基于高效指紋圖譜和網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)的琥珀消石顆粒質(zhì)量標(biāo)志物預(yù)測

趙 琦 李海松 閆 菲 王繼升 米新寶 趙 聰 張華南 李曰慶

(1 北京中醫(yī)藥大學(xué)東直門醫(yī)院男科,北京,100700; 2 北京中醫(yī)藥大學(xué)東直門醫(yī)院皮科,北京,100700)

琥珀消石顆粒(Hupo Xiaoshi Granule，HXG)主要成分有琥珀、海金沙、金錢草、牛膝、郁金等，主要具有清熱利濕、通淋消石之療效。臨床中用于石淋、血淋濕熱瘀結(jié)證者[1-4]。目前，HXG被收錄于《衛(wèi)生部藥品標(biāo)準(zhǔn)》中藥成方制劑第十八冊，然而標(biāo)準(zhǔn)中僅使用薄層色譜方法進(jìn)行質(zhì)量控制，方法可重復(fù)性低，且不能很好地進(jìn)行全面質(zhì)控?，F(xiàn)有的臨床研究已經(jīng)證明HXG在泌尿系感染及泌尿系結(jié)石方面有較好療效，但是其作用機(jī)制仍不夠全面，這也為HXG上市后再評價(jià)及藥效學(xué)等研究提出了新的挑戰(zhàn)。

眾所周知,中藥有“多成分-多靶點(diǎn)”的特性,僅對單一化合物的檢測很難全面代表全方藥效,而且中藥成分的復(fù)雜性更嚴(yán)重影響了復(fù)方質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)控制,因而在2016年劉昌孝院士提出了質(zhì)量標(biāo)志物(Quality Markers,Q-Marker)的概念,是中藥材質(zhì)控的全新方法[5]。近年來,中藥指紋圖譜作為一種綜合的、可量化的鑒定方法,能更詳細(xì)了解中藥中所包括的化合物質(zhì),專門用于中藥質(zhì)量控制,是研究中藥復(fù)方藥效組成的關(guān)鍵方法[6-7]。網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)建立在高通量測序、系統(tǒng)生物學(xué)的基礎(chǔ)上,通過搭建“藥物-靶點(diǎn)-疾病”立體生物學(xué)網(wǎng)絡(luò),能夠更好地了解藥物和藥物、藥物和靶點(diǎn)之間作用關(guān)系,從而更加全面了解中藥藥效特性,闡釋復(fù)方臨床應(yīng)用的科學(xué)內(nèi)涵[8-9]。因此,本研究將聯(lián)合高效液相色譜(High Performance Liquid Chromatography,HPLC)指紋圖譜與網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)技術(shù),從“多成分-多靶點(diǎn)”角度,更加系統(tǒng)、科學(xué)地對HXG進(jìn)行質(zhì)量控制,預(yù)測其發(fā)揮藥效的Q-Marker,為今后HXG的質(zhì)控和分子機(jī)制研究提供前期依據(jù)。

1 儀器與試藥

1.1 儀器 液相色譜儀(日本株式會社島津制作所,日本,型號:LC-20AT);電子天平(梅特勒-托利多儀器有限公司,瑞士,型號:XS205DU);電子天平(梅特勒-托利多儀器有限公司,瑞士,型號:AB204-S);數(shù)控超聲波清洗器(昆山市超聲儀器有限公司,型號:KQ-250E)。

1.2 試劑 乙腈(色譜純,TEDIA公司,美國,貨號:AS1122-801);甲醇(分析純,天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司,貨號:200-659-6);甲酸(分析純,國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司,貨號:A118P500);磷酸(分析純,天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司,貨號:231-633-2);三氟乙酸(分析純,國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司,貨號:80134718)。

