先天性長QT綜合征2型hERG基因G604S突變真核表達載體的構(gòu)建和表達*

韓穩(wěn)琦，霍建華，李國良，蔣永榮，武金娥，孫超峰

西安交通大學第一附屬醫(yī)院心內(nèi)科 西安 710061

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先天性長QT綜合征2型hERG基因G604S突變真核表達載體的構(gòu)建和表達*

韓穩(wěn)琦，霍建華，李國良，蔣永榮，武金娥，孫超峰#

西安交通大學第一附屬醫(yī)院心內(nèi)科 西安 710061

關(guān)鍵詞先天性長QT綜合征;hERG基因;突變;真核表達載體

摘要目的：構(gòu)建長QT綜合征(LQTS)2型hERG 基因G604S突變的真核表達載體G604S-hERG-pcDNA3、G604S-hERG-pEGFP。方法：采用重疊延伸PCR法在pEGM-hERG基礎(chǔ)上構(gòu)建G604S突變體PGEM-hERG-G604S，通過限制性內(nèi)切酶法和基因重組技術(shù)將突變體插入到真核表達載體pcDNA3和pEGFP-C2中并測序驗證，用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染法將G604S-hERG-pEGFP轉(zhuǎn)染至HEK293細胞并觀察其熒光表達。結(jié)果：構(gòu)建的含有突變位點的真核表達載體經(jīng)DNA測序均成功驗證hERG基因1 810位點堿基G突變?yōu)锳，構(gòu)建的G604S-hERG-pEGFP在HEK293細胞中成功表達綠色熒光。結(jié)論：成功構(gòu)建hERG基因G604S-hERG-pcDNA3和G604S-hERG-pEGFP表達載體。

AbstractAim: To construct eukaryotic expression vectors G604S-hERG-pcDNA3 and G604S-hERG-pEGFP linked to LQT2.Methods: PGEM-hERG-G604S containing G604S fragment was constructed using pEGM-hERG as a template by overlap extension PCR and then validated by DNA sequencing, then hERG-G604S sequence was subcloned into pcDNA3 and pEGFP-C2 vectors using restriction enzymes and gene recombination technology, respectively. After sequencing, G604S-hERG-pcDNA3 and G604S-hERG-pEGFP expression vectors were transfected into HEK293 cells to obtain heterologous expression system.Results: G604S-hERG-pcDNA3 and G604S-hERG-pEGFP eukaryotic expression vectors were constructed successfully， a missense mutation in hERG 1 810 site nucleotide G mutant to A was identified using DNA sequencing，hERG mutant was correctly combined to eukaryotic expression vector pEGFP-C2 and expressing green fluorescent protein confusion mutant G604S in HEK293 cells.Conclusion: The protocol can be used to construct the eukaryotic expression vector G604S-hERG-pcDNA3 and green fluorescent protein expression vector G604S-hERG-pEGFP.

先天性長QT綜合征(congenital long QT syndromes,cLQTS)為一種心肌離子通道病，是由于編碼心肌離子通道蛋白的基因突變導致心肌細胞復極時間延長而觸發(fā)的一組臨床綜合征。LQTS表現(xiàn)為心電圖上T波異常，易發(fā)生尖端扭轉(zhuǎn)型室性心動過速(torsades de pointes,TdP)，從而導致暈厥和猝死等心血管惡性事件[1-2]。目前已證實12種基因與LQTS相關(guān)，hERG基因突變是引起中國人LQTS的最主要原因[1]。hERG基因定位于人類染色體7q35~36，編碼1 159個氨基酸殘基[3]，參與形成完整的緩慢激活延遲整流鉀電流快成分(Ikr)通道[4]。Ikr通道在心室肌細胞復極、維持心臟動作電位時程(APD)和調(diào)節(jié)心臟正常節(jié)律過程中發(fā)揮重要作用[5]。hERG突變使蛋白表達異常，Ikr通道功能降低或喪失，從而使動作電位時程延長，導致2型LQTS(LQT2)。作者所在的實驗室在LQTS一家系中發(fā)現(xiàn)hERG基因第七外顯子處1 810G→A突變，導致蛋白604位甘氨酸(G)→絲氨酸(S)的改變，即G604S突變[6]，進而導致LQT2表型。該研究通過構(gòu)建G604S-hERG-pcDNA3和G604S-hERG-pEGFP真核表達載體，以期闡明此突變的分子生物學特征及為該病的個體化治療研究提供實驗基礎(chǔ)。

