外泌體與心血管疾病研究進(jìn)展

陳家顯綜述，桂慶軍審校

（1.南華大學(xué)附屬第二醫(yī)院心血管內(nèi)科，湖南衡陽421001；2.南華大學(xué)醫(yī)學(xué)院，湖南衡陽421000）

外泌體與心血管疾病研究進(jìn)展

陳家顯1綜述，桂慶軍2審校

（1.南華大學(xué)附屬第二醫(yī)院心血管內(nèi)科，湖南衡陽421001；2.南華大學(xué)醫(yī)學(xué)院，湖南衡陽421000）

外泌體；干細(xì)胞；心血管疾病；綜述

外泌體（exosomes）是一種由細(xì)胞內(nèi)涵體網(wǎng)產(chǎn)生的膜性囊泡狀結(jié)構(gòu)小體，分為早期核內(nèi)體和晚期核內(nèi)體，可攜帶多種多肽類、生物活性脂質(zhì)、核苷酸。其代謝過程廣泛參與了體內(nèi)生理和病理調(diào)節(jié)。國內(nèi)外的很多證據(jù)表明，外泌體與心血管疾病發(fā)病機(jī)制關(guān)系密切，最近的研究證明，從缺血預(yù)調(diào)或各種干細(xì)胞中收集的外泌體能提供心肌保護(hù)作用，有潛在治療心血管疾病的作用。本文主要綜述外泌體在心血管疾病領(lǐng)域的研究進(jìn)展。

1 外泌體的起源、分泌及分子組成

1.1 外泌體的起源 “外泌體”一詞最初由Johnstone等[1]在研究網(wǎng)織紅細(xì)胞成熟過程中囊泡的形成時提出。自從其首次發(fā)現(xiàn)之后，有很多關(guān)于外泌體起源的研究。外泌體是在內(nèi)涵體網(wǎng)中產(chǎn)生的。早期的外泌體隨著細(xì)胞膜內(nèi)出芽過程的開始而形成，也稱早期核內(nèi)體（early endosomes，EE）；接著內(nèi)胞膜二次內(nèi)出芽形成各種管腔內(nèi)囊泡（intraluminal vesicles，ILVs），即晚期的核內(nèi)體，包含ILVs的后期核內(nèi)體，也被稱為多泡體（multivesicular bodies，MVBs）；最后，MVBs與細(xì)胞膜融合，以胞吐的形式向細(xì)胞外環(huán)境釋放出ILVs，這些ILVs即外泌體；或MVBs移動到細(xì)胞核周圍的區(qū)域與溶酶體直接融合，形成混合細(xì)胞器后被降解。目前，ILVs形成的分子機(jī)制與這些囊泡內(nèi)部的蛋白質(zhì)排列已部分明確。驅(qū)動MVBs形成進(jìn)程的最佳描述機(jī)制是由內(nèi)涵體分選復(fù)合物（endosomal sorting complexes required for transport，ESCRT）系統(tǒng)協(xié)調(diào)的，這也廣泛在近期發(fā)表的文章中被提到[2-5]。簡而言之，該機(jī)制體系包含4種可溶性蛋白復(fù)合物，即ESCRT-0、ESCRT-Ⅰ、ESCRT-Ⅱ、ESCRT-Ⅲ及其輔助蛋白。ESCRT-0負(fù)責(zé)以依賴泛素的形式裝卸轉(zhuǎn)運(yùn)，ESCRT-Ⅰ和ESCRT-Ⅱ誘導(dǎo)出芽的形成，ESCRT-Ⅲ驅(qū)使囊泡分離，輔助蛋白（尤其是VPS4 ATPase）保障ESCRT機(jī)制體系的解離和再生循環(huán)。

1.2 外泌體的分泌 研究發(fā)現(xiàn)，外泌體可由多種細(xì)胞產(chǎn)生，包括樹突狀細(xì)胞、B淋巴細(xì)胞、干細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞、上皮細(xì)胞，還可在多種體液中提取，如血液、尿液、精液（前列腺液）、羊水和胸腔積液中分離[6]。

