人工干預對反復種植失敗患者著床窗口期子宮內(nèi)膜組織中LPAR3和HOXA-11表達的影響*

趙　華，王興玲，李　麗， 李豫峰#

1)華中科技大學附屬同濟醫(yī)院生殖中心 武漢 430000　2)鄭州大學第三附屬醫(yī)院生殖中心 鄭州 450052

?

人工干預對反復種植失敗患者著床窗口期子宮內(nèi)膜組織中LPAR3和HOXA-11表達的影響*

趙華1)，王興玲2)，李麗2)， 李豫峰1)#

1)華中科技大學附屬同濟醫(yī)院生殖中心 武漢 4300002)鄭州大學第三附屬醫(yī)院生殖中心 鄭州 450052

關鍵詞子宮內(nèi)膜容受性；子宮內(nèi)膜搔刮術；同源框基因11；溶血磷脂酸受體3；調(diào)經(jīng)促孕丸；反復種植失敗

摘要目的：探討對反復種植失敗(RIF)患者進行人工干預后，著床窗口期子宮內(nèi)膜組織中溶血磷脂酸受體3(LPAR3)和同源框基因11(HOXA-11)表達變化對臨床結局的影響。方法：將92例因輸卵管因素不孕的RIF患者分為搔刮組(子宮內(nèi)膜搔刮,n=31)、中成藥組(調(diào)經(jīng)促孕丸，n=31)、未干預組(n=30)。采用RT-PCR和Western blot方法檢測3組患者窗口期子宮內(nèi)膜組織中LPAR3和HOXA-11 mRNA和蛋白表達的情況，并觀察3組患者臨床妊娠率的差異。結果：搔刮組、中成藥組患者窗口期子宮內(nèi)膜組織中LPAR3和HOXA-11 mRNA及蛋白表達量高于未干預組，差異有統(tǒng)計學意義(F=57.463和60.771，P<0.001；F=48.816和40.313，P<0.001)，而前兩組比較差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。搔刮組、中成藥組復蘇周期臨床妊娠率分別是48.4%和32.3%，均高于未干預組(16.7%)，差異有統(tǒng)計學意義(χ2=6.908，P=0.032)，但前兩組比較差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。結論：子宮內(nèi)膜搔刮術和口服調(diào)經(jīng)促孕丸2種干預措施均可以改善子宮內(nèi)膜容受性，提高RIF患者的臨床妊娠率。

AbstractAim: To investigate the expressions and significance of LPAR3 and HOXA-11 in the mRNA and protein level at the endometrial implantation phase after the manual intervention in the patients with repeated implantation failure(RIF).Methods: According to the RIF patients′ willingness of receiving manual intervention and the different intervention methods, the 92 RIF patients with fallopian tube-related infertility were allocated into scratching group (n=31), Chinese patent medicine group (n=31) and non-intervention group (n=30).RT-PCR and Western blot were adopted to detect the expressions of LPAR3 and HOXA-11 mRNA and protein at the endometrial implantation phase after the ovulation of the RIF patients. Results: The results of RT-PCR and Western blot showed that the expressions of LPAR3 and HOXA-11 mRNA and protein in the scratching group and Chinese patent medicine group at the implantation window phase noticeably higher than those in the non-intervention group(F=57.463 and 60.771，P<0.001；F=48.816 and 40.313，P<0.001),however, there was no statistical difference between the former two groups. The clinical pregnancy rate(48.4%) in the scratching group and Chinese patent medicine group(32.3%) was higher than that in the non-intervention group(16.7%)(χ2=6.908, P<0.032),however, the comparison of the former 2 groups revealed no statistical difference (P>0.05).Conclusion: Two intervention measures, including the endometrial scratching and taking progestational pills, could improve the endometrial receptivity and enhance the clinical pregnancy rate of the RIF patients.

