腦動(dòng)靜脈畸形病變血管組織學(xué)變化和血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子的表達(dá)*

田　甜，孫雅菲，于　淼，張繼偉，呼鐵民，王維興，王　廣#

1)承德醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院神經(jīng)外科 承德 067000　2)河北醫(yī)科大學(xué)第二醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科 石家莊 050000

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腦動(dòng)靜脈畸形病變血管組織學(xué)變化和血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子的表達(dá)*

田甜1)，孫雅菲2)，于淼1)，張繼偉1)，呼鐵民1)，王維興1)，王廣1)#

1)承德醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院神經(jīng)外科 承德 0670002)河北醫(yī)科大學(xué)第二醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科 石家莊 050000

關(guān)鍵詞腦動(dòng)靜脈畸形；組織學(xué)變化；血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子

摘要目的：探索腦動(dòng)靜脈畸形(CAVM)與腦血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(VEGF)之間的關(guān)系。方法：對(duì)30例CAVM病變血管及病變周?chē)芙M織標(biāo)本行HE染色，觀(guān)察血管的組織學(xué)改變。采用免疫組化法和Western blot法檢測(cè)血管中VEGF蛋白的表達(dá)，采用熒光定量PCR法檢測(cè)血管中VEGF mRNA的表達(dá)。以32例正常腦組織血管標(biāo)本作對(duì)照。結(jié)果：CAVM病變血管和病變周?chē)茌^正常腦血管發(fā)生明顯改變。熒光定量PCR和Western blot檢測(cè)結(jié)果顯示，CAVM病變血管和病變周?chē)芙M織中VEGF mRNA和蛋白表達(dá)水平均高于正常腦血管(P均<0.05)，CAVM病變血管中VEGF mRNA和蛋白表達(dá)水平高于病變周?chē)?t配對(duì)=19.095，3.216，P<0.05)。結(jié)論：VEGF可能對(duì)CAVM的發(fā)生和發(fā)展起著重要作用。

AbstractAim: To explore the pathological characteristics of cerebral arteriovenous malformation(CAVM) and the relationship between CAVM and vascular endothelial growth factor(VEGF). Methods: A total of 30 CAVM and the peripheral vascular tissue were collected. Histological changes in vascular tissues were observed using HE staining.The expression of VEGF proteins were detected by immunohistochemistry and Western Blot. The expression of VEGF mRNA were detected by Real-time PCR.32 normal brain vascular tissue were the control. Results: The histological characteristics of CAVM and peripheral vascular tissue were obviously different from the normal brain vascular tissue. The results of Real-time PCR and Western blot showed that the expression of VEGF protein and mRNA in CAVM and peripheral vascular tissue were significantly higher than those in normal brain vascular tissue(P<0.05), and the expression of VEGF protein and mRNA in CAVM were higher than those in peripheral vascular tissue(tmatch=19.095,3.216,P<0.05). Conclusion: VEGF may play an important role in the occurrence and development of CAVM.

腦動(dòng)靜脈畸形(cerebral arteriovenous malformation，CAVM)為顱內(nèi)常見(jiàn)血管畸形，占腦血管畸形的93%[1-2]。CAVM是一種進(jìn)展性疾病，可導(dǎo)致顱內(nèi)出血、癲癇和慢性神經(jīng)功能障礙，直至死亡[3-5]。傳統(tǒng)觀(guān)點(diǎn)認(rèn)為，CAVM是由一支或數(shù)支迂曲擴(kuò)張的供血?jiǎng)用}、引流靜脈以及畸形血管病灶組成的、發(fā)育異常的腦血管團(tuán)[6-7]。目前，針對(duì)CAVM主要采用顯微外科手術(shù)、血管內(nèi)治療和立體定向放射療法，但臨床效果并不十分滿(mǎn)意。近來(lái)的研究[8]認(rèn)為，CAVM的發(fā)生、發(fā)展及破裂出血不僅僅是先天性腦血管結(jié)構(gòu)異常，而是先天和后天因素共同作用導(dǎo)致的進(jìn)行性血管生成和重塑的結(jié)果。血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)可促進(jìn)血管內(nèi)皮細(xì)胞增殖，誘導(dǎo)血管生成。一般成人腦組織血管基本處于停止生長(zhǎng)的狀態(tài)，沒(méi)有VEGF的表達(dá)。但有研究[9]顯示，CAVM患者腦組織存在VEGF表達(dá)，有新生血管形成，推測(cè)腦組織內(nèi)VEGF過(guò)表達(dá)可能與CAVM的發(fā)病有關(guān)。為探索CAVM的病理學(xué)特點(diǎn)，以及CAVM的發(fā)病與腦組織內(nèi)VEGF之間的關(guān)系，作者進(jìn)行了以下實(shí)驗(yàn)。

