轉(zhuǎn)化生長因子-β1對新生大鼠星形膠質(zhì)細(xì)胞結(jié)締組織生長因子表達(dá)的影響

李合華, 李　彤, 宋志秀

(新鄉(xiāng)醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院 神經(jīng)內(nèi)科, 河南 衛(wèi)輝, 453100)

轉(zhuǎn)化生長因子-β1對新生大鼠星形膠質(zhì)細(xì)胞結(jié)締組織生長因子表達(dá)的影響

李合華, 李彤, 宋志秀

(新鄉(xiāng)醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院 神經(jīng)內(nèi)科, 河南 衛(wèi)輝, 453100)

摘要:目的觀察轉(zhuǎn)化生長因子(TGF-β1)對新生大鼠星形膠質(zhì)細(xì)胞(Ast)結(jié)締組織生長因子(CTGF)表達(dá)的影響。方法采用新生SD大鼠大腦皮層Ast，以FITC細(xì)胞免疫熒光鑒定后，用含0、1、2、4 ng/mL的TGF-β1分別干預(yù)培養(yǎng)24 h，分別用逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈反應(yīng)(RT-PCR)和蛋白免疫印跡法(Wb)檢測細(xì)胞中CTGF mRNA和蛋白的表達(dá)。結(jié)果TGF-β1能顯著增加Ast中CTGF mRNA及蛋白表達(dá)；隨著TGF-β1濃度的增加，CTGF mRNA和蛋白的表達(dá)量均有升高的趨勢，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。結(jié)論TGF-β1能上調(diào)Ast中CTGF的表達(dá)，而該影響隨TGF-β1濃度增加而顯著，提示TGF-β1可以在一定程度上通過調(diào)節(jié)新生SD大鼠Ast CTGF表達(dá)導(dǎo)致神經(jīng)膠質(zhì)化。

關(guān)鍵詞:星形膠質(zhì)細(xì)胞; 神經(jīng)膠質(zhì)化; 轉(zhuǎn)化生長因子-β1; 結(jié)締組織生長因子

神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞增生及膠質(zhì)瘢痕形成是中樞神經(jīng)系統(tǒng)(CNS)許多疾病損傷后病理修復(fù)的共同轉(zhuǎn)歸，其機(jī)制不明[1]。反應(yīng)性膠質(zhì)化是CNS損傷后組織開始修復(fù)的普遍病理現(xiàn)象，是Ast對損傷的應(yīng)激反應(yīng)[2]。轉(zhuǎn)化生長因子-β1(TGF-β1)是腦損傷后反應(yīng)性膠質(zhì)細(xì)胞增生的重要因子，在周圍組織纖維化疾病中起著關(guān)鍵作用[3]，但其信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路機(jī)制不明，在Ast中TGF-β1對結(jié)締組織生長因子(CTGF)表達(dá)的誘導(dǎo)作用研究甚少。本研究采用RT-PCR和Wb方法觀察了TGF-β1對新生SD大鼠Ast中CTGF mRNA和蛋白表達(dá)的影響，現(xiàn)報告如下。

1材料與方法

1.1　材料

新生SD大鼠由新鄉(xiāng)醫(yī)學(xué)院實驗動物中心提供; RecombinantHumanTGF-β1、One-StepRT-PCR kit購自北京全式金生物技術(shù)有限責(zé)任公司; Rabbit anti-rat CTGF(兔抗大鼠CTGF)、HRP標(biāo)記羊抗兔IgG均由美國santacruz公司生產(chǎn)，購自鄭州寶科生物科技有限公司；其他化學(xué)試劑均為市售分析純。

1.2　方法

1.2.1細(xì)胞培養(yǎng)：以McCarthy經(jīng)典培養(yǎng)方法為基礎(chǔ)，并加以適當(dāng)改進(jìn)。將新生1～3 d內(nèi)的SD大鼠脫頸處死后浸泡于酒精中，無菌條件下取出大腦，仔細(xì)剔除腦膜及血管組織，去除海馬，將大腦移入小玻璃瓶中，充分剪碎為1 mm3, 吸入離心管內(nèi), 1 500 r/min離心5 min, 棄上清液取沉淀，加入含20%胎牛血清制成DMEM懸液，吹打均勻。細(xì)胞計數(shù)后以1×105/mL的密度接種于一次性無菌培養(yǎng)瓶中，將培養(yǎng)瓶置于37 ℃、CO2體積分?jǐn)?shù)為5%、濕度為95%的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。40 min后換培養(yǎng)瓶以去除成纖維細(xì)胞, 3 d后換液。培養(yǎng)9～14 d, 細(xì)胞融合后傳代。傳代4～8代后給予含不同濃度的TGF-β1(0、1、2、4 ng/mL)孵育。