近年來，隨著輔助生殖技術水平的迅猛發(fā)展，胚胎的數(shù)量及質(zhì)量都得以優(yōu)化，但胚胎的植入率卻未得到明顯的提高。目前多數(shù)學者[1-2]把胚胎移植次數(shù)≥3次，或者優(yōu)質(zhì)胚胎移植數(shù)≥10個仍然未能達到臨床妊娠，視為胚胎反復種植失敗(repeated implantation failure，RIF)。此類患者排除其胚胎質(zhì)量問題外，沒有其他明確的不孕因素，因此子宮內(nèi)膜接受胚胎著床的能力下降可能是RIF的原因。如何預測并改善RIF患者子宮內(nèi)膜容受性，從而提高再次助孕時的臨床妊娠率，已成為輔助生殖技術領域研究的熱點與難點。該課題組選擇2個已經(jīng)公認的影響子宮內(nèi)膜容受性的因子——溶血磷脂酸受體3(lysophosphatidic acid receptor 3，LPAR3)和同源框基因-11(hemeobox genes-11，HOXA-11)作為觀察指標，對RIF患者進行不同的臨床干預后，采用RT-PCR及Western blot方法檢測不同干預措施處理后2個因子在子宮內(nèi)膜表達的差異及臨床妊娠結局，分析不同干預措施對臨床結局影響的可能機制，從而指導臨床選擇有效的干預方法，提高輔助生殖技術的臨床妊娠率。

1對象與方法

1.1研究對象選擇2013年9月至2014年1月在華中科技大學附屬同濟醫(yī)院生殖中心因輸卵管因素不孕行體外受精-胚胎移植(in vitro fertilization and embryo transfer，IVF-ET)助孕治療的患者92例，患者均采用標準長方案促排卵后有≥8枚優(yōu)質(zhì)胚胎[根據(jù)卵裂球對稱性和碎片的多少將卵裂期胚胎分為1級胚胎(胚胎卵裂球大小均勻，胞質(zhì)碎片≤5%)和2級胚胎(胚胎卵裂球均勻或稍不均勻，5%<胞質(zhì)碎片≤20%)，1級和2級胚胎均視為可移植的優(yōu)質(zhì)胚胎]，分別經(jīng)過3次胚胎移植(<35歲移植2枚胚胎，≥35歲移植3枚胚胎)一直未孕，且至少還有2枚D3冷凍優(yōu)質(zhì)胚胎(凍胚)?；颊哌€滿足如下納入標準：年齡<40歲；行優(yōu)質(zhì)胚胎移植≥3次，或移植多次優(yōu)質(zhì)胚胎累計≥10枚；近兩個月內(nèi)無宮腔操作史，B超檢測子宮內(nèi)膜無異?；芈?；非子宮內(nèi)膜異位癥患者；輸卵管無積水；夫妻雙方染色體正常，無活動期傳染??；3個月內(nèi)無口服激素類藥物史。按行IVF-ET助孕干預措施的不同把RIF患者分為搔刮組(n=31)、中成藥組(n=31)和未干預組(n=30)。2種干預措施及黃體期內(nèi)膜的獲取均在凍胚復蘇移植周期的前1或2個月經(jīng)周期進行。該研究經(jīng)醫(yī)院倫理委員會討論通過，充分尊重患者的醫(yī)療知情權和自主選擇權，在對患者行子宮內(nèi)膜取材時，患者知情同意，并簽署知情同意書。

1.2干預措施①子宮內(nèi)膜搔刮術：在凍胚移植前1個月經(jīng)周期月經(jīng)來潮6 h內(nèi)對患者進行子宮內(nèi)膜搔刮，用小號刮匙送到宮腔底部，輕柔、表淺并且均勻地搔刮子宮腔四壁內(nèi)膜。②口服中成藥(調(diào)經(jīng)促孕丸，審批號：211020027)：患者于月經(jīng)周期第5天起口服調(diào)經(jīng)促孕丸，早晚各1次，1丸/次(5 g/丸)，連服20 d(1個療程)，共用2個療程。

1.3子宮內(nèi)膜的獲取納入該研究的所有患者均于凍胚移植前1個月經(jīng)周期第10天監(jiān)測排卵，排卵異常的患者采用促排卵的方法，兩者均于排卵后第5~7天，通過抽拉一次性子宮內(nèi)膜取樣器Pipelle (江蘇“蘇云”醫(yī)療器械公司)的管芯吸取內(nèi)膜組織，把吸出的少量內(nèi)膜組織分成2份，分別放入一次性無菌試管中，封口并做標記,于-80 ℃液氮罐中保存。