1資料與方法

1.1一般資料選取 2008年1月至2014年4月在承德醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院神經(jīng)外科手術(shù)切除的CAVM標(biāo)本30例，均經(jīng)手術(shù)和病理證實(shí)，病灶周?chē)凶銐蚰X組織；患者男12例，女18例；年齡21～60歲，平均42.8歲；首發(fā)癥狀為腦出血12例，癲癇8例，頭痛6例，局限性神經(jīng)功能障礙4例。同時(shí)選取因腦內(nèi)血腫腦疝而行顳極切除的正常腦組織血管標(biāo)本32例；患者男14例，女18例；年齡31～68歲，平均52.8歲。

1.2組織學(xué)觀(guān)察所有標(biāo)本經(jīng)多聚甲醛固定、乙醇脫水、石蠟包埋、連續(xù)切片后封固，行HE染色，觀(guān)察標(biāo)本組織學(xué)改變。

1.3腦組織血管中VEGF蛋白表達(dá)的免疫組化法檢測(cè)兔抗人VEGF一抗、羊抗兔二抗、SP免疫組化試劑盒和DAB顯色試劑盒均購(gòu)自Santa Cruz公司。標(biāo)本4 μm厚切片，常規(guī)脫蠟后，60 ℃烤箱過(guò)夜，二甲苯脫蠟，梯度乙醇水化。采用檸檬酸鹽緩沖液(pH 6.0)高壓抗原修復(fù)法進(jìn)行抗原修復(fù)，PBS淋洗；滴加過(guò)氧化物酶阻斷液，阻斷內(nèi)源性過(guò)氧化物酶活性，室溫孵育10 min；滴加兔抗人VEGF一抗，4 ℃下孵育過(guò)夜，PBS淋洗；滴加羊抗兔熒光二抗，室溫孵育30 min；DAB顯色，蘇木精復(fù)染，梯度乙醇脫水；光學(xué)顯微鏡下觀(guān)察結(jié)果。觀(guān)察切片中3個(gè)高倍(×400)視野，根據(jù)陽(yáng)性細(xì)胞百分比和染色強(qiáng)度進(jìn)行半定量判定。細(xì)胞核呈棕黃色染色的為陽(yáng)性細(xì)胞。按陽(yáng)性細(xì)胞所占百分比評(píng)分：10%～50%為2分，51%～80%為3分，>80%為4分。按染色程度評(píng)分：淺黃色為1分，黃色為2分，深棕黃色為3分。兩項(xiàng)評(píng)分相加，≥2分為陽(yáng)性，陽(yáng)性細(xì)胞百分比<10%時(shí)不論染色強(qiáng)弱均視為陰性。

1.4腦組織血管中VEGF蛋白表達(dá)的Western blot法檢測(cè)取標(biāo)本組織置于研缽中研磨；按1 mg加入10 μL的比例加入RIPA裂解液，加入PMSF蛋白酶抑制劑，于離心管中，4 ℃振搖30 min，4 ℃ 12 000 r/min離心30 min；取上清于-20 ℃保存?zhèn)溆谩５攘靠偟鞍咨蠘?，恒?0 V過(guò)濃縮膠，恒壓120 V過(guò)分離膠，行電泳分離；恒壓80 V 2 h轉(zhuǎn)膜至PVDF膜；TBST緩沖液淋洗3×10 min，加入50 g/L脫脂奶粉室溫封閉1 h；加入VEGF一抗，4 ℃孵育過(guò)夜；TBST緩沖液淋洗3×10 min，加入抗兔二抗，室溫孵育1 h；TBST緩沖液淋洗3×10 min，凝膠成像儀成像。