1.3 分析樣品 對照品槲皮素-3-O-(2G-α-L-鼠李糖基)-蕓香糖苷(批號:111521-201406),購自成都克洛瑪生物科技有限公司;對照品山柰酚-3-O-蕓香糖苷(批號:112007-201602)、β-蛻皮甾酮(批號:111638-201907)、槲皮素(批號:100081-201610)、山柰酚(批號:110861-201611),均購自中國食品藥品檢定研究院。12批(批號:092112037、092112039、092112041、092201004、092201012、092201016、092202019、092202022、092202024、092205025、092205027、092205028)HXG樣品,由北京中醫(yī)藥大學(xué)東直門醫(yī)院提供。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件 以十八烷基硅烷鍵合硅膠為填充劑的色譜柱,檢測波長為254 nm,柱溫25 ℃;進(jìn)樣量10 μL;流動相為0.1%三氟乙酸(A)-乙腈(B)。梯度洗脫:0～15 min,97%～95%A,3%～5%B;15～35 min,95%～88%A,5%～12%B;35～70 min,88%～75%A,12%～25%B;70～90 min,75%～62%A,25%～38%B;90～110 min,62%～40%A,38%～60%B;110～112 min,40%～97%A,60%～3%B;112～120 min,97%A,3%B。

2.2 對照品溶液的制備 分別取槲皮素-3-O-(2G-α-L-鼠李糖基)-蕓香糖苷、山柰酚-3-O-蕓香糖苷、β-蛻皮甾酮、槲皮素、山柰素適量,精密稱定,加甲醇制成每1 mL含槲皮素-3-O-(2G-α-L-鼠李糖基)-蕓香糖苷60 μg、山柰酚-3-O-蕓香糖苷70 μg、β-蛻皮甾酮80 μg、槲皮素70 μg、山柰素60 μg的混合對照品溶液。

2.3 供試品溶液的制備 取HXG適量,除去包衣,研細(xì),取約5 g,精密稱定,置具塞錐形瓶中,精密加入70%甲醇20 mL,稱重,超聲處理(250 W,40 kHz)40 min,取出,放冷,再稱定重量,用70%甲醇補(bǔ)足減失的重量,放冷,濾過,即得HXG供試品溶液。

2.4 方法學(xué)考察

2.4.1 精密度試驗(yàn) 取同一供試品溶液,連續(xù)進(jìn)樣6次,記錄色譜圖,測得各共有峰相對保留時(shí)間和相對峰面積的相對標(biāo)準(zhǔn)偏差(Relative Standard Deviation,RSD)<3%;將所得的色譜圖進(jìn)行相似度分析,結(jié)果顯示其相似度大于0.96,表明儀器精密度良好,符合指紋圖譜研究要求。

2.4.2 供試品溶液穩(wěn)定性試驗(yàn) 取同一供試品溶液,分別在0 h、3 h、6 h、9 h、12 h、24 h進(jìn)樣,記錄色譜圖,測得各共有峰相對保留時(shí)間和相對峰面積的RSD<3%;將所得的色譜圖進(jìn)行相似度分析,結(jié)果顯示其相似度大于0.97,表明24 h內(nèi)供試品溶液穩(wěn)定性良好,符合指紋圖譜研究要求。

2.4.3 重復(fù)性試驗(yàn) 取同一批樣品,按照上述方法制備6份供試品溶液,分別進(jìn)樣,記錄色譜圖,測得各共有峰相對保留時(shí)間和相對峰面積的RSD<3%;將所得的色譜圖進(jìn)行相似度分析,結(jié)果顯示其相似度大于0.97,表明方法重復(fù)性良好,符合指紋圖譜研究要求。

2.5 HXG指紋圖譜的建立 取12批HXG按以上初步篩選確定的琥珀消石顆粒指紋圖譜測定方法測定,記錄色譜峰,得到12批次HXG高效液相色譜圖。見圖1。將12批HXG色譜圖導(dǎo)入國家藥典委員會“中藥色譜指紋圖譜相似度評價(jià)系統(tǒng)”(2012版),得到12批HXG在254 nm波長下的指紋圖譜。見圖2。設(shè)S1為參照圖譜,采用中位數(shù)法,時(shí)間窗為0.1,經(jīng)過峰譜多點(diǎn)校正,標(biāo)記峰匹配后生成共有模式的對照指紋圖譜,并計(jì)算12批琥珀消石顆粒中共有峰的相似度。

