, TLR可以與相應受體如PAMPs結(jié)合，在CD14協(xié)助下TLR自身激活并激活NF-kB等核轉(zhuǎn)錄子，從而引起下游IL-6、IL-10、IL-1、TNF-α等炎性因子和介質(zhì)的合成，進而進一步影響機體的免疫反應強度，使缺血后炎性損傷減輕。Hyakkoku K等[7]利用敲除TLR4小鼠進行的腦缺血動物模型中發(fā)現(xiàn)，去除TLR4后模型腦梗死面積明顯減少，炎癥反正程度也減輕。這也證實TLR信號傳導系統(tǒng)在腦缺血再灌注損傷的發(fā)生中具有重要作用，對其采取措施，減少或阻斷該過程的發(fā)生有利于缺血再灌注損傷的預防和治療。1,25二羥基維生素D3高劑量狀態(tài)下此作用顯著，說明抑制TLR信號轉(zhuǎn)導過程，抑制下游炎性因子表達是1,25二羥基維生素D3作用的重要通路。Wang Y等[8]利用VD3對大鼠中腦的再灌注損傷研究中也支持類似結(jié)論。

也有學者[9-10]認為局灶性腦缺血再灌注損傷中存在抗氧化機制的紊亂，氧自由基對大腦富含脂肪鏈的生物膜進行攻擊，導致出現(xiàn)“瀑布狀”脂質(zhì)過氧化反應，從而引起腦細胞生物膜的破壞，干預機體的抗氧化過程可以發(fā)揮治療作用。但作者在VD3的作用機制中并未發(fā)現(xiàn)MDA的變化，可能腦I/R的發(fā)生機制更為復雜，VD3更主要是作用于TLRs信號轉(zhuǎn)導通路，對機體氧化/抗氧化系統(tǒng)也可能由其他指標完成。不過由于此類研究目前尚無國內(nèi)外證據(jù)支持，仍需進一步探討和驗證。

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1,25-dihydroxyvitamin preconditioningon

focal cerebral ischemia reperfusion injury

XU Fengfeng, LIU Xinlong, XU Zhengping, YANG Bing, LI Ming,

ZHANG Jianzhong, XIAO Lihong, LIAO Huan, DING Qiang, LI Zhengwei

(Shanghai455thHospitalofPeople′sLiberationArmy,Shanghai, 200052)

ABSTRACT:Objective To investigate the protective effect and mechanism of different doses of 1,25-Dihydroxyvitamin preconditioning on focal cerebral ischemia reperfusion injury. MethodsA total of 60 male SD rats were randomly divided into sham operation group, model group and VD3pretreatment group with different dose of 0.5, 1.0 and 1.5 μg/kg. Neurobehavioral score, inflammatory factors and the level of TRL2,4 were compared among five groups. ResultsCompared with the model group, with the doses of VD3increased, neurobehavioral score and area of cerebral infarction significantly decreased, VD3-3 group improved significantly (P<0.05). With the dose increased, levels of IL-6 and TNF-α decreased significantly, and the change showed obvious trend with dose (P<0.05). There were no significant differences of IL-10 and MDA among five groups (P>0.05). TRL2 and TRL4 in each VD3group were significantly lower than those in the model group, and with the dose of VD3increased, TRL2 and TRL4 decreased significantly (P<0.05). The survival conditions of rats in VD3groups after 5 days of reperfusion were observed, 83.33% in VD3-3 group was the highest, and there were significant differences (P<0.05). ConclusionThe protective effect of VD3on focal cerebral ischemia reperfusion injury is dose dependent, and its mechanism may be related to inhibition of signal transduction pathway of TLR2, 4 and reduction of inflammatory factor production.

KEYWORDS:1,25-dihydroxyvitamin D3; focal cerebral ischemia reperfusion injury; TLR2, 4; inflammatory factor

基金項目:全軍醫(yī)藥衛(wèi)生科研基金課題

收稿日期:2014-11-16

中圖分類號:R 743

文獻標志碼:A

文章編號:1672-2353(2015)09-028-04

DOI:10.7619/jcmp.201509008