不管外泌體的釋放是在細(xì)胞中還是體液中，其分泌的最后一步都需要MVBs和細(xì)胞質(zhì)膜進(jìn)行融合。此進(jìn)程可能與一個特定的可溶性N-乙基馬來酰亞胺-敏感因子-聯(lián)合蛋白受體（specific combination of soluble N-ethyl maleimide-sensitive factor-attachment protein receptors，SNAREs）聯(lián)合物相關(guān)：SNAREs囊泡（v-SNAREs，位于MVBs上）與SNAREs靶標(biāo)（t-SNAREs，位于質(zhì)膜的細(xì)胞內(nèi)一側(cè)）相互作用，形成一種膜橋接的SNARE復(fù)合體以進(jìn)行膜融合[7-8]。

1.3 外泌體的分子組成 許多證據(jù)表明，外泌體的組成包含DNA、RNA和蛋白質(zhì)。常見的一套外泌體蛋白已被識別，其可在親本細(xì)胞膜的內(nèi)吞小泡上或在質(zhì)膜上、細(xì)胞質(zhì)基質(zhì)中、高爾基體甚至是細(xì)胞核中找到，但很少在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)或線粒體[9-11]中找到。特定的包裹在外泌體上的膜蛋白包括GPI-錨定蛋白、四跨膜蛋白家族和受體[如腫瘤壞死因子受體1（TNFR1）]；其他包裹在外泌體內(nèi)的特定分子類型包括：（1）腔蛋白；（2）抗原呈遞物（MHC-I、MHC-II）和細(xì)胞黏附物、細(xì)胞結(jié)構(gòu)和能動類（肌動蛋白、肌球蛋白、微管蛋白等）；（3）熱休克蛋白和分子伴侶；（4）代謝酶（β-烯醇酶、脂肪酸合酶等）；（5）信號蛋白[激酶、14-3-3蛋白、GTPase Hras、RhoA、RAP1B、鳥嘌呤核苷酸亞級結(jié)合蛋白（G蛋白）等]；（6）參與轉(zhuǎn)錄和蛋白質(zhì)合成的蛋白（轉(zhuǎn)錄因子、核糖體蛋白、泛素等）。

2 外泌體與冠心病

在發(fā)現(xiàn)外泌體早期，研究多聚焦于外泌體在腫瘤中發(fā)生發(fā)展機(jī)制中的重要作用，隨著對外泌體研究的不斷深入，目前已證實(shí)外泌體介導(dǎo)的細(xì)胞間信息交流過程也廣泛涉及心血管系統(tǒng)的生理及病理過程，有潛在的治療心血管疾病的作用。

2.1 祖細(xì)胞 目前公認(rèn)心臟祖細(xì)胞能在體外通過鼠類心肌活組織樣本無性繁殖形成“球形”結(jié)構(gòu)，并在鼠類或人活體組織切片可見類似“球形”物質(zhì)[12]，該物質(zhì)后來被認(rèn)為是心球樣細(xì)胞團(tuán)（cardiac progenitor cells，CSs）。由于CSs含有心臟中存在的3種主要細(xì)胞類型（心肌細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞和平滑肌細(xì)胞）中的2種的祖細(xì)胞和定向祖細(xì)胞，因此為心臟再生提供了很好的細(xì)胞來源。最近，Ibrahim等[13]展示，心球樣細(xì)胞團(tuán)生成細(xì)胞（cardiospherederived cells，CDCs）生成的外泌體能復(fù)制CDC所誘導(dǎo)的治療效果，并阻礙外泌體產(chǎn)生，抵消CDCs對小鼠心臟梗死產(chǎn)生的有益效應(yīng)。其進(jìn)一步研究了在CDC外泌體中尤其富含的miR-146a，有趣的是，miR-146a雖然可能是CDC外泌體起保護(hù)作用的主要原因，但是不足以單獨(dú)產(chǎn)生綜合的治療效果。因此，其中其他miRNAs（如miR-22、miR-24）可能也發(fā)揮了同樣的作用，或與miR-146a發(fā)揮綜合效果。綜上所述，Ibrahim等[13]提供的數(shù)據(jù)表明，CDC外泌體含有豐富的信號信息，尤其是通過這些外泌體轉(zhuǎn)運(yùn)的miRNAs能夠在鼠類心肌梗死（AMI）模型中提供再生功能，并可不用通過移植活細(xì)胞即可提供CDCs同樣的益處。另外，心臟祖細(xì)胞（cardiac progenitor cells，CPCs）也能向其周圍環(huán)境釋放外泌體，這些外泌體包含基質(zhì)金屬蛋白酶（matrix metalloproteinases，MMPs）和細(xì)胞外基質(zhì)金屬蛋白酶誘導(dǎo)物（extracellular matrix metalloproteinase inducer，EMMPRIN），可對細(xì)胞外基質(zhì)分解時提供援助并激活MMPs[14]。事實(shí)上，Vrijsen等[14]發(fā)現(xiàn)，在體外劃痕實(shí)驗(yàn)中，CPC生成的外泌體能夠刺激內(nèi)皮細(xì)胞的遷移。Chen等[15]發(fā)現(xiàn)，與PBS對照組相比，在小鼠急性心肌缺血/再灌注（I/R）模型的小鼠體內(nèi)遞送CPC外泌體能抑制大約53%的心肌細(xì)胞凋亡。上述研究提示，外泌體是CPC介導(dǎo)的旁分泌效應(yīng)中重要的心臟保護(hù)組分。

