雙重PCR 快速檢測(cè)海水貝類(lèi)中副溶血性弧菌

強(qiáng) 世 龍，張 公 亮，孫 黎 明，侯 紅 漫

（大連工業(yè)大學(xué) 食品學(xué)院，遼寧 大連 116034）

0 引 言

副溶血性弧菌（Vibrioparahaemolyticus）是一種食源性致病菌，主要來(lái)源于蝦、魚(yú)和貝類(lèi)等海產(chǎn)品［1］。據(jù)報(bào)道，近年來(lái)，我國(guó)微生物性食物中毒的病原分布發(fā)生了顯著變化，特別是沿海地區(qū)，副溶血性弧菌引起的食物中毒已經(jīng)高居微生物性食物中毒首位［2］。副溶血性弧菌是亞于霍亂弧菌的常見(jiàn)腸道致病菌，在春夏季大連沿海地區(qū)以貝類(lèi)如紅螺（RapanabezonaLinnaeus）、方形馬珂蛤（Mactraveneriformis）、菲律賓蛤仔（Ruditapesphilippinarum）為主可以生吃的海鮮貝類(lèi)產(chǎn)品集中上市，而生吃海鮮極易引發(fā)食物中毒，會(huì)引起人類(lèi)腹瀉等腸道疾病及食物中毒，出現(xiàn)腹瀉、腹部痙攣、嘔吐、惡心、和頭痛等癥狀［3－5］。目前對(duì)食源性致病菌的檢測(cè)仍主要依靠傳統(tǒng)的生化鑒定、細(xì)菌培養(yǎng)、血清學(xué)等方法，檢測(cè)周期長(zhǎng)（4～7d），操作煩瑣復(fù)雜，已不能適應(yīng)衛(wèi)生應(yīng)急檢測(cè)的需要。因此對(duì)副溶血性弧菌快速檢測(cè)的研究，將有助于預(yù)防這種食源性疾病。

近年來(lái)，分子生物學(xué)技術(shù)的發(fā)展使得PCR 技術(shù)被引入該方面的檢測(cè)，如多重PCR 技術(shù)和熒光定量PCR技術(shù)等［6－9］，但以海水貝類(lèi)為對(duì)象檢測(cè)副溶血性弧菌的PCR 方法并不多見(jiàn)。本實(shí)驗(yàn)根據(jù)屬特異tl基因［10］和特異性毒力基因tdh［11］作為水產(chǎn)品中副溶血性弧菌檢測(cè)的靶基因，應(yīng)用雙重PCR 快速檢測(cè)海水貝類(lèi)中副溶血性弧菌。

1 實(shí) 驗(yàn)

1.1 材 料

1.1.1 菌 種

副溶血性弧菌（Vibrioparahaemolyticus）、沙門(mén)氏菌（Salmonellasp.）、金黃色葡萄球菌（Staphylococcusaureus）、大腸桿菌（Escherichia coil）、產(chǎn)氣桿菌（Aerobacteraerogenes），實(shí)驗(yàn)室保存。

1.1.2 試 劑

弧菌顯色培養(yǎng)基、副溶血性弧菌成套生化鑒定管，青島高科園海博生物有限公司；細(xì)菌基因組DNA 提取試劑盒、DNA Marker、溶菌酶、蛋白酶K、RNaseA 以及PCR 相關(guān)試劑，北京天根生化有限公司。

1.1.3 引物序列

以副溶血性弧菌tdh基因和弧菌屬的tl基因作為靶基因分別合成兩對(duì)特異性引物（表1），由北京六合華大基因科技股份有限公司合成。

1.1.4 樣品處理

2013年春夏兩季隨機(jī)挑選大連海鮮集市新鮮紅螺、方形馬珂蛤及菲律賓蛤仔。分為8個(gè)批次取樣，紅螺、菲律賓蛤仔、方形馬珂蛤共201份樣品，按采樣時(shí)間順序標(biāo)號(hào)，每份樣品包裝于無(wú)菌塑封袋中，4 ℃冰盒取樣2h內(nèi)送到實(shí)驗(yàn)室檢驗(yàn)。

在無(wú)菌條件下去殼，稱(chēng)取25g軟組織和體液，置于滅菌研缽中，用滅菌剪刀充分剪碎后研磨。

表1 目的基因及引物序列Tab.1 Target genes and corresponding primer sequences

1.1.5 儀 器

5418R 小型臺(tái)式冷凍離心機(jī)，德國(guó)艾本德股份公司；JM－250電泳儀，大連捷邁科貿(mào)有限公司；VersaDoc凝膠成像儀，美國(guó)伯樂(lè)；PCR 擴(kuò)增儀，美國(guó)伯樂(lè)。

