外泌體與鼻咽癌的研究進展*

鄢勤文 綜述，黃光武△，何本超 審校

(1.廣西醫(yī)科大學第一附屬醫(yī)院耳鼻咽喉頭頸外科,南寧 530021；2.湖北省天門市第一人民醫(yī)院/湖北科技學院附屬醫(yī)院耳鼻咽喉頭頸外科 431700)

·綜 述·

外泌體與鼻咽癌的研究進展*

鄢勤文1綜述，黃光武1△，何本超2審校

(1.廣西醫(yī)科大學第一附屬醫(yī)院耳鼻咽喉頭頸外科,南寧 530021；2.湖北省天門市第一人民醫(yī)院/湖北科技學院附屬醫(yī)院耳鼻咽喉頭頸外科 431700)

鼻咽腫瘤；皰疹病毒4型，人；外泌體

鼻咽癌(nasopharyngeal carcinoma,NPC)是我國南方高發(fā)的惡性腫瘤，嚴重危害人民的生命和健康。目前研究認為:遺傳易感性、EB病毒(Epstein-Barr virus，EBV)和環(huán)境因素是其主要病因。幾乎所有未分化和低分化鼻咽癌與EBV潛伏感染有關[1]。 EBV的潛伏感染和轉化細胞的能力被認為是鼻咽癌致癌的基礎，但是其作用機制有待進一步闡明。外泌體(Exosomes)是一種起源于細胞內(nèi)涵體的小囊泡，其直徑為40～100 nm，最初被認為是細胞的垃圾[2]。隨著研究的深入，外泌體與腫瘤的關系及在病毒感染和致病過程中的作用逐漸被發(fā)現(xiàn)和認識[3-4]。來源于EBV感染細胞的外泌體在EBV的潛伏感染和致病過程中可能扮演著很重要的作用。而鼻咽癌作為一種與EBV密切相關的腫瘤，其外泌體的研究可能對闡明鼻咽癌的致病機制具有較大價值。

1 外泌體的特點及與腫瘤的關系

自發(fā)現(xiàn)以來，外泌體的特性和功能逐漸被人們所發(fā)現(xiàn)和認識[5]。研究表明外泌體攜帶功能性蛋白、mRNA和miRNA到鄰近或遠處的靶細胞，調(diào)節(jié)其免疫功能，在血管生成，細胞增殖，腫瘤浸潤和細胞間的信息交流中起重要作用[6]。外泌體可以被細胞通過內(nèi)吞作用攝取，或識別細胞表面的特異性靶向細胞并與細胞的胞膜融合，同時釋放mRNA和miRNA等進入細胞質(zhì)[7]。

腫瘤細胞來源的外泌體可通過改變腫瘤的微環(huán)境，釋放自身攜帶的細胞因子等多種方式影響腫瘤的生長。外泌體主要從以下幾個方面影響腫瘤的生長：(1)抗腫瘤免疫及抑制免疫功能并介導腫瘤免疫逃逸[3]；(2)誘導腫瘤血管新生并促進腫瘤轉移[3]；(3)介導腫瘤細胞的化療抵抗[7]。目前，在多種腫瘤患者體液中發(fā)現(xiàn)了外泌體，并具有腫瘤標志物的特點[8]。腫瘤外泌體的臨床應用將為腫瘤的診斷和治療提供新的策略。

2 外泌體與鼻咽癌

2.1 EBV相關外泌體 EBV是雙鏈DNA病毒，屬γ皰疹病毒科，人類是EBV的惟一宿主。EBV在感染過程中，可產(chǎn)生大量病毒基因編碼產(chǎn)物，幫助病毒逃避宿主免疫攻擊，為病毒繁殖創(chuàng)造有利的微環(huán)境[9]。外泌體整合EBV編碼的RNA、miRNAs和蛋白等產(chǎn)物，作為細胞間的信使操縱感染的微環(huán)境并維持EBV的潛伏感染狀態(tài)[6]。 這里把這些整合有EBV編碼產(chǎn)物的外泌體統(tǒng)稱EBV相關外泌體。下面就其整合的產(chǎn)物分別做一介紹。

2.1.1 膜潛伏蛋白LMP1和LMP2A 2006年Keryer 等[10]首次在EBV感染的鼻咽癌細胞系外泌體中檢測到了LMP1。此外在鼻咽癌患者的血液和唾液里也發(fā)現(xiàn)了載有LMP1的外泌體[11-12]。2010年Meckes等[6]也在EBV感染的鼻咽癌細胞系外泌體中檢測到了豐富的LMP1，LMP1+外泌體與EBV陰性細胞共培養(yǎng)使其EGFR表達上調(diào)。EBV陰性細胞與LMP1+和EGFR+外泌體共培養(yǎng)時細胞內(nèi)吞這些囊泡并且引起 ERK和PI3K/AKT信號通路的激活[6]。 LMP2A也被發(fā)現(xiàn)存在于EBV外泌體中。Ikeda等[13]從EBV轉化的淋巴細胞系(LCLs)外泌體中檢測到了LMP2A。他們用破壞脂筏的藥物甲基-β-環(huán)(MCD)處理細胞膜出現(xiàn)膽固醇消耗，這能使細胞LMP2A的整體水平以及被外泌體整合的LMP2A水平增加。此外，還發(fā)現(xiàn)用MCD處理后細胞裂解液中LMP2A的磷酸化和泛素化作用明顯減少；但是對于外泌體中的LMP2A，只有磷酸化作用受到了抑制。這說明磷酸化作用在病毒蛋白和宿主蛋白被外泌體選擇性整合過程中可能有重要作用。