圖1 HXG標(biāo)準(zhǔn)指紋圖譜

圖2 琥珀消石顆粒HPLC指紋圖譜共有模式

2.6 共有峰指認(rèn) 分別制備琥珀消石顆粒樣品、各個(gè)單味藥飲片的供試品溶液及混合對照品溶液,分別采集指紋圖譜。將琥珀消石顆粒樣品色譜圖中各共有峰與藥材飲片、混合對照品的色譜峰進(jìn)行比對,共指認(rèn)5個(gè)共有峰,分別是8號峰槲皮素-3-O-(2G-α-L-鼠李糖基)-蕓香糖苷、9號峰山柰酚-3-O-蕓香糖苷、10號峰β-蛻皮甾酮、12號峰槲皮素、13號峰山柰素。

2.7 相似性分析 對12批琥珀消石顆粒的高效液相色譜圖進(jìn)行分析,以10號峰β-蛻皮甾酮為參照峰,以參照峰的保留時(shí)間和峰面積為1.00,分別計(jì)算各共有峰的保留時(shí)間相對值和峰面積相對值,采用“中藥色譜指紋圖譜相似性評價(jià)系統(tǒng)”(2012版)對指紋圖譜數(shù)據(jù)進(jìn)行分析,計(jì)算12批琥珀消石顆粒與對照指紋圖譜之間的相似性。12批琥珀消石顆粒與對照指紋圖譜之間的相似性在0.955～0.999,各批次與對照指紋圖譜之間的相似性均>0.950。見表1～3。由此可見,12批琥珀消石顆粒總體相似性較高,說明本實(shí)驗(yàn)使用的12批琥珀消石顆粒質(zhì)量較為穩(wěn)定。

表1 12批HXG共有峰保留時(shí)間相對值

表2 12批HXG共有峰峰面積相對值

表3 12批HXG相似性分析結(jié)果

2.8 網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)預(yù)測

2.8.1 預(yù)測方法

2.8.1.1 化合物-靶點(diǎn)預(yù)測 檢索中藥系統(tǒng)藥理學(xué)分析平臺及相關(guān)數(shù)據(jù)庫,包括中藥系統(tǒng)藥理學(xué)數(shù)據(jù)庫與分析平臺(Traditional Chinese Medicine Systems Pharmacology Database and Analysis Platform,TCMSP)、中藥分子機(jī)制生物信息學(xué)分析工具(Bioinformatics Analysis Tool for Molecular Mechanism of Traditional Chinese Medicine,BATMAN-TCM)、SwissTargetPrediction中槲皮素-3-O-(2G-α-L-鼠李糖基)-蕓香糖苷、山柰酚-3-O-蕓香糖苷、β-蛻皮甾酮、槲皮素、山柰素相關(guān)靶點(diǎn),建立化合物-靶點(diǎn)數(shù)據(jù)集。

2.8.1.2 網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建 將靶點(diǎn)數(shù)據(jù)集導(dǎo)入STRING數(shù)據(jù)庫(https://string-db.org/,ver.11.0)中進(jìn)行蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用(Protein-protein Interaction,PPI)分析。篩選條件選擇為“Homo sapiens”,選擇最小PPI分值為0.900,構(gòu)建PPI網(wǎng)絡(luò)。將PPI結(jié)果導(dǎo)入Cytoscape軟件進(jìn)行網(wǎng)絡(luò)圖展示,網(wǎng)絡(luò)中靶點(diǎn)用“節(jié)點(diǎn)”表示,節(jié)點(diǎn)與節(jié)點(diǎn)間關(guān)系用“邊”表示。

2.8.1.3 富集分析 為全面了解篩選靶點(diǎn)作用機(jī)制,將上述靶點(diǎn)導(dǎo)入DAVID數(shù)據(jù)庫(https://david.ncifcrf.gov/)進(jìn)行基因本體(Gene Ontology,GO)富集分析和京都基因與基因組百科全書(Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes,KEGG)富集分析。GO富集分析主要可注釋靶點(diǎn)的功能和定位,包括生物過程(Biological Process,BP)、細(xì)胞組分(Cellular Component,CC)和分子功能(Molecular Function,MF)。KEGG可獲得候選靶點(diǎn)所富集的信號通路,篩選關(guān)鍵信號通路,建立“成分-靶點(diǎn)-通路”網(wǎng)絡(luò)。

