三種異喹啉型生物堿的微生物轉(zhuǎn)化篩選

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基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究

三種異喹啉型生物堿的微生物轉(zhuǎn)化篩選

付少彬1，龍書安1，張蕓1，李義1，張茂生1，孟慶峰2

(1.遵義醫(yī)學(xué)院 藥學(xué)院，貴州 遵義563099；2. 遵義醫(yī)學(xué)院 公共衛(wèi)生學(xué)院，貴州 遵義563099)

[摘要]目的 異喹啉型生物堿是生物堿的重要組成部分，藥用價(jià)值高，本文擬篩選對3種四氫異喹啉型生物堿Z1(巴馬亭)、Z2(番荔枝寧)、Z3(瑞枯靈)具有催化活性的微生物菌株,為后期通過微生物催化方法進(jìn)行3種生物堿的結(jié)構(gòu)修飾提供依據(jù)。方法 以微生物菌株為酶催化劑，將作為底物的3種異喹啉型生物堿與18種微生物菌株共培養(yǎng)，3~5 d后乙酸乙酯萃取發(fā)酵液，通過薄層色譜法(TLC)對轉(zhuǎn)化反應(yīng)進(jìn)行篩選；Z1和Z2兩種底物轉(zhuǎn)化能力均較強(qiáng)的菌株03-L-93-Ⅱ通過ITS區(qū)序列進(jìn)行種屬鑒定。結(jié)果 經(jīng)篩選的8株真菌、10株細(xì)菌中，03-L-93-Ⅱ、T002、T009、T016、T017具有轉(zhuǎn)化Z1(巴馬亭)的能力，T002、T009、T017、03-L-93-Ⅱ具有轉(zhuǎn)化Z2(番荔枝寧)的能力，菌株L125-4對Z3(瑞枯靈)表現(xiàn)出微弱的轉(zhuǎn)化活性。對菌株03-L-93-Ⅱ經(jīng)分子生物學(xué)方法鑒定為Xylariales. Sp。結(jié)論 微生物菌株作為催化劑對四氫異喹啉型生物堿進(jìn)行結(jié)構(gòu)改造是可行的。

[關(guān)鍵詞]生物轉(zhuǎn)化；異喹啉型生物堿；菌株篩選；薄層色譜法(TLC)

生物堿是一類十分重要的天然產(chǎn)物，也是一類研究最早的有生物活性的天然化合物。生物堿類化合物大多具有很好的生理活性，常常作為許多中草藥及藥用植物的有效成分。四氫異喹啉類生物堿是生物堿類成分的重要骨架類型，具有廣泛的生物活性，包括抗菌、抗腫瘤、鎮(zhèn)痛、抗心律失常、抗血小板聚集、降壓、調(diào)節(jié)免疫等功能[1]，某些四氫異喹啉類生物堿如鹽酸小檗堿、延胡索乙素等已經(jīng)在臨床上得到廣泛應(yīng)用。隨著人們對四氫異喹啉類生物堿研究的不斷深入，此類生物堿生物活性和結(jié)構(gòu)改造也受到人們廣泛關(guān)注[2]。

巴馬亭(palmatine)，具有廣譜抗菌作用，臨床上可用于治療婦科炎癥、菌痢、腸炎、呼吸道和泌尿道感染、外科感染及結(jié)膜炎等[3]，此外還對蛙心有輕度興奮作用、降壓作用的報(bào)道[4-6]。番荔枝寧(xylopinine)，文獻(xiàn)報(bào)道具有鎮(zhèn)靜、降壓作用以及很強(qiáng)的抗瘧活性[7-8]，并且還是合成其他異喹啉類生物堿的重要前體化合物。瑞枯靈(reticuline)，研究發(fā)現(xiàn)其具有較強(qiáng)的抗血小板聚集作用，可以抑制子宮平滑肌的收縮，具有中樞神經(jīng)系統(tǒng)抑制等作用[9-11]。

四氫異喹啉類生物堿因其獨(dú)特的化學(xué)結(jié)構(gòu)和良好的生物、藥理活性，長期以來備受化學(xué)家和生物學(xué)家的廣泛關(guān)注。采用經(jīng)典的化學(xué)合成方法進(jìn)行結(jié)構(gòu)改造已有報(bào)道[12-13]，但作為近年備受青睞的綠色化學(xué)方法-生物轉(zhuǎn)化法卻報(bào)道較少。本文通過細(xì)菌、真菌來篩選具有對3種異喹啉型生物堿巴馬亭、番荔枝寧、瑞枯靈有轉(zhuǎn)化活性的微生物菌株，為后續(xù)的結(jié)構(gòu)改造以及為新藥研發(fā)提供更具價(jià)值的先導(dǎo)化合物奠定基礎(chǔ)。