1.2 方 法

1.2.1 細(xì)菌的活化培養(yǎng)

?。?0 ℃、25%甘油凍存的菌種，解凍后分別劃線(xiàn)于細(xì)菌培養(yǎng)基上，置于37 ℃恒溫培養(yǎng)箱24h，連續(xù)活化2次，將單菌落接種于普通肉湯培養(yǎng)基中，37℃恒溫培養(yǎng)，150r／min增菌培養(yǎng)18h。

1.2.2 細(xì)菌基因組DNA 的制備

取1mL菌液按照細(xì)菌基因組DNA 提取試劑盒說(shuō)明書(shū)步驟進(jìn)行DNA 提取，并溶于30μL雙蒸水中，于－20 ℃下保存。

1.2.3 雙重PCR 的體系建立及優(yōu)化

雙重PCR 擴(kuò)增體系：反應(yīng)總體積為20μL，DNA 模 板1 μL，10×Buffer（Mg2＋）2 μL、2.5mmol／L dNTP（4種脫氧核糖核苷三磷酸的混合物）4μL、兩對(duì)2.5mmol／L的上下游引物各0.2μL、Taq酶（2.5U／μL）0.2μL，用滅菌雙蒸水補(bǔ)充至20μL。

PCR 循環(huán)參數(shù)：采用熱啟動(dòng)，預(yù)變性94 ℃4min，變性94 ℃1min，退火56 ℃1min，延伸72 ℃2min，30個(gè)循環(huán)，終延伸72 ℃7min。用含有0.5μg／mL 溴化乙啶（EB）的1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)擴(kuò)增產(chǎn)物，在凝膠成像系統(tǒng)下拍照記錄結(jié)果。

以“1.2.2”中提取的副溶血性弧菌標(biāo)準(zhǔn)株菌液DNA 為模板，基于雙重PCR 檢測(cè)的初始反應(yīng)體系及條件，分別從引物濃度、模板量、退火溫度等反應(yīng)體系條件進(jìn)行優(yōu)化。

1.2.4 雙重PCR 特異性及靈敏度檢測(cè)

特異性檢測(cè)：分別提取海水貝類(lèi)常攜帶的金黃色葡萄球菌、大腸桿菌、產(chǎn)氣桿菌及沙門(mén)氏菌模板DNA，作為對(duì)照菌株，在最佳雙重PCR 體系及條件下擴(kuò)增，驗(yàn)證本方法用于副溶血性弧菌檢測(cè)的特異性。

靈敏度檢測(cè)：將過(guò)夜培養(yǎng)的副溶血性弧菌菌液用無(wú)菌的生理鹽水進(jìn)行10倍梯度稀釋?zhuān)鼓繕?biāo)菌濃度由依次為：2.5×107、2.5×106……2.5×102、27、3cfu／mL。分別提取不同濃度菌液的模板DNA，在最佳雙重PCR 體系及條件下擴(kuò)增，確定雙重PCR 的檢測(cè)靈敏度。

1.2.5 人工污染紅螺樣品的制備及檢出限檢測(cè)

無(wú)菌操作取經(jīng)檢測(cè)無(wú)副溶血性弧菌的紅螺樣品25g，經(jīng)生理鹽水沖洗后，加入營(yíng)養(yǎng)肉湯中，充分搖勻制成均質(zhì)液，用無(wú)菌生理鹽水對(duì)初始濃度為2.5×107cfu／mL的副溶血性弧菌菌液作10倍梯度稀釋?zhuān)?mL不同稀釋梯度菌懸液人工接種225mL均質(zhì)液中，37 ℃恒溫培養(yǎng)，150r／min增菌培養(yǎng)8h，提取模板DNA，進(jìn)行雙重PCR 檢測(cè)，確定人工污染紅螺樣品的最低檢出限。

1.2.6 海水貝類(lèi)的實(shí)際檢測(cè)

以“1.1.4”研磨后樣品分裝500 mL 滅菌三角瓶（已加入225mL營(yíng)養(yǎng)肉湯），37℃恒溫培養(yǎng)，150r／min增菌培養(yǎng)8h，取增菌液1 mL 提取DNA，進(jìn)行副溶血性弧菌雙重PCR 檢測(cè)。

1.2.7 生理生化驗(yàn)證

根據(jù)GB 4789.7—2013 食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行驗(yàn)證分析。