1.4血清激素的測定月經(jīng)周期的第2~4天及取子宮內(nèi)膜的當天早晨，抽取患者空腹外周靜脈血3 mL，采用化學發(fā)光法檢測者血清激素水平。

1.5凍胚移植選擇細胞數(shù)≥6的1級和2級胚胎D3天凍胚進行復蘇移植。無論患者排卵是否正常、月經(jīng)是否規(guī)律均采用人工周期建內(nèi)膜進行凍胚解凍復蘇后移植。自月經(jīng)周期第3天開始，口服戊酸雌二醇2～4 mg/d，每7 d 1次采用B超監(jiān)測內(nèi)膜厚度的變化；根據(jù)內(nèi)膜厚度，戊酸雌二醇用量可增至6～8 mg/d；當內(nèi)膜厚度≥8 mm時，肌內(nèi)注射黃體酮60 mg/d(20 mg/支，浙江仙琚制藥公司)進行內(nèi)膜轉化，注射黃體酮后第3天行胚胎移植。移植日開始口服達芙通(荷蘭蘇威制藥公司)20 mg/d進行黃體支持。胚胎移植后14～16 d抽取患者靜脈血檢測β-HCG水平，確定是否妊娠，于移植后第30～35天行陰道超聲檢查，確定是否臨床妊娠及著床孕囊數(shù)。

1.63組患者子宮內(nèi)膜組織中LPAR3和HOXA-11 mRNA表達的RT-PCR檢測用Trizol液提取子宮內(nèi)膜組織中的總RNA，反轉錄成cDNA。以β-actin為內(nèi)參，取2 μL模板 cDNA 進行 PCR 擴增。引物序列及大小見表1。PCR反應體系：反轉錄產(chǎn)物2 μL，上、下游引物各2 μL，Easy Taq Buffer 5 μL，Easy Tap DNA 聚合酶 0.5 μL，dNTPs 4 μL，最后加超純水至反應體系總體積50 μL。PCR擴增條件：94 ℃預變性2 min；94 ℃變性30 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸2 min，共35個循環(huán)；72 ℃總延伸2 min。

表1　引物序列及大小

1.73組患者子宮內(nèi)膜組織中LPAR3和HOXA-11 蛋白表達的Western blot檢測將解凍的20 mg內(nèi)膜組織加入100~200 μL的裂解液直至充分裂解，14 000g離心5 min取上清。制膠跑電泳。將轉膜的硝酸纖維素膜放入封閉液中，37 ℃恒溫床上低速搖動封閉2 h。把一抗按11 000稀釋，4 ℃孵育過夜，按14 000稀釋二抗后覆膜37 ℃孵育45 min。最后將硝酸纖維素膜放入化學發(fā)光試劑中反應2 min，室溫晾干用于拍照，用Bandscan 5.0軟件進行灰度值分析。

1.8其他觀察指標比較3組患者的年齡、體重指數(shù)(body mass index，BMI)、不孕年限、新鮮周期基礎狀態(tài)(月經(jīng)周期2~4 d)血清促卵泡激素(follicle-stimulating hormone，F(xiàn)SH)、黃體生成素(luteinizing hormone，LH)、促性腺激素(gonadotropin，Gn)天數(shù)、獲卵數(shù)、復蘇周期著床期(排卵后5~7 d)血清雌二醇(E2)、黃體酮(P)水平、胚胎移植數(shù)、移植日內(nèi)膜厚度、妊娠率的差異。臨床妊娠：B超可探及宮內(nèi)孕囊、胎芽及心管搏動；臨床妊娠率：臨床妊娠周期數(shù)/移植周期數(shù)×100%。

1.9統(tǒng)計學處理采用SPSS 17.0進行分析，應用單因素方差分析和LSD-t檢驗比較3組患者新鮮周期基礎情況、復蘇周期基礎情況、窗口期子宮內(nèi)膜組織中LPAR3、HOXA-11 mRNA和蛋白表達的差異，檢驗水準α=0.05。