1材料與方法

1.1材料底物Z1(巴馬亭)、Z2(番荔枝寧)、Z3(瑞枯靈)均由本校藥物化學(xué)教研室提供。供試微生物菌株共18種(包括常溫菌和低溫菌)，其中真菌L125-2、M2967-9、L77-1、01-S-10、02-L-37、03-L-93-Ⅱ是由本研究人員從植物和地衣中分離的內(nèi)生真菌，真菌CGMCC 3.2500、CGMCC 3.3657購自中國普通微生物菌種保藏管理中心；土壤微生物T002、T003、T007、T008、T009、T0012、T013、T016、T017、T022由遵義醫(yī)學(xué)院校園土壤分離得到。

1.2方法

1.2.1培養(yǎng)基的制作真菌培養(yǎng)基：土豆200 g/L、葡萄糖20 g/L，將土豆削皮切成小丁，加水煮沸20~30 min，用8層紗布過濾，蒸餾水定容至1 L，濾液加葡萄糖，100 mL錐形瓶內(nèi)裝40 mL PDA液體培養(yǎng)基，固體培養(yǎng)基在上述成分里加20 g瓊脂，121 ℃高壓滅菌25 min即得。

細(xì)菌培養(yǎng)基的制作：蛋白胨10 g/L、酵母提取物5 g/L、氯化鈉10 g/L、蒸餾水1 L，分裝于試管，每支5 mL液體LB培養(yǎng)基，固體培養(yǎng)基在上述成分里加20 g瓊脂，121 ℃高壓滅菌25 min即得。

1.2.2真菌對Z1、Z2、Z3轉(zhuǎn)化反應(yīng)的篩選將活化的8株真菌菌株L125-2、M2967-9、L77-1、01-S-10、02-L-37、03-L-93-Ⅱ、CGMCC 3.2500、CGMCC 3.3657于超凈工作臺(tái)中分別接入已滅菌的液體培養(yǎng)基中，每株菌接3瓶，共24瓶，放入恒溫振蕩器中震蕩培養(yǎng)，其中菌株01-S-10、02-L-37、03-L-93-Ⅱ、3.2500、3.3657培養(yǎng)的最佳溫度是28 ℃，菌株L125-2、M2967-9、L77-1最佳溫度是16 ℃，轉(zhuǎn)速160 rpm，3~4 d后每株菌的3個(gè)培養(yǎng)瓶中分別加底物Z1、Z2、Z3(用適量無水乙醇溶解，每瓶約5 mg底物)，放入恒溫震蕩培養(yǎng)箱與菌株共培養(yǎng)，5 d后用等體積乙酸乙酯萃取發(fā)酵液，60 ℃減壓濃縮至小體積，分別以Z1、Z2、Z3為對照，通過TLC方法，以二氯甲烷∶甲醇=11∶1為展開系統(tǒng)，改良碘化鉍鉀顯色檢測轉(zhuǎn)化反應(yīng)。

1.2.3細(xì)菌對Z1、Z2、Z3轉(zhuǎn)化反應(yīng)的篩選取編號(hào)為T002、T003、T007、T008、T009、T0012、T013、T016、T017、T022土壤微生物分別于超凈工作臺(tái)中接于LB液體培養(yǎng)基，每株菌分別接3支試管，放入恒溫震蕩培養(yǎng)箱37 ℃震蕩，轉(zhuǎn)速160 rpm，12 h后加入底物Z1、Z2、Z3(用適量無水乙醇溶解，每支試管約0.5 mg底物)，底物與菌株共培養(yǎng)3 d后等體積用乙酸乙酯萃取，60 ℃減壓濃縮至小體積，轉(zhuǎn)化反應(yīng)的檢測方法同1.2.2。

1.2.4活性菌株轉(zhuǎn)化反應(yīng)的03-L-93-Ⅱ?qū)煞N底物Z1和Z2均表現(xiàn)出較好的轉(zhuǎn)化活性的真菌菌株03-L-93-Ⅱ通過分子生物學(xué)手段對其ITS區(qū) rDNA序列(ITS1+5.8S+ITS2)進(jìn)行測序，并與GenBank數(shù)據(jù)庫中序列進(jìn)行Blast比對分析，鑒定到種屬類群。

