復合型季銨鹽類抗菌劑的抑菌效果

王 冰，金 朝 霞，張 宗 申

（大連工業(yè)大學 生物工程學院，遼寧 大連 116034）

0 引 言

細菌、病毒等致病性微生物是威脅人類健康的殺手。各種塑料制品，尤其是醫(yī)用制品的表面污染和細菌滋生會對人類生命健康造成極大的威脅［1］。世界各國對抗菌研究的投入逐年增加，高效環(huán)保的抗菌劑是研究的關鍵［2］。

抗菌劑是指在一定時間內(nèi)能使某些微生物（細菌、真菌、酵母菌、藻類及病毒等）的生長或繁殖保持在必要水平以下的一類物質(zhì)［3］。目前，對于有機小分子抗菌劑的抗菌活性已經(jīng)有了較多的研究。人們發(fā)現(xiàn)帶有長鏈烷基的季銨鹽基團具有很強的抗菌性能［4］。但是有機小分子抗菌劑存在易揮發(fā)、不易加工、化學穩(wěn)定性差等缺點。帶有抗菌基團的有機高分子化合物恰巧可以克服上述缺點，同時高分子季銨鹽抗菌劑不會滲透進人的皮膚，還具有比小分子抗菌劑更好的抗菌性能［5－6］。

殼聚糖季銨鹽（HACC）不但具有季銨鹽的典型性質(zhì)，如抗菌、抑菌性以及吸濕、保濕性，還保持了殼聚糖原有的良好的成膜性、絮凝性以及生物相容性和可降解性，同時具有良好的水溶性，從而使其在食品工業(yè)、醫(yī)藥、工業(yè)水處理、紡織品加工等領域廣泛應用［7－8］。有機硅季銨鹽（OSQAS）是一類陽離子表面活性劑，具有耐高溫、耐水洗、持久的效果，抑菌范圍廣，能有效抑制革蘭陽性菌、革蘭陰性菌、酵母菌和真菌［9］。作者希望通過將兩種類型的抗菌劑復合使用，充分發(fā)揮各自的優(yōu)勢和特點，制成更安全、易加工、穩(wěn)定性好、廣譜高效、低毒性、可回收、廉價的抗菌劑。

1 材料與方法

1.1 材 料

牛肉膏、瓊脂粉、蛋白胨、氯化鈉；有機硅季銨鹽，廣州市諾康化工有限公司；甲殼素季銨鹽，南通綠神生物工程有限公司。

大腸桿菌、藤黃八疊球菌和金黃色葡萄球菌，大連工業(yè)大學生物工程學院菌種保藏室提供。

1.2 方 法

1.2.1 菌種活化及培養(yǎng)

分別將革蘭陰性菌（大腸桿菌）和革蘭陽性菌（金黃色葡萄球菌、藤黃八疊球菌）活化。將各菌種經(jīng)增殖培養(yǎng)，分離純化，取單菌落接種于斜面培養(yǎng)基保存。

菌懸液的制備：將大腸桿菌菌種在無菌條件下接種于營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基上，然后在恒溫箱內(nèi)37 ℃培養(yǎng)12h，將菌種轉(zhuǎn)接于液體培養(yǎng)基中，搖勻，置于37℃搖床180r／min培養(yǎng)12h，用滅菌的生理鹽水稀釋成106～107cfu／mL菌懸液備用。

1.2.2 抗菌譜的確定

將OSQAS 與HACC 分別配制成不同濃度梯度的溶液，分別作用于大腸桿菌、金黃色葡萄桿菌、藤黃八疊球菌的菌懸液，置于37 ℃的恒溫振蕩培養(yǎng)箱180r／min培養(yǎng)12h。移取30μL培養(yǎng)液到營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基上培養(yǎng)，倒置于37 ℃恒溫箱培養(yǎng)24h。每個樣品重復3次，通過活菌菌落計數(shù)法觀察菌落生長情況，以不同濃度梯度抗菌劑作用后多數(shù)培養(yǎng)基上無菌落生長的菌種為抗菌譜。

實驗主要研究OSQAS 和HACC 對大腸桿菌和金黃色葡萄球菌的抗菌活性。

1.2.3 最低抑菌濃度（MIC）的測定

將1mL 已稀釋到106～107cfu／mL 的菌懸液加入到1mL下列不同濃度的OSQAS培養(yǎng)基溶液中：0.005 4、0.010 8、0.021 6、0.032 4、0.043 2、0.054 0mg／mL，置于180r／min的恒溫搖床上，在37 ℃培養(yǎng)12h，以相同樣品濃度且未加菌液的培養(yǎng)液作參比，并以未加抗菌劑的菌懸液作對照。在600nm 測定其分光度A600。以分光光度法確定其最低抑菌濃度［10］。確定培養(yǎng)基上不生長菌體的濃度為最低抑菌濃度。