2.2 干細(xì)胞 目前對外泌體的研究主要集中在干細(xì)胞領(lǐng)域，最近的研究表明，干細(xì)胞修復(fù)心臟組織的有益效果是通過釋放旁分泌和自分泌因子而發(fā)揮的[16]。實(shí)際上，干細(xì)胞能分泌多種類型的因子/分子以抑制局部免疫及炎性反應(yīng)，促進(jìn)血管生成、細(xì)胞分化及有絲分裂抑制纖維化和凋亡，對缺血心肌有保護(hù)和修復(fù)作用，這些因子/分子包括蛋白質(zhì)、miRNAs、生長因子、抗氧化物、蛋白酶體、微囊泡和外泌體。其中，外泌體在基于脫細(xì)胞的干細(xì)胞治療心血管疾病方面獲得特殊關(guān)注。

Lai等[17]首次展示了人類胚胎干細(xì)胞（embryonic stem cells，ESC）產(chǎn)生的間充質(zhì)干細(xì)胞（mesenchymal stem cells，MSCs）可分泌50～100 nm的膜泡。通過使用一種I/R損傷的離體Langendorff模型，觀察到這些純化的外泌體能夠減少小鼠心臟的梗死面積。Arslan等[18]進(jìn)一步證明，在再灌注前5 min單次快速靜脈注射外泌體，可減少小鼠心臟梗死面積的45%。重要的是，其發(fā)現(xiàn)外泌體療法可在I/R后30 min內(nèi)修復(fù)小鼠心臟功能耗竭并恢復(fù)氧化還原狀態(tài)，升高的ATP和煙酰胺腺嘌呤二核苷酸（NADH）水平及氧化應(yīng)激的降低可證明這一點(diǎn)。另外，活性CD73（負(fù)責(zé)通過釋放腺嘌呤核苷酸來形成細(xì)胞外腺苷酸的主要酶類）和磷酸化PFKFB3（可上調(diào)磷酸果糖激酶）也包含在MSCs生成的外泌體中[18]。而且外泌體療法能夠減少小鼠心肌I/R后產(chǎn)生的系統(tǒng)性炎癥[18]。因此，MSCs生成的外泌體在治療急性心肌梗死方面有強(qiáng)大的潛力。同時，Lee等[19]報道小鼠骨髓分化的MSCs的抗炎活性與外泌體有關(guān)。通過采用一個缺氧誘導(dǎo)的肺動脈高血壓（HPH）小鼠動物模型的研究證明，MCS生成的外泌體（MEX）在體內(nèi)的傳遞可抑制HPH和血管重構(gòu)。此外，高增殖信號也可被MEX治療所阻斷，證據(jù)有其可抑制轉(zhuǎn)錄-3（STAT3）磷酸化作用的信號傳感器和活化劑，導(dǎo)致肺部miR-204（一種富含于肺動脈末端的微小RNA，可下調(diào)人類和疾病實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ偷膒H值）水平的升高。Lee等[19]提供的數(shù)據(jù)顯示，外泌體是MSC旁分泌功能的關(guān)鍵效應(yīng)器。但是，其研究沒有指明這些外泌體內(nèi)所包含的關(guān)鍵成分。