1材料與方法

1.1主要試劑與儀器質(zhì)粒pEGM-hERG由BD Anson 博士(University of Wisconsin,USA)惠贈，質(zhì)粒pMD19-T、限制性內(nèi)切酶BstE Ⅱ和sdaⅠ、DNA連接酶均購于TaKaRa公司，pEGFP-C2購于Clontech公司，感受態(tài)細菌TOP10購自Promega公司，HEK293細胞取自西安交通大學環(huán)境與疾病教育部重點實驗室。DNA片段回收試劑盒購自Qiagen公司，DMEM培養(yǎng)基購自Gibco公司，DNA ladder購自Fermentas公司，X-treme GENE HP DNA轉(zhuǎn)染試劑、質(zhì)粒提取試劑盒、SYBR Green Master(ROX)購自Roche公司。引物合成及測序由北京奧科生物技術(shù)有限責任公司完成。PTC-200DNA擴增儀為美國MJ公司產(chǎn)品，2000型凝膠成像系統(tǒng)為美國Biotech公司產(chǎn)品。

1.2hERG-G604S突變體的構(gòu)建 應(yīng)用重疊延伸PCR法制備hERG-G604S突變體。設(shè)計G604S突變體引物：①兩條hERG基因外側(cè)端引物，上游序列5’-GCCACGCCAGCACCGGGGCCATGC-3’和下游序列5’-GTGTGGTCTTGAACTTCATGGCCAGGGC-3’。②G604S突變的鄰近引物，上游序列5’-CCT GGGCAGCCCCTCCATCAAGGACAAG-3’，下游序列5’-CTTGTCCTTGATGGAGGGGCTGCCCAGG-3’。共進行三步PCR反應(yīng)，其中前兩步分別擴增彼此重疊的DNA片段，片段大小分別為922 bp和486 bp；PCR 反應(yīng)體系：緩沖液 10 μL，模板 2 μL，正向引物 1 μL，反向引物 1 μL，dNTP Mix 4 μL，STAR DNA 聚合酶 0.5 μL，調(diào)整總體積為50 μL。第三步PCR連接5’端和3’端DNA片段，并擴增出突變片段，片段長度為1 408 bp；反應(yīng)條件：98 ℃ 2 min，98 ℃ 10 s，66 ℃ 20 s，72 ℃ 30 s；5個循環(huán)后在反應(yīng)體系中分別加入1 μL的引物再進行25個循環(huán)，反應(yīng)條件：98 ℃，2 min，98 ℃，10 s，66 ℃ 30 s，72 ℃ 90 s，72 ℃ 10 min，4 ℃ 30 min。將突變片段3’末端加A尾后連接到pMD19-T上，反應(yīng)條件：PCR產(chǎn)物15 μL，加 A 反應(yīng)液4 μL，Taq 酶1 μL，72 ℃保溫30 min。產(chǎn)物經(jīng)轉(zhuǎn)化擴增后提質(zhì)粒(pMD19-hERG-G604S)并行DNA測序。

1.3真核表達載體G604S-hERG-pcDNA3的構(gòu)建

利用雙酶切法將hERG-G604S突變體經(jīng)基因重組技術(shù)插入具有氨芐青霉素抗性的表達載體pcDNA3-hERG中，利用氨芐青霉素抗性對重組子進行篩選，挑取單克隆菌種擴增后提取質(zhì)粒并測序。使用DNAMAN軟件，選用突變兩端單一的BstE Ⅱ和sdaⅠ限制性內(nèi)切酶對pMD19-hERG-G604S及pcDNA3-hERG同時進行酶切，產(chǎn)物進行瓊脂糖電泳檢測，于紫外線下切取前者的小片段(約1 056 bp)和后者的大片段部分(約8 244 bp)，依回收試劑盒步驟回收產(chǎn)物后，利用T4 DNA聚合酶將兩者進行連接，構(gòu)建G604S-hERG-pcDNA3。經(jīng)轉(zhuǎn)化擴增后提取質(zhì)粒并測序。