同理配制不同濃度梯度的HACC：0.035、0.070、0.100、0.200、0.300、0.400 mg／mL。將不同濃度的HACC溶液作用于菌懸液，取30μL混合液加入平板培養(yǎng)基上，涂勻，倒置于37 ℃恒溫箱培養(yǎng)24h，觀察菌落生長情況，以培養(yǎng)不加抗菌劑的菌懸液的菌落數(shù)做空白對照實驗。通過活菌菌落計數(shù)法確定培養(yǎng)基上不生長菌體的濃度為最低抑菌濃度。分別確定HACC 作用于大腸桿菌和金黃色葡萄球菌的最低抑菌濃度。

以實驗確定的HACC和OSQAS對大腸桿菌的最低抑菌濃度的不同配比配制復配抗菌劑。HACC與OSQAS的濃度配比分別為：0.5MICHACC／0.5MICOSQAS、 0.67MICHACC／ 0.67MICOSQAS、0.5MICHACC／MICOSQAS、MICHACC／0.5MICOSQAS、MICHACC／MICOSQAS；通過活菌菌落計數(shù)法確定復配抗菌劑對大腸桿菌的抑菌效果。

同理，以兩種抗菌劑分別作用于金黃色葡萄球菌的最低抑菌濃度來復配抗菌劑并確定復配抗菌劑對金黃色葡萄球菌的抑菌作用。HACC 與OSQAS 的濃度配比分別為：0.5 MIC′HACC／0.5MIC′OSQAS、 0.67MIC′HACC／ 0.67MIC′OSQAS、0.5MIC′HACC／MIC′OSQAS、MIC′HACC／0.5MIC′OSQAS、MIC′HACC／MIC′OSQAS。

1.2.4 混合抗菌劑的熱穩(wěn)定性

復配后最低抑菌濃度的抗菌劑在不同溫度梯度的水浴鍋內(nèi)處理30 min，設定溫度為：20、30、40、50、60、70 ℃，然后作用于大腸桿菌菌懸液。用7202B型分光光度計測定其在600nm 的分光度，以相同樣品濃度且未加菌液的培養(yǎng)液作參比，并以室溫下未加抗菌劑的菌懸液作對照。用分光光度法確定混合抗菌劑的熱穩(wěn)定性。

1.2.5 作用時間

復配劑與大腸桿菌菌懸液的作用時間不同對抑菌效果的影響，設定時間為5、10、20、30、40、50、60min，在不同時間分別取30μL的混合液涂布于培養(yǎng)基，采用活菌菌落計數(shù)法，觀察菌落的生長情況，確定作用時間對抑菌活性的影響。

2 結(jié)果與討論

2.1 OSQAS與HACC的抗菌譜

由圖1可知，OSQAS的抗菌譜為大腸桿菌、藤黃八疊球菌、金黃色葡萄球菌；HACC 的抗菌譜為大腸桿菌、藤黃八疊球菌、金黃色葡萄球菌；其中OSQAS對藤黃八疊球菌的抑菌效果最為顯著。這表明OSQAS與HACC這兩種抗菌劑對革蘭陽性菌和革蘭陰性菌都具有較好的抑菌效果，對一些普遍存在的致病菌具有一定的抑制作用。

圖1 抗菌譜的確定Fig.1 Determination of antibacterial spectrum

2.2 最低抑菌濃度的測定

2.2.1 抗菌劑的最低抑菌濃度

在一定范圍內(nèi)，隨著OSQAS濃度的增大，對大腸桿菌的抑菌活性逐漸增強（表1）；當OSQAS達到0.032 4mg／mL時，對大腸桿菌的抑菌效果最佳。同時，通過活菌菌落計數(shù)法佐證了OSQAS對大腸桿菌具有良好的抑菌效果。

表1 OSQAS對大腸桿菌的最低抑菌濃度Tab.1 The MIC of OSQAS for E.coli

表2表明，OSQAS 對金黃色葡萄球菌的抑菌效果同樣具有濃度依賴性，當其質(zhì)量濃度增加到0.021 6mg／mL時，抑菌率達到96.15%；當濃度為0.032 4mg／mL時，抑菌率達到100%。