2.8.2 預(yù)測結(jié)果

2.8.2.1 活性成分-靶點(diǎn)預(yù)測 共檢索到槲皮素-3-O-(2G-α-L-鼠李糖基)-蕓香糖苷、山柰酚-3-O-蕓香糖苷、β-蛻皮甾酮、槲皮素、山柰素對應(yīng)的214個(gè)靶點(diǎn)。

2.8.2.2 PPI網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建 PPI網(wǎng)絡(luò)圖中共獲得160個(gè)節(jié)點(diǎn),661個(gè)邊,根據(jù)“度”值可獲得靶點(diǎn)重要性排序,其中前10位靶點(diǎn)為信號轉(zhuǎn)導(dǎo)及轉(zhuǎn)錄激活因子3(Signal Transducer and Activator of Transcription 3,STAT3)、白細(xì)胞介素-10(Interleukin-10,IL-10)、腫瘤壞死因子(Tumor Necrosis Factor,TNF)、白細(xì)胞介素-6(Interleukin-6,IL-6)、轉(zhuǎn)錄因子Jun(Transcription Factor Jun,JUN)、白細(xì)胞介素-1β(Interleukin-1 Beta,IL-1β)、基質(zhì)金屬蛋白酶1(Matrix Metalloproteinase-1,MMP1)、轉(zhuǎn)錄因子p65(Rela/Transcription Factor p65,RELA)、白細(xì)胞介素-1α(Interleukin-1 Alpha,IL-1α)、C-X-C趨化因子配體8(C-X-C Motif Chemokine Ligand 8,CXCL8)。見圖3。

2.8.2.3 GO和KEGG富集分析 GO富集分析結(jié)果顯示,HXG作用靶點(diǎn)在BP上顯著富集在氧化應(yīng)激、脂質(zhì)代謝、應(yīng)激反應(yīng)等過程;CC主要分布在細(xì)胞外空間、膜筏、膜微域、細(xì)胞質(zhì)等部位;MF主要富集在蛋白結(jié)合、調(diào)控轉(zhuǎn)錄因子、促進(jìn)激酶結(jié)合等。見圖4。KEGG富集分析結(jié)果顯示,HXG作用靶點(diǎn)顯著富集在高級糖基化終產(chǎn)物(Advanced Glycation End-product,AGE)/高級糖基化終產(chǎn)物受體(Receptor for Advanced Glycation End-Product,RAGE)、促分裂原激活蛋白激酶(Mitogen-activated Protein Kinase，MAPK)、低氧誘導(dǎo)因子-1(Hypoxia Inducible Factor-1，HIF-1)、白細(xì)胞介素-17(Interleukin-17，IL-17)、TNF、松弛素(Relaxin)、磷脂酰肌醇3-激酶(Phosphatidylinositol-3-kinase，PI3K)-蛋白激酶B(Protein Kinase B，AKT)等信號通路。選擇P<0.01排名前20位條目繪制氣泡圖進(jìn)行可視化展示。見圖5。

2.8.2.4 “活性成分-靶點(diǎn)-通路”網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建 “活性成分-靶點(diǎn)-通路”網(wǎng)絡(luò)發(fā)現(xiàn)槲皮素-3-O-(2G-α-L-鼠李糖基)-蕓香糖苷、山柰酚-3-O-蕓香糖苷、β-蛻皮甾酮、槲皮素、山柰素5種活性成分連接度(Degree)值均較高,均可能為HXG發(fā)揮藥效的活性成分,可作為本品潛在的Q-marker;核因子激活的B細(xì)胞的κ-輕鏈增強(qiáng)(Nuclear Factor NF-kappa-B p105 Subunit,NF-κB)、MAPK1、AKT1、JUN、TNF、MAPK8、IL-6為Degree值較高,可能為HXG治療的潛在重要靶點(diǎn);AGE/RAGE、MAPK、HIF-1、IL-17、TNF、Relaxin、PI3K-AKT信號通路Degree值差異性較小,可能為HXG的關(guān)鍵信號通路。見圖6。