1.4綠色熒光表達載體G604S-hERG-pEGFP的構(gòu)建利用雙酶切法(EcoRⅠ和HindⅢ)切取G604S-hERG-pcDNA3中突變?nèi)康膆ERG片段并插入具有Kana抗性的表達載體pEGFP-C2中，利用Kana抗性對重組子進行篩選，挑取單克隆菌種擴增后提取質(zhì)粒并測序。選用EcoRⅠ和HindⅢ限制性內(nèi)切酶對pMD19-hERG-G604S及pEGFP-C2同時進行酶切,紫外線下切取G604S-hERG-pcDNA3的小片段(約3 480 bp)，pEGFP-C2在4 000 bp和5 000 bp之間顯示一條帶，依回收試劑盒步驟回收產(chǎn)物后利用T4 DNA聚合酶將兩者進行連接，構(gòu)建成G604S-hERG-pEGFP。經(jīng)轉(zhuǎn)化擴增后提取質(zhì)粒并測序。

1.5HEK293細胞的培養(yǎng)及轉(zhuǎn)染HEK293細胞用含體積分數(shù)10%胎牛血清的DMEM高糖培養(yǎng)基于6孔培養(yǎng)皿中培養(yǎng)，12 h后當細胞貼壁生長至70%~85%時，進行脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染，轉(zhuǎn)染混合物配比:G604S-hERG-pEGFP 4 μg，X-tremeGENE HP轉(zhuǎn)染劑8 μL，轉(zhuǎn)染24 h后活體細胞熒光顯微鏡下進行檢測。

2結(jié)果

2.1G604S突變體的構(gòu)建 第一步PCR產(chǎn)物電泳結(jié)果見圖1上，可以觀察到900 bp附近有一條很亮的條帶，與所擴增的片段大小相符；第二步PCR產(chǎn)物電泳結(jié)果見圖1中，可以觀察到500 bp附近有一條很亮的條帶，與所擴增的片段大小相符；第三步PCR產(chǎn)物電泳結(jié)果見圖1下，可見1 200 bp和2 000 bp之間有一條很亮的條帶，與連接的上下游片段全長大小相符，表明是第三步重疊PCR的產(chǎn)物。DNA測序(圖2)顯示hERG基因1 810處的堿基G變?yōu)锳，而其他序列均無改變，表明突變成功。

圖1　hERG-G604S PCR產(chǎn)物電泳圖

M:Marker;1:目的基因;上、中、下：分別為第一、二、三步PCR產(chǎn)物。

圖2　PCR產(chǎn)物測序圖

2.2G604S-hERG-pcDNA3的構(gòu)建pMD19-hERG-G604S的限制性內(nèi)切酶電泳結(jié)果見圖3上，為含突變點的DNA片段(大小為1 056 bp)。pcDNA3-hERG的酶切電泳結(jié)果見圖3下，為大小8 244 bp的目的片段。DNA連結(jié)后的測序結(jié)果(圖4)表明G604S-hERG-pcDNA3的hERG基因1 810處的堿基G突變?yōu)锳，而無其他序列的改變，表明G604S-hERG-pcDNA3構(gòu)建成功。

圖3　雙酶切電泳圖

1：目的基因；M：Marker；上：pMD19-hERG-G604S；下：pcDNA3-hERG。

圖4　真核表達載體測序圖

2.3G604S-hERG-pEGFP的構(gòu)建pEGFP-C2和G604S-hERG-pcDNA3的酶切電泳結(jié)果見圖5。pEGFP-C2產(chǎn)物大小在4 000 bp和5 000 bp之間；pcDNA3-hERG被切成兩條帶，表明酶切成功。連結(jié)后的DNA測序結(jié)果表明在G604S-hERG-pEGFP上存在突變(圖6)，轉(zhuǎn)染HEK293細胞可見明顯綠色熒光(圖7)，表明綠色熒光表達載體G604S-hERG-pEGFP構(gòu)建成功。

圖5　pEGFP-C2和G604S-hERG-pcDNA3的雙酶切電泳圖

M:Marker;1:pEGFP-C2雙酶切；2：G604S-hERG-pEGFP雙酶切。

圖6　G604S-hERG-pEGFP測序圖

圖7　G604S-hERG-pEGFP轉(zhuǎn)染HEK293(×10)