表2 OSQAS對金黃色葡萄球菌的最低抑菌濃度Tab.2 The MIC′of OSQAS for S.aureus

圖2表明，隨著HACC濃度的升高，對大腸桿菌與金黃色葡萄球菌的抑菌率逐漸增大。HACC對大腸桿菌的最低抑菌濃度為0.07 mg／mL；當HACC為0.1 mg／mL 時，對金黃色葡萄球菌的抑菌率達到97.94%。這表明HACC 對革蘭陽性菌和革蘭陰性菌均具有良好的抑菌性。

圖2 HACC的最低抑菌濃度Fig.2 The MIC of HACC for E.coli and S.aureus

2.2.2 復配后的混合抗菌劑的最低抑菌濃度

如表3所示，當HACC 與OSQAS的質(zhì)量濃度配比為0.5MICHACC／0.5MICOSQAS時，復配劑對大腸桿菌的抑菌率就可以達到98.68%。研究表明，由于OSQAS是一種表面活性劑，當含量過大時，反而使菌落成片生長，對抑菌不利。OSQAS與HACC復配后，抑菌效果大大超出兩種抗菌劑單獨作用時的抑菌效果，同時兩種抗菌劑復配后，作用于菌液時，所需濃度也比單獨作用的MIC低得多。該結(jié)果對于發(fā)展復配抗菌劑具有重要的指導意義。

表3 復配劑對大腸桿菌的最低抑菌濃度Tab.3 The MIC of combinations of both quaternary ammonium salts for E.coli

表4表明，OSQAS與HACC 復配后作用于金黃色葡萄球菌時，僅使用單獨作用金黃色葡萄球菌的最低抑菌濃度的一半時，抑菌率就達到了96.05%；而當HACC 與OSQAS的質(zhì)量濃度配比為0.67MIC′HACC／0.67MIC′OSQAS時，復配劑對大腸桿菌的抑菌得就達到99.44%。說明復配抗菌劑對金黃色葡萄球菌的抑菌效果非常顯著。

2.3 復配抗菌劑的作用時間與熱穩(wěn)定性

表5、6所示，影響復配抗菌劑對大腸桿菌菌懸液抑菌效果的主要因素是溫度和復配劑的熱穩(wěn)定性。該復配抗菌劑作用于大腸桿菌時，作用20min后，復配抗菌劑對大腸桿菌的抑菌率高達97.53%。這表明復配抗菌劑短時間作用于大腸桿菌菌懸液時，就可以獲得最佳的抗菌活性。同時，復配抗菌劑的抑菌活性隨溫度的升高而增強，溫度過低達不到最好的抑菌效果；當處理溫度為40 ℃時，抑菌效果達到最佳。表5結(jié)果還表明，隨著處理溫度繼續(xù)升高，抑菌率沒有改變，說明復合抗菌劑具有良好的熱穩(wěn)定性。

表4 復配劑對金黃色葡萄球菌的最低抑菌濃度Tab.4 The MIC of combinations of both quaternary ammonium salts for S.aureus

表5 復合抗菌劑的熱穩(wěn)定性Tab.5 The thermal stability of combinations of both quaternary ammonium salts for E.coli

表6 復合抗菌劑的作用時間Tab.6 Time of antibacterial of combinations of both quaternaryammonium salts for E.coli

3 結(jié) 論

有機硅季銨鹽與甲殼素季銨鹽的抗菌譜均為大腸桿菌、藤黃八疊球菌和金黃色葡萄球菌。OSQAS對大腸桿菌和金黃色葡萄球菌的MIC均為0.032 4 mg／mL。HACC 對 大 腸 桿 菌 的MIC為0.07mg／mL，此時的抑菌率為99.54%；而對金黃色葡萄球菌的MIC 為0.1mg／mL。兩種季銨鹽復配后作用于大腸桿菌，HACC 與OSQAS在濃度配比為0.5MICHACC／0.5MICOSQAS時抑菌率達到98.68%，僅為單獨使用時0.5d的MIC就達到了非常好的抑菌效果，優(yōu)于前人的報告結(jié)果［11］。

與單獨使用相比，有機硅季銨鹽與甲殼素季銨鹽復配后可以提高對致病菌的抗菌活性，并且具有殺菌時間短、見效快、抑菌率高等優(yōu)點，有助于擴寬新一代季銨鹽抗菌劑的應用范圍。

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