2結(jié)果

2.1真菌檢測結(jié)果圖1是真菌01-S-10、02-L-37、03-L-93-Ⅱ、CGMCC 3.2500對Z1、Z2、Z3的轉(zhuǎn)化反應(yīng)篩選結(jié)果，由圖可見03-L-93-Ⅱ底物的顯色斑點(diǎn)很小，而產(chǎn)物的顯色斑點(diǎn)很大，提示其對Z1和Z2的轉(zhuǎn)化效果較好。4株菌株對Z3的轉(zhuǎn)化效果均不好，未發(fā)現(xiàn)明顯的轉(zhuǎn)化產(chǎn)物。圖2A是TLC方法檢測真菌對Z1的轉(zhuǎn)化反應(yīng)，菌株分別為L125-4、3.3657、L77-1、M2967-9，所有菌株均對Z1有轉(zhuǎn)化反應(yīng)，因?yàn)楫a(chǎn)物的顯色斑點(diǎn)較小，而底物的顯色斑點(diǎn)較大，提示其轉(zhuǎn)化率不高。圖2B表示TLC方法檢測真菌對Z2的轉(zhuǎn)化反應(yīng)，菌株分別為L77-1、L125-4、3.3657、M2967-9，可能由于底物Z2在空氣中長久放置或者底物污染，導(dǎo)致底物不純，但不難看出L77-1、3.3657、M2967-9對底物有很弱的轉(zhuǎn)化活性。圖2C表示TLC方法檢測真菌對Z3的轉(zhuǎn)化反應(yīng)，菌株分別為L77-1、L125-4、3.3657、M2967-9，結(jié)果顯示所有菌株中L125-4對Z3有輕微的轉(zhuǎn)化反應(yīng)。

2.2細(xì)菌檢測結(jié)果由圖3A可見，細(xì)菌T002、T003、T007、T008、T009、T0012、T013、T016、T017、T022均對Z1有轉(zhuǎn)化反應(yīng)，其中T002、T009、T016、T017四株菌的轉(zhuǎn)化效果較好，產(chǎn)物的顯色斑點(diǎn)比底物的顯色斑點(diǎn)較大。結(jié)果顯示所有菌株均對Z2有轉(zhuǎn)化反應(yīng)，其中T002、T009、T016、T017四株菌的轉(zhuǎn)化效果較好，產(chǎn)物顯色斑點(diǎn)比底物顯色斑點(diǎn)大(見圖3B)。結(jié)果顯示細(xì)菌中的所有菌株對Z3沒有轉(zhuǎn)化反應(yīng)(見圖3C)。

Z1、Z2、Z3分別代表3種底物，01、02、03、3.2分別代表真菌01-S-10、02-L-37、03-L-93-Ⅱ和CGMCC 3.2500。　　圖1　真菌01-S-10、02-L-37、03-L-93-Ⅱ、CGMCC 3.2500對Z1、Z2、Z3的轉(zhuǎn)化反應(yīng)篩選結(jié)果

Z1、Z2、Z3分別代表3種底物，L77、L12、3.3、M2分別代表真菌L77-1、L25-4、3.3657、M2967-9?！　D2　真菌L77-1、L125-4、3.3657、M2967-9對Z1(A)、Z2(B)、Z3(C)的轉(zhuǎn)化反應(yīng)

Z1、Z2、Z3分別代表3種底物，02、03、07、08、09、12、13、16、17、22分別代表細(xì)菌T002、T003、T007、T008、T009、T012、T013、T016、T017、T022。圖3　TLC方法檢測細(xì)菌對Z1(A)、Z2(B)、Z3(C)的轉(zhuǎn)化反應(yīng)

2.3活性菌株03-L-93-Ⅱ的鑒定對Z1和Z2兩種底物均表現(xiàn)出較強(qiáng)的轉(zhuǎn)化活性的真菌菌株03-L-93-Ⅱ經(jīng)ITS區(qū)序列的測序分析，全長531 bp(見圖4)，并與NCBI的Blast在線比對，與Xylariales.sp 相似度為99%，所以03-L-93-Ⅱ初步鑒定為Xylariales.sp。