2結果

2.13組患者新鮮周期基礎情況的比較見表2。

表2　3組患者新鮮周期基礎情況的比較

2.23組患者復蘇周期基礎情況的比較見表3。

表3　3組患者復蘇周期基礎情況的比較

2.33組患者窗口期子宮內(nèi)膜組織中LPAR3、HOXA-11 mRNA和蛋白表達的比較見表4、圖1和2。

表4　3組患者窗口期子宮內(nèi)膜組織中LPAR3、HOXA-11 mRNA和蛋白表達的比較

*：與搔刮組比較，P<0.05；#：與中成藥組比較，P<0.05。

圖1　3組患者窗口期子宮內(nèi)膜組織中LPAR3、HOXA-11 mRNA表達的比較

圖2　3組患者窗口期子宮內(nèi)膜組織中LPAR3、HOXA-11蛋白表達的比較

3討論

3.1LPAR3和HOXA-11在子宮內(nèi)膜胚胎著床過程中的作用LPAR3是一種脂類小分子，在雌性嚙齒類動物生殖系統(tǒng)中具有多種功能，參與受精卵在子宮內(nèi)的移行及胚胎植入子宮內(nèi)膜的過程[1]；近年來研究[2]發(fā)現(xiàn)LPAR3基因敲除小鼠子宮內(nèi)膜LPAR3 mRNA及其蛋白的表達與受精卵著床時間一致，并與子宮內(nèi)膜著床期標志物胞飲突共同表達且同步消失，因此LPAR3可以作為小鼠內(nèi)膜容受性的標志物。

HOXA-11是一類多基因家族的轉錄調(diào)節(jié)因子，Rackow等[3]發(fā)現(xiàn)不孕癥患者HOXA-11基因表達發(fā)生改變，從而導致胚胎著床率下降。還有學者[4-5]研究發(fā)現(xiàn)HOXA-11基因缺失的小鼠子宮體積縮小、內(nèi)膜變薄、腺體減少、內(nèi)膜血管直徑變小從而血流量減少，這表明HOXA-11基因的缺失或表達量的下降會導致子宮內(nèi)膜發(fā)育障礙，從而導致胚泡著床率下降。

3.2子宮內(nèi)膜搔刮術對子宮內(nèi)膜容受性的影響子宮內(nèi)膜搔刮術是一種機械局部刺激手段，臨床研究[6]發(fā)現(xiàn)在月經(jīng)的早期輕刮子宮內(nèi)膜各壁，可以改善RIF患者子宮內(nèi)膜容受性，提高胚胎的植入率、臨床妊娠率和活產(chǎn)率，但其作用機制還不完全清楚，可能與促使子宮內(nèi)膜發(fā)生蛻膜樣改變，有益于子宮內(nèi)膜和胚胎種植之間的同步性，誘導著床窗口期的子宮內(nèi)膜分泌多種有益于胚胎著床的細胞因子有關，其因子包括常見的白血病抑制因子、白細胞介素11等[7]，同時內(nèi)膜搔刮可以去除內(nèi)膜局灶性病變，如息肉、增生等病理改變。Raziel等[8]納入120例行卵胞漿內(nèi)單精子顯微注射技術助孕的RIF患者進行子宮內(nèi)膜搔刮術，其臨床妊娠率有明顯的提高。作者的研究顯示，內(nèi)膜搔刮組LPAR3、HOXA-11 mRNA及其蛋白在著床窗口期子宮內(nèi)膜的表達量明顯高于未干預組。RIF患者經(jīng)過搔刮內(nèi)膜干預后，其臨床妊娠率與未干預組患者比較明顯提高；兩干預組相比較，內(nèi)膜搔刮組臨床妊娠率也高于中成藥組。作者的實驗結果顯示，內(nèi)膜搔刮有益于提高RIF患者的臨床妊娠率；對行子宮內(nèi)膜搔刮術的患者術后給予抗生素、止血劑，并在搔刮后第3天叮囑患者行超聲復查，因此內(nèi)膜搔刮不會引起子宮內(nèi)膜進一步的損傷，反而會增加內(nèi)膜對胚胎的接受能力。