1.2.7.1 初步驗(yàn)證

氧化酶實(shí)驗(yàn)：挑選純培養(yǎng)的單個(gè)菌落進(jìn)行氧化酶實(shí)驗(yàn)，副溶血性弧菌為氧化酶陽(yáng)性。涂片鏡檢：將可疑菌落涂片，進(jìn)行革蘭氏染色，鏡檢觀察形態(tài)。副溶血性弧菌為革蘭氏陰性，呈棒狀、弧狀、卵圓狀等多形態(tài)，無(wú)芽孢，有鞭毛；挑取純培養(yǎng)的單個(gè)可疑菌落，轉(zhuǎn)至3%氯化鈉三糖鐵瓊脂斜面并穿刺底層，37 ℃培養(yǎng)24h觀察結(jié)果。副溶血性弧菌在3%氯化鈉三糖鐵瓊脂中的反應(yīng)為底層變黃不變黑，無(wú)氣泡，斜面顏色不變或紅色加深，有動(dòng)力。嗜鹽性實(shí)驗(yàn)：挑取純培養(yǎng)的單個(gè)可疑菌落，分別接種6%、8%和10%不同質(zhì)量分?jǐn)?shù)的氯化鈉胰胨水（以不加氯化鈉為空白對(duì)照），37 ℃培養(yǎng)24h，觀察液體混濁情況。副溶血性弧菌在無(wú)氯化鈉和10%氯化鈉的胰胨水中不生長(zhǎng)或微弱生長(zhǎng)，在含6%和8%氯化鈉的胰胨水中生長(zhǎng)旺盛。

1.2.7.2 確定驗(yàn)證

取純培養(yǎng)物分別接種含3%氯化鈉的甘露醇實(shí)驗(yàn)培養(yǎng)基、賴(lài)氨酸脫羧酶實(shí)驗(yàn)培養(yǎng)基、MR－VP培養(yǎng)基，37 ℃培養(yǎng)36h后觀察結(jié)果；利用3%氯化鈉三糖鐵瓊脂隔夜培養(yǎng)物進(jìn)行ONPG 實(shí)驗(yàn)。

2 結(jié)果與分析

2.1 退火溫度優(yōu)化

利用梯度方式對(duì)雙重PCR 的退火溫度進(jìn)行優(yōu)化，結(jié)果表明，在退火溫度為55、56 ℃時(shí)，兩特異條帶同時(shí)擴(kuò)增清晰且無(wú)引物二聚體，考慮到降低退火溫度可以提高擴(kuò)增效率，最終選取55℃為最佳退火溫度。

2.2 模板量?jī)?yōu)化

雙重PCR 模板量?jī)?yōu)化后表明，只有當(dāng)模板量為1μL時(shí)，兩條帶同時(shí)擴(kuò)增較為清晰，選擇1μL為雙重PCR 檢測(cè)的最佳模板量。

2.3 引物濃度優(yōu)化

雙重PCR 兩對(duì)引物體積配比優(yōu)化結(jié)果表明，當(dāng)引物1與引物2的體積比為1∶1時(shí)，兩特異條帶亮度一致，擴(kuò)增清晰。

2.4 特異性及靈敏度檢測(cè)結(jié)果

如圖1所示，分別以副溶血性弧菌標(biāo)準(zhǔn)株、沙門(mén)氏菌、大腸桿菌、金黃色葡萄球菌及產(chǎn)氣桿菌為模板DNA，按最佳反應(yīng)體系及條件進(jìn)行雙重PCR 擴(kuò)增，結(jié)果顯示，只有副溶血性弧菌標(biāo)準(zhǔn)株可擴(kuò)增出二條特異條帶，大小為450和269bp，與理論值相符，而其他4株致病菌除引物二聚體外均未出現(xiàn)任何擴(kuò)增條帶，說(shuō)明該雙重PCR 特異性良好。

圖1 雙重PCR 特異性檢測(cè)結(jié)果Fig.1 Specificity of the duplex PCR primers

菌懸液濃度梯度稀釋后，經(jīng)菌落平板計(jì)數(shù)、對(duì)提取不同梯度稀釋模板DNA 進(jìn)行相應(yīng)的雙重PCR。如圖2所示，菌液濃度為2.5×102cfu／mL時(shí)，仍可檢出兩條特異條帶，即雙重PCR 檢測(cè)純菌液的靈敏度約為2.5×102cfu／mL，該靈敏度可滿(mǎn)足樣品選擇性增菌后的檢測(cè)要求。

圖2 雙重PCR 靈敏度檢測(cè)結(jié)果Fig.2 Test for the sensitivity of the duplex PCR

2.5 人工污染紅螺樣品的檢出限

檢測(cè)結(jié)果如圖3 所示，濃度為2.5×102cfu／mL的菌液污染紅螺樣品仍可檢出，經(jīng)計(jì)算，此雙重PCR 檢測(cè)模擬污染紅螺樣品檢出限為10cfu／g。