圖6 HXG“活性成分-靶點(diǎn)-通路”網(wǎng)絡(luò)

3 討論

泌尿系結(jié)石,又叫“尿石癥”,屬于中醫(yī)學(xué)“石淋”“腰痛”等范疇,是中醫(yī)外科常見病、多發(fā)病。HXG臨床應(yīng)用于本病治療,方中組成金錢草、赤小豆、當(dāng)歸、海金沙、琥珀、雞內(nèi)金、牛膝、蒲黃、郁金。本方以琥珀、赤小豆為君藥,琥珀為金石重鎮(zhèn)之品,配伍赤小豆化瘀通淋效果更佳。琥珀化石通淋多在古籍文獻(xiàn)中記載,《本草經(jīng)疏》云:“琥珀,專入血分。

心主血,肝藏血,入心入肝,故能消瘀血也?！薄度数S直指方》中單用琥珀為散,燈心湯送服治療泌尿系結(jié)石。金錢草、海金沙為君藥,清熱利濕,通淋排石。雞內(nèi)金化瘀止痛,通淋化石,與金錢草、海金沙配伍構(gòu)成中醫(yī)化石經(jīng)典“三金”角藥;與當(dāng)歸、郁金、蒲黃共為佐藥,活血化瘀,增強(qiáng)化石之力;牛膝為使藥,行氣活血,引藥下行,全方共奏清熱利濕、活血化瘀之功,臨床療效較好[10-11]。

中藥復(fù)方制劑成分多樣,具有多組成、多靶點(diǎn)、多種干預(yù)機(jī)制等特點(diǎn),允許中醫(yī)藥能夠從多角度干預(yù)疾病,這既是中醫(yī)藥優(yōu)勢所在,也為研究中醫(yī)藥科學(xué)內(nèi)涵帶來巨大挑戰(zhàn)。本研究通過建立HXG指紋圖譜,指認(rèn)其共有峰,對中藥成分進(jìn)行網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)分析,初步篩選HXG作用的關(guān)鍵靶點(diǎn)和通路,系統(tǒng)分析了HXG的潛在藥理機(jī)制,為后續(xù)開展實(shí)驗(yàn)研究,以及中藥質(zhì)量控制建立重要基礎(chǔ)。

本實(shí)驗(yàn)在優(yōu)化試供品提取溶媒時(shí),考察了不同比例溶媒(50%乙醇、60%甲醇、70%甲醇),結(jié)果表明,以70%甲醇為提取溶劑時(shí),色譜峰峰數(shù)相對較多、峰面積值大、整體基線好,因此選擇此濃度作為提取溶媒。對超聲提取時(shí)間(40 min、50 min、60 min)進(jìn)行考察,3個(gè)不同超聲提取時(shí)間對色譜峰的影響無顯著差異,最終選擇超聲提取時(shí)間為40 min。在優(yōu)化色譜條件時(shí),對樣品在190～400 nm全波長掃描[12-13],發(fā)現(xiàn)檢測波長為254 nm時(shí),色譜峰峰數(shù)較多,且各色譜峰分離良好,基線平穩(wěn),故選擇254 nm為檢測波長;比較柱溫25 ℃、30 ℃、40 ℃時(shí)色譜圖,當(dāng)柱溫為25 ℃時(shí),各色譜峰的分離度較好,故確定柱溫為25 ℃;考察了甲醇-0.1%磷酸溶液、乙腈-0.1%甲酸溶液、乙腈-0.1%磷酸、乙腈-0.1%三氟乙酸等不同溶劑系統(tǒng)[14-15],結(jié)果顯示以乙腈-0.1%三氟乙酸為流動相進(jìn)行梯度洗脫時(shí),色譜峰分離效果較好,且基線平穩(wěn),各峰形明顯改善。