1.2.2RT-PCR: 用RT-PCR法檢測細(xì)胞中CTGF mRNA的表達(dá)。所有引物均由Primer Premier 5.0軟件設(shè)計，上海生物工程公司合成。CTGF引物：上游: 5′-CCCGTTAGCCTCGCCTTGGT-3′, 下游: 5′-GGCAGTTGGCTCGCATCATAG-3′; GAPDH引物：上游: 5′-GTTCAACGGCACAGTCAA-3′，下游: 5′-GGCTAAGCAGTTGGTGGT-3′。以Trizol提取細(xì)胞總RNA，逆轉(zhuǎn)錄后，進(jìn)行PCR擴(kuò)增。PCR反應(yīng)條件為: 94 ℃ 5 min→94 ℃ 30 s→55 ℃ 30 min→循環(huán)35→72 ℃ 10 min。瓊脂糖電泳檢測Smad2的擴(kuò)增片段為110 bp, CTGF的擴(kuò)增片段為571 bp, GAPDH的擴(kuò)增片段310 bp。PCR擴(kuò)增產(chǎn)物置于10 g/L瓊脂糖凝膠電泳后，用ChemilnagerTM550型凝膠成像分析儀進(jìn)行分析，用GeneTools軟件進(jìn)行電泳圖像分析。以CTGF和GAPDH電泳條帶OD值的比值來表示CTGF mRNA的相對表達(dá)量。

1.2.3Wb: 用Wb法檢測細(xì)胞中CTGF蛋白的表達(dá)。用單去污劑裂解緩沖液溶解Ast, 緩沖液包括100 mg/L苯甲基磺酰氟(PMSF)、1 mg/L Aprotinin、10 g/L TritonX-100。溶解產(chǎn)物4 ℃、10 000 r/min離心10 min。蛋白定量用Bradford法測定。相同量的上清液以100 g/L SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳，分離的蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)到PVDF膜，用含1 g/L Tween20和50 g/L小牛血清白蛋白(BSA)的TTBS(100 mmol/L pH 7.5 Tris-HCl和137 mmol/L NaCl)室溫封閉2 h, 兔抗大鼠CTGF抗體(1∶400)4 ℃孵育過夜，辣根過氧化物酶結(jié)合的二抗(1∶4000)室溫孵育2 h。ECL檢測目的蛋白，暗室進(jìn)行X光膠片曝光、顯影、和定影。用圖像分析儀(WEALTEC)掃描, Quantity One軟件檢測分析。計算各蛋白樣品的蛋白質(zhì)與GAPDH顯色積分光密度比值ODFN/ODGAPDH。

2結(jié)果

2.1　TGF-β1對Ast中CTGF mRNA表達(dá)的影響

RT-PCR結(jié)果顯示，與TGF-β1共同孵育后，體外培養(yǎng)的Ast細(xì)胞CTGF mRNA的表達(dá)水平顯著升高，且隨著TGF-β1濃度的增加, CTGF mRNA的表達(dá)量呈上升趨勢，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01), 見圖1、表1。

2.2　TGF-β1對Ast表達(dá)TGF蛋白的影響

與TGF-β1共同孵育后，體外培養(yǎng)的Ast細(xì)胞CTGF蛋白的表達(dá)水平顯著升高，且隨著TGF-β1濃度的增加，CTGF蛋白的表達(dá)量呈升高的趨勢，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01), 見圖2、表2。

注: M. Marker; 1. 0 ng/mL; 2. 1 ng/mL;

3. 2 ng/mL; 4. 4 ng/mL

TGF-β1/(ng/mL)n表達(dá)量FP030.504±0.019131.214±0.042**92.8680.000231.558±0.166**##431.961±0.140**##△△

與加入0 ng/mL TGF-β1相比，**P<0.01;

與加入1 ng/mL TGF-β1相比, ##P<0.01;

與加入2 ng/mL TGF-β1相比, △△P<0.01。

圖2不同濃度TGF-β1對Ast CTGF蛋白表達(dá)的影響

注: 1. 0 ng/mL; 2. 1 ng/mL;

3. 2 ng/mL; 4. 4 ng/mL

TGF-β1/(ng/mL)n表達(dá)量FP030.243±0.007131.093±0.113**119.1360.000231.598±0.063**##432.004±0.203**##△△

與加入0 ng/mL TGF-β1相比，**P<0.01;

與加入1 ng/mL TGF-β1相比，##P<0.01;

與加入2 ng/mL TGF-β1相比, △△P<0.01。

3討論

TGF-β1是目前已知公認(rèn)與外周纖維化關(guān)系最密切、最具代表性的生長因子[4], TGF-β1在CNS損傷后的過度表達(dá)引起人們的關(guān)注，但其作用機(jī)制尚未完全明確。反應(yīng)性膠質(zhì)化與皮膚膠質(zhì)瘢痕形成及其他周圍組織纖維化同屬機(jī)體組織損傷后修復(fù)過程，且神經(jīng)組織與皮膚同源于外胚層[5]，其損傷后修復(fù)的病理生理學(xué)分子機(jī)制可能存在共性?？紤]TGF-β1在CNS損傷后膠質(zhì)化修復(fù)中起作用。