3討論

cLQTS發(fā)病突然，猝死率高。我國以LQT2型為主，占到總LQTS的近1/2，為編碼心臟離子通道的hERG基因發(fā)生突變，導致膜蛋白功能異常從而致動作電位復極時程延長而表現(xiàn)為暈厥或猝死的一種臨床綜合征[7]。近年來對該疾病基因型和表現(xiàn)型關(guān)系研究的突破性進展及分子細胞生物學技術(shù)的迅猛發(fā)展，使LQTS成為心臟離子通道研究領(lǐng)域的熱點。構(gòu)建突變基因表達載體是研究突變后離子通道功能及個體化治療研究的關(guān)鍵環(huán)節(jié)。

體外定點誘變技術(shù)是研究基因突變和蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)及功能之間復雜關(guān)系的重要方法，已廣泛應(yīng)用于基因的表達修飾和調(diào)控、結(jié)構(gòu)與功能及蛋白表達等諸多研究領(lǐng)域。重疊延伸PCR法構(gòu)建突變體目前應(yīng)用最為廣泛，因其不受突變位置及突變類型的限制，不僅能實現(xiàn)基因點突變，而且能實現(xiàn)大片段的插入及缺失突變。此方法最大優(yōu)點是構(gòu)建突變簡單易成。作者在該實驗中，首先通過重疊延伸PCR法構(gòu)建了含有G604S突變點的hERG基因片段，然后采用雙酶切法將突變片段和野生型hERG基因切成黏性末端，最后利用基因重組技術(shù)構(gòu)建G604S-hERG-pcDNA3真核表達載體，通過DNA測序比對證實真核表達載體構(gòu)建成功。

近年，基因突變相關(guān)研究中廣泛采用將目的基因插入到pEGFP基因表達載體中，構(gòu)建成表達綠色熒光融合蛋白的重組質(zhì)粒，在熒光顯微鏡下直觀目的蛋白的表達、轉(zhuǎn)運和定位的變化。綠色熒光融合蛋白(green fluorescent protein，GFP)是一種新型報告分子，是目前在細胞生物學研究和開發(fā)應(yīng)用中最廣泛的蛋白質(zhì)之一，其敏感性強、性質(zhì)穩(wěn)定，且容易檢測。增強型GFP(EGFP)是一種相對分子質(zhì)量較小并優(yōu)化的GFP，其內(nèi)源熒光基團在藍光激發(fā)時可高效發(fā)射明亮的綠色熒光，是普通GFP效率的30余倍，EGFP與外源蛋白N端或C端均可融合，且不影響目的蛋白的表達和轉(zhuǎn)運，便于觀察和檢測目的蛋白在活體細胞或組織中的表達、定位及細胞間的轉(zhuǎn)運[8]。Huang等[9]在LQT2的研究中也證實pEGFP對hERG的表達和定位均無影響。該研究利用雙酶切法和基因重組技術(shù)成功構(gòu)建了綠色熒光真核表達載體G604S-hERG-pEGFP，為后續(xù)hERG-G604突變基因功能檢測和分析提供了實驗工具。作者采用無內(nèi)源性Ikr通道蛋白表達的人胚胎腎祖細胞(HEK293細胞)[10]，結(jié)果顯示重組的真核表達載體成功轉(zhuǎn)染入HEK293細胞中，綠色熒光蛋白表達豐富，表明突變的目的基因和EGFP形成的融合蛋白在HEK293細胞中成功表達。

總之，此突變表達載體構(gòu)建的成功為進一步闡明hERG基因G604S突變導致LQTS發(fā)病機制及個體化藥物篩選拯救研究奠定了基礎(chǔ)。

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*國家自然科學基金資助項目31071923

Construction and expression of congenital LQT2 relating hERG gene G604S mutation eukaryotic expression vector

HANWenqi,HUOJianhua,LIGuoliang,JIANGYongrong,WUJin′e,SUNChaofeng

DepartmentofCardiovascularDiseases,theFirstAffiliatedHospital,Xi′anJiaotongUniversity，Xi′an710061

Key wordscongenital long QT syndrome;hERG gene;mutation;eukaryotic expression vector

doi：10.13705/j.issn.1671-6825.2015.06.007

中圖分類號R541

通信作者#，男，1966 年11 月生，博士，教授，研究方向：心臟起搏與電生理，E-mail:csun1@163.com