1.5腦組織血管中VEGF mRNA的熒光定量PCR法檢測(cè)Trizol法提取組織總RNA，逆轉(zhuǎn)錄成cDNA，行PCR擴(kuò)增。參照文獻(xiàn)[10]，由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司設(shè)計(jì)并合成引物。VEGF引物上游為5’-GAAGGAGGAGGGCAGAATCATCAC-3’，下游為5’-CACAGGATGGCTTGAAGATGTACTC-3’，產(chǎn)物大小142 bp；GAPDH引物上游為5’-TGG GGAAGGTGAAGGTCGGAGT-3’，下游為5’-TGA AGGGGTCATTGATGGCAACA-3’，產(chǎn)物大小111 bp。PCR條件：95 ℃預(yù)變性3 min，58 ℃退火延伸15 s，共計(jì)35個(gè)循環(huán)，每次延伸時(shí)讀取熒光值。運(yùn)用AB17500 軟件分析溶解曲線(xiàn)，采用2-ΔΔCt值計(jì)算VEGF mRNA的表達(dá)水平。

1.6統(tǒng)計(jì)學(xué)處理采用SPSS 17.0進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。CAVM病變血管和病變周?chē)苤蠽EGF蛋白陽(yáng)性率的比較采用配對(duì)χ2檢驗(yàn)，VEGF蛋白和mRNA表達(dá)水平的比較采用配對(duì)t檢驗(yàn)；CAVM病變血管、病變周?chē)苤猩鲜鲋笜?biāo)與正常腦血管的比較采用χ2檢驗(yàn)和兩獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)；檢驗(yàn)水準(zhǔn)α=0.05。

2結(jié)果

2.13組血管的組織學(xué)改變HE染色結(jié)果表明，CAVM病變血管各層之間排列紊亂，有部分內(nèi)皮細(xì)胞脫落而暴露出內(nèi)膜下的平滑肌纖維，膠原纖維和平滑肌纖維排列稀疏，參差不齊，血管腔大小不等，管壁厚薄不均，管腔內(nèi)可見(jiàn)淤血，管腔間可見(jiàn)陳舊性出血和小血腫形成(圖1A)。病變周?chē)苡袝r(shí)可見(jiàn)間隙增寬，紅細(xì)胞外滲，出現(xiàn)空泡現(xiàn)象，表現(xiàn)出慢性進(jìn)行性病理改變的過(guò)程(圖1B)。正常腦血管各層排列完整有序，血管結(jié)構(gòu)完整(圖1C)。

圖1　組織學(xué)變化(HE,×400)

A:CAVM病變血管；B:病變周?chē)?；C:正常腦血管。

2.23組血管中VEGF蛋白的表達(dá)見(jiàn)圖2。CAVM病變血管內(nèi)可見(jiàn)VEGF強(qiáng)陽(yáng)性表達(dá)；病變周?chē)芤渤尸F(xiàn)VEGF陽(yáng)性表達(dá)；正常腦血管中VEGF表達(dá)呈陰性。CAVM病變血管、病變周?chē)芎驼ＤX血管中VEGF陽(yáng)性表達(dá)率分別為60.00%(18/30)、30.00%(9/30)和6.25%(2/32)。VEGF在CAVM病變血管、病變周?chē)苤械年?yáng)性表達(dá)率顯著高于正常腦血管(χ2=20.772、5.984，P均<0.001)；而CAVM病變血管中VEGF陽(yáng)性表達(dá)率高于病變周?chē)?χ2=5.455，P=0.020)，見(jiàn)表1。

圖2　3組血管中VEGF蛋白的表達(dá)(SP，×400)

A:CAVM病變血管；B:病變周?chē)?；C:正常腦血管。

2.33組血管中VEGF mRNA和蛋白表達(dá)水平的比較檢測(cè)結(jié)果見(jiàn)表2。CAVM病變血管中VEGF mRNA和蛋白表達(dá)水平高于正常腦血管(t=63.090、11.683，P<0.001)；病變周?chē)苤蠽EGF mRNA和蛋白表達(dá)水平高于正常腦血管(t=38.181、9.035，P<0.001)；而CAVM病變血管中VEGF mRNA和蛋白表達(dá)水平高于病變周?chē)?t配對(duì)=19.095和3.216，P<0.001和P=0.003)。

表2　3組血管中VEGF mRNA和蛋白的表達(dá)