造血干細(xì)胞（hematopoietic stem cells，HSCs）也能產(chǎn)生外泌體，從而對心肌起到保護(hù)作用。最近，Sahoo等[20]的一項(xiàng)研究顯示，人類CD34+干細(xì)胞具有分泌杯狀外泌體的能力，其可表達(dá)CD63、磷脂酰絲氨酸和TSG101。體外研究發(fā)現(xiàn)，CD34+外泌體通過增強(qiáng)內(nèi)皮細(xì)胞活力、增殖和在基底膜基質(zhì)上的管狀形成，復(fù)制了CD34+細(xì)胞生成血管的活性。在一些體內(nèi)研究中，觀察到CD34+細(xì)胞和CD34+外泌體均可誘導(dǎo)血管樣內(nèi)皮結(jié)構(gòu)的生成。在角膜血管生成試驗(yàn)中，含有CD34+外泌體但不含CD34-外泌體的顆粒與血管生長大大增強(qiáng)相關(guān)。因此，這些發(fā)現(xiàn)預(yù)示著CD34+外泌體是CD34+細(xì)胞誘導(dǎo)血管生長的關(guān)鍵旁分泌組成。但是，CD34+外泌體介導(dǎo)的血管生成機(jī)制并不清楚，可能是由于外泌體受體誘導(dǎo)血管生成信號流的激活，或是外泌體內(nèi)容物（蛋白質(zhì)/RNAs）整體轉(zhuǎn)移至內(nèi)皮細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)中。事實(shí)上，Sahoo等[20]提供的數(shù)據(jù)證明，與CD34-外泌體相比，CD34+外泌體高度富含促血管生成的miR-126和miR-130a。但是，這些外泌體miRNAs的轉(zhuǎn)移程度及誘導(dǎo)接受細(xì)胞內(nèi)的何種分子改變?nèi)杂写鞔_。

另外，值得注意的是，缺血預(yù)調(diào)（ischemic preconditioning，IPC）可對心臟I/R所誘導(dǎo)的損傷產(chǎn)生強(qiáng)大的保護(hù)作用[21-22]。但其機(jī)制仍不完全清楚。最近，Giricz等[23]表示，通過蛋白質(zhì)免疫印跡試驗(yàn)提示，從IPC大鼠心臟收集的冠狀動脈流出物比對照組包含更多的細(xì)胞外囊泡（EVs、微囊泡和外泌體）。此外，發(fā)現(xiàn)用從IPC大鼠心臟收集的冠狀動脈流出物灌注后，心臟梗死面積與對照組相比明顯更小。有趣的是，用EVs耗盡的IPC冠狀動脈流出物灌注，則梗死面積與對照組相似。因此，其研究表明，從IPC心臟中釋放的微囊泡/外泌體是造成心臟內(nèi)保護(hù)信號傳遞的原因[23]。與之類似的，Jeanneteau等[24]最近發(fā)現(xiàn)，在經(jīng)歷后肢I(xiàn)/R的動物血液中生成的微囊泡不能降低大鼠心肌梗死面積。上述研究表明，不是微囊泡（微粒），而是外泌體在傳播心臟保護(hù)信號中發(fā)揮作用。當(dāng)然，需要采用臨床相關(guān)的體內(nèi)模型進(jìn)一步研究闡明IPC-外泌體介導(dǎo)的心臟保護(hù)機(jī)制。