圖3 模擬樣品雙重PCR 檢測(cè)結(jié)果Fig.3 The duplex PCR of simulative samples

2.6 雙重PCR快速檢測(cè)新鮮海水貝類(lèi)樣品

以1～77號(hào)紅螺樣品、1～63號(hào)方形馬珂蛤樣品、1～61號(hào)菲律賓蛤仔增菌液的基因組DNA作模板，在雙重PCR 最佳反應(yīng)體系及條件下擴(kuò)增，如圖4 所示。所有PCR 均為陽(yáng)性樣品。77份新鮮紅螺樣品中共有15份PCR 陽(yáng)性樣品，63份四角蛤蜊樣品有8份陽(yáng)性樣品、61份菲律賓蛤仔有5份陽(yáng)性樣品。

2.7 生理生化實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證結(jié)果

對(duì)201份海水貝類(lèi)樣品（紅螺、方形馬珂蛤及菲律賓蛤仔）中的可疑菌落分別進(jìn)行革蘭氏染色、鏡檢及系列生理生化實(shí)驗(yàn)。圖4結(jié)果與傳統(tǒng)實(shí)驗(yàn)結(jié)果對(duì)比可知，28份同時(shí)出現(xiàn)兩特異條帶的PCR陽(yáng)性樣品中均可篩選到鏡檢結(jié)果及生理生化指標(biāo)與副溶血性弧菌標(biāo)準(zhǔn)株相同的陽(yáng)性菌株，與傳統(tǒng)實(shí)驗(yàn)結(jié)果符合率100%；而沒(méi)有條帶出現(xiàn)的樣品中未有副溶血性弧菌菌檢出。

圖4 雙重PCR 檢測(cè)新鮮紅螺、方形馬珂蛤、菲律賓蛤仔樣品結(jié)果Fig.4 The duplex PCR result of fresh Rapana bezona Linnaeus，Mactra veneriformis and Ruditapes philippinarum samples

因此，在應(yīng)用雙重PCR 方法檢測(cè)海水貝類(lèi)樣品時(shí)，當(dāng)檢測(cè)結(jié)果同時(shí)出現(xiàn)兩條特異性條帶的樣品，可計(jì)為副溶血性弧菌陽(yáng)性樣品，當(dāng)沒(méi)有條帶出現(xiàn)時(shí)可計(jì)為副溶血性弧菌陰性樣品。表2分別列出春夏兩季鮮活海水貝類(lèi)樣品中副溶血性弧菌的檢出率。

3 結(jié) 論

本實(shí)驗(yàn)以副溶血性弧菌的特異基因tl與毒力基因tdh為靶基因選擇了兩對(duì)引物，檢測(cè)海水貝類(lèi)中副溶血性弧菌的雙重PCR 快速方法。對(duì)雙重PCR 的反應(yīng)條件進(jìn)行了優(yōu)化，使雙重PCR具有良好的特異性以及敏感性，靈敏度可達(dá)到2.5×102cfu／mL。人工污染副溶血性弧菌的海水貝類(lèi)檢出限為10cfu／g，每批樣品從樣品處理到出結(jié)果只需16h，且便于批量檢測(cè)，而傳統(tǒng)培養(yǎng)方法需要4～5d或更長(zhǎng)的時(shí)間，不宜大批量操作。本實(shí)驗(yàn)所選兩對(duì)引物較其他相比敏感性有較大提高，具有廣闊的應(yīng)用前景和較強(qiáng)的實(shí)際應(yīng)用價(jià)值，為大連周邊海鮮集市海水貝類(lèi)的副溶血性弧菌檢測(cè)提供一種有效的檢測(cè)方法。

對(duì)海鮮市場(chǎng)隨機(jī)抽取的77份新鮮紅螺樣品、63份方形馬珂蛤樣品、61份菲律賓蛤仔進(jìn)行雙重PCR 的實(shí)際檢測(cè)，經(jīng)驗(yàn)證，最終共檢出陽(yáng)性樣品28份，春夏兩季紅螺樣品中副溶血性弧菌的檢出率分別為13.3%、25%，方形馬珂蛤?yàn)?.7%、21.2%，菲律賓蛤仔為0、16.1%。由三類(lèi)樣品兩季檢出率對(duì)比可知，春季檢出率均較低、夏季檢出率均較高。隨著天氣逐漸轉(zhuǎn)暖，致使一些食源性副溶血菌不容易滅活，所以生吃海鮮尤其在夏季可能會(huì)引起食物中毒，或者感染性的腸道腹瀉，副溶血性弧菌在海水貝類(lèi)中的危險(xiǎn)性不容忽視。

表2 春夏兩季鮮活海水貝類(lèi)樣品中副溶血性弧菌檢出率Tab.2 Vibrio parahaemolyticus detection rate of fresh shellfish samples in spring and summer

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