3討論

CAVM是顱內(nèi)常見(jiàn)血管畸形，可導(dǎo)致癲癇、慢性神經(jīng)功能障礙甚至出血死亡，具有很大的危害性。CAVM是進(jìn)行性血管生成和重塑的結(jié)果。臨床上發(fā)現(xiàn)CAVM可隨患者年齡增長(zhǎng)而增加，提示CAVM的形成與生長(zhǎng)可能與血管異常增生和血管新生有關(guān)。血管新生包含4個(gè)關(guān)鍵環(huán)節(jié)：酶類(lèi)降解破壞細(xì)胞外基質(zhì)；血管內(nèi)皮細(xì)胞趨化和遷移；血管內(nèi)皮細(xì)胞分裂增殖；血管內(nèi)皮細(xì)胞和外周細(xì)胞相互作用[10-11]。由此可見(jiàn)，血管內(nèi)皮細(xì)胞在血管新生過(guò)程中起著關(guān)鍵作用。在腦血管疾病中常見(jiàn)多種細(xì)胞因子參與對(duì)血管內(nèi)皮細(xì)胞的調(diào)節(jié)，如VEGF、胰島素樣生長(zhǎng)因子(IGF)、轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子(TGF-β)和腫瘤抑制因子-α(TNF-α)等[12]。其中VEGF對(duì)血管內(nèi)皮細(xì)胞特異性高，能夠與內(nèi)皮細(xì)胞的VEGF-R1、VEGF-R2和VEGF-R3受體結(jié)合，使得微小靜脈的通透性增加，并促進(jìn)血管內(nèi)皮細(xì)胞分裂、增殖以及誘導(dǎo)血管新生，在血管生成的過(guò)程中起關(guān)鍵作用[13]。在胚胎發(fā)育過(guò)程中存在VEGF的廣泛表達(dá)，對(duì)胎兒腦血管的形成和發(fā)育起重要作用；正常成年人體內(nèi)VEGF表達(dá)極低，但在腫瘤和糖尿病視網(wǎng)膜病變等某些病理情況下，VEGF的合成分泌會(huì)顯著增加[14]。有學(xué)者[15]研究發(fā)現(xiàn)，VEGF在CAVM患者腦組織內(nèi)表達(dá)上調(diào)且伴有新生血管形成，提示腦組織內(nèi)VEGF過(guò)表達(dá)可能是誘導(dǎo)CAVM發(fā)病的原因。

該研究通過(guò)檢測(cè)對(duì)比CAVM病變血管、病變周?chē)芎驼ＤX血管中VEGF蛋白和mRNA的表達(dá)，探索CAVM發(fā)病與腦血管內(nèi)VEGF表達(dá)之間的關(guān)系。免疫組化和Western blot結(jié)果顯示，CAVM病變血管和病變周?chē)軆?nèi)皮細(xì)胞VEGF蛋白表達(dá)均顯著高于正常腦血管；熒光定量RCR結(jié)果顯示，CAVM病變血管和病變周?chē)軆?nèi)皮細(xì)胞VEGF mRNA的水平明顯高于正常腦血管；同時(shí)該研究發(fā)現(xiàn)CAVM病變血管中VEGF蛋白和mRNA表達(dá)均高于病變周?chē)?。研究結(jié)果提示CAVM的發(fā)生發(fā)展可能與腦血管VEGF的表達(dá)水平關(guān)系密切。

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*中國(guó)衛(wèi)計(jì)委2013中央補(bǔ)助地方煙草監(jiān)測(cè)項(xiàng)目；世界衛(wèi)生組織項(xiàng)目WPDHP 1408674

Histological changes and expression of VEGF in cerebral arteriovenous malformation vascular tissue

TIANTian1),SUNYafei2),YUMiao1),ZHANGJiwei1),HUTiemin1),WANGWeixing1),WANGGuang1)

1)DepartmentofNeurosurgery,theAffiliatedHospital,ChengdeMedicalCollege,Chengde067000

2)DepartmentofInternalMedicine,theSecondHospital,HebeiMedicalUniversity,Shijiazhuang050000

Key wordscerebral arteriovenous malformation;histological change;vascular endothelial growth factor

doi：10.13705/j.issn.1671-6825.2015.06.026

中圖分類(lèi)號(hào)R743.4

通信作者#，男，1968年9月生，碩士，副主任醫(yī)師，研究方向：腦血管病，E-mail：wangguang@168.com