3 外泌體與心肌疾病

最近的幾項(xiàng)研究表明，敗血癥患者血漿中外泌體的存在可能會造成血管和心臟的功能障礙。Gambin等[25]報道了在敗血癥中，增加一氧化氮（nitric oxide，NO）的產(chǎn)生和脂多糖（ipopolysaccharide，LPS）的存在能夠觸發(fā)血小板釋放外泌體。通過蛋白質(zhì)免疫印跡試驗(yàn)的證據(jù)，這些敗血癥的外泌體比正常的外泌體包含更高水平的還原型輔酶Ⅱ（nicotinamide adenine dinucleotide phosphate，NADPH）氧化酶，一氧化氮合酶（nitric oxide synthase，NOS）和蛋白質(zhì)二硫鍵異構(gòu)酶（protein disulfide isomerase，PDI）。重要的是，這些作者發(fā)現(xiàn)NO誘導(dǎo)的和人敗血癥血小板所產(chǎn)生的外泌體可誘導(dǎo)caspase-3活化，可通過NADPH氧化酶和Ⅱ型NOS產(chǎn)生活性氧/活性氮（reactive oxygen species/reactive nitrogen specie，ROS/ RNS），使靶向內(nèi)皮細(xì)胞凋亡。提示在病理?xiàng)l件下，血小板產(chǎn)生的外泌體可致血管損傷。Azevedo等[26]進(jìn)一步提供證據(jù)表明，敗血癥患者循環(huán)中血小板所產(chǎn)生的外泌體可誘導(dǎo)離體的兔心臟心肌收縮力降低和大鼠乳頭狀肌準(zhǔn)備減少。這些外泌體的危害可通過預(yù)暴露于LPS而增強(qiáng)，證實(shí)敗血癥血小板所產(chǎn)生的外泌體可保護(hù)NOS，在外泌體內(nèi)生成NO并誘導(dǎo)心臟內(nèi)產(chǎn)生NO。在糖尿病性心肌病變中，心肌血管再生不足是糖尿病導(dǎo)致的缺血性心血管疾病的主要表現(xiàn)形式[27]。在哺乳類動物心臟中，通常認(rèn)為內(nèi)皮細(xì)胞在心肌細(xì)胞存活和心肌收縮中起關(guān)鍵作用。然而，當(dāng)應(yīng)對應(yīng)激狀態(tài)（如高血糖癥）時，心肌細(xì)胞是否有能力影響內(nèi)皮細(xì)胞功能仍是普遍未知的。Wang等[28]報道，與單獨(dú)培養(yǎng)相比，當(dāng)心臟內(nèi)皮細(xì)胞（endothelial cells，ECs）與患有2型糖尿病大鼠（GK）的心肌細(xì)胞共培養(yǎng)時，ECs的增殖和遷移受到顯著抑制。與之相比，ECs與從健康大鼠體內(nèi)分離的心肌細(xì)胞共培養(yǎng)，則可促進(jìn) ECs的增殖和遷移[28]。因此，這些數(shù)據(jù)表明，正常狀態(tài)下心肌細(xì)胞可能對ECs是有益的，而糖尿病型的肌細(xì)胞可能損害ECs的功能。無論心肌細(xì)胞對ECs有益還是有害，當(dāng)使用外泌體抑制劑GW4869處理后，ECs均會被除去。該團(tuán)隊(duì)的進(jìn)一步研究揭示，與從正常心肌細(xì)胞中收集的外泌體相比，糖尿病GK心肌細(xì)胞中的外泌體含有更高水平的miR-320和更低水平的miR-126和熱休克蛋白20（heat shockprotein 20，Hsp20）蛋白，重要的是，心肌細(xì)胞外泌體miR-320可被轉(zhuǎn)運(yùn)至內(nèi)皮細(xì)胞，從而下調(diào)胰島素樣生長因子1（insulinlike growth factor-1，IGF-1）、Hsp20和外轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)-2（external transcribed spacer-2，Ets-2）的表達(dá)，導(dǎo)致EC增殖、遷移和管腔形成受抑制[28]。因此，上述研究可提供一種新的機(jī)制解釋糖尿病中心肌血管生成的受損可能是由于心肌細(xì)胞分泌抗血管生成外泌體所致。

4 小 結(jié)

外泌體作為一種治療性載體，目前的研究主要集中在腫瘤領(lǐng)域，在心血管領(lǐng)域的研究多為現(xiàn)象描述，仍處于起步階段。外泌體是一種新型生物學(xué)標(biāo)志物，作為干細(xì)胞移植療法中的關(guān)鍵載體，為研究和完善心臟保護(hù)性治療靶點(diǎn)提供了新思路。因此，對外泌體的進(jìn)一步研究，將更系統(tǒng)和準(zhǔn)確地了解其與心臟細(xì)胞之間的信號機(jī)制、疾病的轉(zhuǎn)歸過程，對優(yōu)化心臟疾病的診治、預(yù)防具有重要的臨床意義。

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A

1009-5519（2015）16-2461-04

2015-03-26）

陳家顯（1988-），男，海南昌江人，碩士研究生，主要從事心血管疾病臨床診斷與治療工作；E-mail：564455650@qq.com。

桂慶軍（E-mail：1113889115@qq.com）。