通過指紋圖譜,本研究初步測定了槲皮素-3-O-(2G-α-L-鼠李糖基)-蕓香糖苷、山柰酚-3-O-蕓香糖苷、β-蛻皮甾酮、槲皮素、山柰素作為HXG潛在的Q-Marker。根據(jù)文獻(xiàn)研究,測定了槲皮素-3-O-(2G-α-L-鼠李糖基)-蕓香糖苷、山柰酚-3-O-蕓香糖苷為金錢草的重要成分,主要具有抗炎、抗氧化、調(diào)節(jié)免疫作用[16-17]。研究證明槲皮素-3-O-(2G-α-L-鼠李糖基)-蕓香糖苷對氧化應(yīng)激造成腎小管損傷具有保護(hù)作用,減少了草酸鈣晶體對細(xì)胞的黏附[18]。β-蛻皮甾酮是牛膝的主要成分,具有改善細(xì)胞凋亡、抗氧化等作用[19]。槲皮素和山柰素是金錢草、當(dāng)歸、牛膝的共有組成,具有顯著的抗炎、抗氧化作用[20-21]。根據(jù)可測性和可溯性特點(diǎn),以上5種成分均可以得到指認(rèn),因此將以上5種成分確定為候選化合物。

網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)分析的結(jié)果表明,HXG的5種成分可作用于核因子κB,該蛋白是參與炎癥和免疫調(diào)控的重要轉(zhuǎn)錄因子,能夠促進(jìn)炎癥介質(zhì)IL-6、IL-8等的釋放,進(jìn)而參與結(jié)石生成[22]。MAPK家族成員包括MAPK1、MAPK8等,主要參與增殖、分化、細(xì)胞凋亡、氧化應(yīng)激等過程[23]。有研究已經(jīng)證實(shí)微循環(huán)中氧化應(yīng)激反應(yīng)升高能夠促進(jìn)腎草酸鈣結(jié)石形成,并伴有p38MAPK水平升高[24]。TNF由活化的巨噬細(xì)胞產(chǎn)生,介導(dǎo)全身炎癥反應(yīng),參與結(jié)石生成[25-26]。KEGG通路富集分析表明,HXG主要參與調(diào)節(jié)免疫、炎癥等信號通路。PI3K-AKT信號通路是機(jī)體關(guān)鍵通路,廣泛調(diào)控細(xì)胞增殖、分化[27-28]。當(dāng)受到炎癥、缺氧等不利因素刺激時(shí),PI3K-AKT信號通路會被過度激活,導(dǎo)致細(xì)胞增殖異常,組織修復(fù)障礙,結(jié)石生成[29]。HIF-1是應(yīng)對缺氧而被激活的主要轉(zhuǎn)錄因子,在缺氧條件下,HIF-1α與基因組中的缺氧反應(yīng)元件結(jié)合,介導(dǎo)下游細(xì)胞凋亡、血管生成等過程[30]。研究表明,HIF-1蛋白的激活誘導(dǎo)下游Bcl-2相互作用蛋白3(BCL2 Interacting Protein 3,BNIP3)表達(dá),促進(jìn)細(xì)胞凋亡及結(jié)石生成[31]?？梢?網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)預(yù)測的結(jié)果與現(xiàn)有文獻(xiàn)研究較一致,表明以上研究結(jié)果準(zhǔn)確性較高。HXG中的這5種成分可通過作用于多種靶點(diǎn),干預(yù)多條通路進(jìn)而發(fā)揮藥效作用,也證明了本次指紋圖譜篩選的結(jié)果具有一定科學(xué)性。

綜上所述,本研究結(jié)合高效指紋圖譜和網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)初步確定了槲皮素-3-O-(2G-α-L-鼠李糖基)-蕓香糖苷、山柰酚-3-O-蕓香糖苷、β-蛻皮甾酮、槲皮素、山柰素為HXG潛在的Q-Marker,為中藥量化評價(jià)與辨識提供了全新的方式,避免了藥物質(zhì)控中僅以單一成分作為復(fù)方評價(jià)的唯一標(biāo)準(zhǔn)的問題。本研究的局限在于,通過網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)發(fā)現(xiàn)藥理活性成分和靶點(diǎn)是理論預(yù)測的結(jié)果,應(yīng)通過實(shí)驗(yàn)進(jìn)行驗(yàn)證,后續(xù)研究將集中于使用動物實(shí)驗(yàn)和臨床研究來驗(yàn)證該假設(shè),以提高臨床用藥的合理性和科學(xué)性。

利益沖突聲明:無。