圖4　菌株03-L-93-Ⅱ的ITS區(qū)的基因序列

3討論

四氫異喹啉型生物堿是存在于自然界中的重要生物堿，大多數(shù)表現(xiàn)出顯著的生物活性，廣泛存在于草藥及藥用植物中，往往是中草藥的有效成分之一，故對此類結(jié)構(gòu)生物堿為母核進(jìn)行結(jié)構(gòu)改造顯得尤為重要。經(jīng)典的化學(xué)合成方法可以實(shí)現(xiàn)四氫異喹啉型生物堿的結(jié)構(gòu)改造，但是步驟相對繁瑣，反應(yīng)條件要求也比較高，而微生物轉(zhuǎn)化反應(yīng)條件溫和、環(huán)境友好、選擇性強(qiáng)[14-16]，也被譽(yù)為“綠色化學(xué)”，近年來成為化學(xué)合成領(lǐng)域的一大研究熱點(diǎn)領(lǐng)域。而對于具有顯著生物活性的四氫異喹啉型生物堿Z1(巴馬亭)、Z2(番荔枝寧)、Z3(瑞枯靈)的微生物改造卻少見報(bào)道，所以本文嘗試微生物作為催化劑篩選對Z1(巴馬亭)、Z2(番荔枝寧)、Z3(瑞枯靈)具有轉(zhuǎn)化活性的菌株，為后期的結(jié)構(gòu)修飾奠定基礎(chǔ)。自然界存在大量的微生物，主要是細(xì)菌、真菌、放線菌3大類，本實(shí)驗(yàn)選用了土壤微生物(形態(tài)上多數(shù)為細(xì)菌)和真菌作為篩選的催化劑，真菌中包括常溫真菌和極地低溫真菌。從篩選結(jié)果看，能夠催化Z1和Z2菌株數(shù)目較多，而菌株03-L-93-Ⅱ?qū)1和Z2的轉(zhuǎn)化效果較好。篩選的菌株中只有L125-4對Z3表現(xiàn)微弱的轉(zhuǎn)化活性。下一步我們將對催化活性較強(qiáng)的菌株進(jìn)行適當(dāng)放大，并對其轉(zhuǎn)化產(chǎn)物進(jìn)行結(jié)構(gòu)鑒定，為增加四氫異喹啉型生物堿的結(jié)構(gòu)多樣性及新藥研發(fā)奠定基礎(chǔ)。

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[收稿2015-10-11;修回2015-11-04]

(編輯：王靜)

Strain screening on microbial transformation of three isoquinoline alkaloids

FuShaobin1,LongShu’an1,ZhangYun1,LiYi1,ZhangMaosheng1,MengQingfeng2

(1.School of Pharmacy, Zunyi Medical University, Zunyi Guizhou 563099, China; 2. School of Public Health, Zunyi Medical University, Zunyi Guizhou 563099, China)

[Abstract]Objective Isoquinoline alkaloids with high value in medicine were important structural type of alkaloids. The paper is to screen microbial strains which can catalyze isoquinoline alkaloids of palmatine (Z1), xylopinine (Z2), and reticuline (Z3).Methods Isoquinoline alkaloids as the substrates were co-cultured with microbial strains which were catalysts for five to seven days, then the conversion reactions were identified by thin layer chromatography; strain 03-L-93-Ⅱwith high catalytic activity to Z1 and Z2 was identified by sequence of ITS region.Results In 8 strains of fungi and 10 strains of bacteria, strain 03-L-93- II, T002, T009, T016, T017 showed transformation activity of substrate Z1, strain T002, T009, T017, 03-L-93-Ⅱ can transform Z2 to other compounds, while L125-4 showed weak catalytic ability of Z3. Strain 03-L-93-Ⅱwas confirmed asXylariales. Sp by molecular method.Conclusion The microbial strains as catalysts to modify the structure of tetrahydroisoquinoline alkaloids were feasible and identified.

[Key words]biotransformation; isoquinoline alkaloids; strains screening; thin layer chromatography

[中圖法分類號(hào)]R932

[文獻(xiàn)標(biāo)志碼]A

[文章編號(hào)]1000-2715(2015)06-0591-04

[通信作者]付少彬，女，博士，副教授，研究方向：天然產(chǎn)物的生物催化研究，E-mail:fushb@126.com。

[基金項(xiàng)目]國家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(NO：21462057)；大學(xué)生創(chuàng)新創(chuàng)業(yè)項(xiàng)目(NO：201410661013，[2014]5838)；遵義醫(yī)學(xué)院博士啟動(dòng)基金資助項(xiàng)目(NO：F-634)。