3.3中成藥對子宮內(nèi)膜容受性的影響中醫(yī)學認為腎精、氣血和沖任直接參與胚胎著床的過程。張敏等[9]認為根據(jù)患者的不同情況合理對癥地應用中藥，不僅可以促進不孕患者排卵，同時改善子宮內(nèi)膜容受性，提高妊娠率。中藥方主要以補腎益氣、調(diào)理氣血等特性治療不孕癥，收到了良好的臨床效果。該研究選取調(diào)經(jīng)促孕丸對RIF患者進行干預性治療，該中成藥由續(xù)斷、鹿茸(去毛)等18味中草藥組成，諸藥配合，共奏補腎健脾、養(yǎng)血調(diào)經(jīng)之功，改善患者子宮內(nèi)膜下血流及內(nèi)膜微環(huán)境，從而達到提高子宮內(nèi)膜容受性的目的。該研究結果顯示，中成藥組LPAR3、HOXA-11 mRNA和蛋白在著床窗口期子宮內(nèi)膜的表達量明顯高于未干預組，低于內(nèi)膜搔刮組。中成藥組臨床妊娠率明顯高于未干預組，低于搔刮組；結果表明調(diào)經(jīng)促孕丸可以改善RIF患者的臨床結局。黃青蘭[10]應用調(diào)經(jīng)促孕丸治療278例不孕患者取得滿意的療效，作者的研究結果與之相符。

總之，內(nèi)膜搔刮術在RIF患者的臨床治療中具有較好療效，而口服中成藥調(diào)經(jīng)促孕丸是一種安全、有效、副作用小、能改善內(nèi)膜微環(huán)境的干預措施。但該研究樣本量較小，尚需擴大臨床樣本量，進一步明確內(nèi)膜搔刮術、口服中成藥提高內(nèi)膜容受性的作用機制，從而為其大規(guī)模的臨床應用提供理論依據(jù)。

參考文獻

[1]Ye X,Herr DR,Diao H,et al.Unique uterine localization and regulation may differentiate LPA3 from other lysophospholipid receptors for its role in embryo implantation[J].Fertil Steril,2011,95(6):2107

[2]Sordelli MS,Beltrame JS,Cella M,et al.Interaction between lysophosphatidic acid, prostaglandins and the endocannabinoid system during the window of implantation in the rat uterus[J].PLoS One,2012,7(9):e46059

[3]Rackow BW,Jorgensen E,Taylor HS.Endometrial polyps affect uterine receptivity[J].Fertil Steril,2011,95(8):2690

[4]Alizadeh Z,Faramarzi S,Saidijam M,et al.Effect of intramural myomectomy on endometrial HOXA10 and HOXA-11 mRNA expression at the time of implantation window[J].Iran J Reprod Med, 2013,11(12):983

[5]Varlakhanova N,Cotterman R,Bradnam K,et al.Myc and Miz-1 have coordinate genomic functions including targeting Hox genes in human embryonic stem cells[J].Epigenetics Chromatin,2011,4(4):20

[6]Wise J.Endometrial scratching improves IVF pregnancy rate[J].BMJ,2013,347(1):f6007

[7]Kalma Y,Granot I,Gnainsky Y,et al.Endometrial biopsy-induced gene modulation: first evidence for the expression of bladder-transmembranal uroplakin Ib in human endometrium[J].Fertil Steril,2009,91(4):1042

[8]Raziel A,Schachter M,Strassburger D,et al.Favorable influence of local injury to the endometrium in intracytoplasmic sperm injection patients with high-order implantation failure[J].Fertil Steril,2007,87(1):198

[9]張敏,齊聰,張勤華.溫腎活血湯聯(lián)合克羅米芬改善促排卵子宮內(nèi)膜容受性療效研究[J].生殖與避孕,2010,30(9):601

[10]黃青蘭.調(diào)經(jīng)促孕丸治療不孕癥278例療效觀察[J].中國醫(yī)藥指南,2011,9(16):325

*國家自然科學基金資助項目81273712

Influence of manual intervention on LPAR3 and HOXA-11 expressions at the endometrial implantation period in RIF patients

ZHAOHua1)，WANGXingling2)，LILi2)，LIYufeng1)

1)TheReproductionCenter,TongjiHospital,HuazhongUniversityofScienceandTechnology,Wuhan4300002)TheReproductionCenter,theThirdAffiliatedHospital,ZhengzhouUniversity,Zhengzhou450052

Key wordsuterine endometrial receptivity;uterine endometrial scratching;HOXA-11;LPAR3;progestational pill;repeated implantation failure

doi：10.13705/j.issn.1671-6825.2015.06.022

中圖分類號R711

通信作者#，男，1964年6月生，博士，主任醫(yī)師，研究方向：生殖醫(yī)學， E-mail:Yufengli64@tjh.tjmu.edu.cn