CTGF能夠刺激成纖維細(xì)胞增殖、細(xì)胞外基質(zhì)產(chǎn)生、肉芽組織形成和纖維化[6]。在人成纖維細(xì)胞中，重組CTGF誘導(dǎo)纖維連接蛋白mRNA的表達(dá)和蛋白質(zhì)的合成，并呈劑量依賴性關(guān)系。CTGF中和性抗體可以顯著降低但不能完全抑制這種作用。CTGF在增加ECM、促進(jìn)血管形成等方面起到關(guān)鍵性的作用[7]。這些都與纖維化密切相關(guān)，說明CTGF是纖維化形成過程中的重要介質(zhì)。CTGF能被數(shù)種因子轉(zhuǎn)錄激活，TGF-β1是其中最重要激活因子，主要通過Smad2/3途徑、蛋白激酶C(PKC)和Ras/MEK/ERK信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑，在基因水平上參與CTGF的轉(zhuǎn)錄和表達(dá)[8-9]?？笴TGF的抗體和反義CTGF可分別從蛋白水平和核酸水平特異性的阻斷TGF-β對成纖維細(xì)胞的誘導(dǎo)作用[10]。本實驗發(fā)現(xiàn)TGF-β1能夠刺激Ast中CTGF的表達(dá)與合成，而且TGF-β1以劑量依賴性的方式提高CTGF mRNA和蛋白含量。因此，在CNS損傷后神經(jīng)膠質(zhì)疤痕形成機(jī)制中，TGF-β1是關(guān)鍵因子之一，CTGF是介導(dǎo)TGF-β1促纖維化作用的一個重要下游因子。

最近有研究報道[11]，抗TGF-β治療可以阻止纖維化的發(fā)生和發(fā)展，但由于TGF-β作用的靶細(xì)胞種類多，效應(yīng)復(fù)雜，完全阻斷其表達(dá)或活性的后果是難以預(yù)料的。CTGF表現(xiàn)出與TGF-β不同的生物學(xué)活性，作用比較單一，主要介導(dǎo)TGF-β的促纖維化作用，并且它只在間質(zhì)細(xì)胞中表達(dá)，其作用也只局限于結(jié)締組織[12]。因此，靶向CTGF治療神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞增生及膠質(zhì)瘢痕形成不影響TGF-β其他功能，是一個較阻斷TGF-β更有效和特異的靶點。

RNA干擾是最近發(fā)現(xiàn)和發(fā)展起來的新興的基因阻斷技術(shù)，它能高效、特異地阻抑細(xì)胞內(nèi)源或外源性靶基因的表達(dá)[13-14]。研究[15]證實多種siRNA能誘導(dǎo)基因沉默，這提供了一種經(jīng)濟(jì)、快捷和高效的基因表達(dá)抑制技術(shù)手段，進(jìn)一步研究擬采用RNA干擾技術(shù)調(diào)控神經(jīng)膠質(zhì)化，減少并發(fā)癥及后遺癥的發(fā)生，減輕其危害。

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Influence of transforming growth factor-β1on

expression of connective tissue growth factor

in astrocytes in neonatal rat

LI Hehua, LI Tong, SONG Zhixiu

(DepartmentofNeurology,TheFirstAffiliatedHospitalofXinxiangMedicalUniversity,

Weihui,Henan, 453100)

ABSTRACT:ObjectiveTo observe the infhuence of transforming growth factor (TGF-β1) on connective tissue growth factor (CTGF) in astrocytes (Ast cells) of neonatal rat. MethodsAst cells were separated from neonatal SD cerebral cortex of rat and identified by FITC immunofluorescence. Ast cells were incubated in TGF-β1 for 24 hours. Concentrations of TGF-β1used in the test were 0, 1, 2 and 4 ng/mL. After that reverse transcription-polymerase chain reaction and western blot were performed to defct the mRNA and protein expressions of CTGF. ResultsTGF-β1increased the mRNA and protein expressions of CTGF and the expressions up regulated along with the elevated concentrations of TGF-β1showed a significant difference (P<0.05). ConclusionTGF-β1increased the expression of CTGF in Ast cells in a concentration-dependent manner, indicating that TGF-β1can increase the expression of CTGF in Ast cells within a certain range that induces reactive astrogliosis in neonatal SD rats.

KEYWORDS:astrocytes; reactive astrogliosis; transforming growth factor -β1; connective tissue growth factor

通信作者:李彤, E-mail: litong0833@163.com

基金項目:河南省科技廳資助項目(082102310015, 112101310400)

收稿日期:2014-12-22

中圖分類號:R 338.2

文獻(xiàn)標(biāo)志碼:A

文章編號:1672-2353(2015)09-005-04

DOI:10.7619/jcmp.201509002