2.1.2 EBV感染裂解期蛋白 gp350 和dUTPase EBV gp350是EBV裂解性感染晚期表達的一種結構蛋白。Vallhov等[14]在來源于EBV轉化的LCLs的外泌體中檢測到了gp350，并且發(fā)現(xiàn)這些gp350+外泌體能黏附到未感染EBV的B細胞上。他們在體外證明了來源于LCLs的外泌體限制EBV感染。另一項研究發(fā)現(xiàn)gp350+外泌體，能被慢性淋巴細胞白血病細胞內(nèi)化，使EBV特異性CD4+T細胞激活，引起強烈的細胞毒性反應[15]。EBV編碼的脫氧尿苷焦磷酸酶(dUTPase)是新發(fā)現(xiàn)的EBV感染裂解期的早期蛋白。研究已經(jīng)表明，EBV編碼dUTPase在先天/適應性免疫方面具有不依賴于其酶活性的功能，部分原因在于它能夠通過刺激toll樣受體(TLR2)進而活化NF-κB,誘導炎癥相關細胞因子分泌[16]。進一步的研究表明EBV編碼的dUTPase顯著改變參與腫瘤發(fā)生、炎癥和病毒防御機制基因的表達，并且發(fā)現(xiàn)其誘導人類樹突狀細胞TH1 和TH17 細胞因子的分泌[17]。更有意思的是經(jīng)化學誘導的Raji細胞外泌體分泌包含EBV編碼的dUTPase，并且激活外周血單核細胞及樹突狀細胞的NF-κB轉錄因子和促使多種細胞因子的分泌增加[17]。

2.1.3 EBV miRNAs,EBV mRNA和EBERs Pegtel等[18]首先發(fā)現(xiàn)了病毒miRNA被外泌體運送到未感染的細胞 ，他們在EBV感染的B細胞外泌體中證明了BHRF1 miRNAs的存在，并且發(fā)現(xiàn)含有BHRF1 miRNAs的外泌體靶向于鄰近未感染EBV B細胞的CXCL11/ITAC基因。此外，他們還在無癥狀艾滋病毒感染患者(這些患者帶有較高的EBV-DNA載量)非B細胞中發(fā)現(xiàn)含有升高水平的EBV miRNA，表明在體內(nèi)外泌體明顯地轉移miRNA到未感染EBV的細胞。隨后在鼻咽癌細胞系外泌體上的研究證明了這一結論。Gourzones等[12]在移植了人鼻咽癌細胞的小鼠血清外泌體中檢測到了EBV miR-BARTs并發(fā)現(xiàn)鼻咽癌患者的血清中也含有BART miRNA。 Meckes等[6]進一步在鼻咽癌細胞系分泌的外泌體上證明了某些富集的BART-miRNA的存在。近期，另有兩個組分別在EBV相關胃癌和鼻咽癌外泌體中也發(fā)現(xiàn)了BART miRNAs[19-20]。目前研究證明，在外泌體中發(fā)現(xiàn)的兩個以NLRP3 3′-UTR 為靶點的EBV編碼miRNAs(miR-BART15和miR-BART15-3p)有很重要的功能。miR-BART15被外泌體轉運到靶細胞調(diào)節(jié)NLRP3蛋白表達，從而抑制炎癥小體的活性[21]。miR-BART15-3p則發(fā)現(xiàn)存在于起源于EBV感染的胃癌細胞系外泌體中,含有miR-BART15-3p的外泌體被未感染細胞內(nèi)吞后增加其凋亡[19]。 Andrea等[22]發(fā)現(xiàn)EBV外泌體中存在EBV編碼的潛伏期mRNAs。共有4種潛伏期基因表達的mRNA(Ebna1，Ebna2，Lmp1，Lmp2)在EBV陽性細胞外泌體中被檢測到[22]。EBERs是EBV潛伏感染的標志物,近期有研究者發(fā)現(xiàn)EBERs可能通過外泌體分泌[23]。La蛋白是一個能與EBER-1綁定的蛋白[23]，故推測EBERs很可能以EBER-La復合體的形式被外泌體分泌到感染細胞外[23]。

2.2 鼻咽癌的其他外泌體 除了EBV編碼的產(chǎn)物可以被整合進入外泌體外，宿主功能物質(zhì)也能進入外泌體，目前在鼻咽癌外泌體中報道的宿主蛋白主要有半乳糖凝集素9(galectin9)。半乳凝素9是β-半乳糖凝集素，Keryer和klibi等先后在HLA-Ⅱ+外泌體中發(fā)現(xiàn)了galectin9[10-11]。前者在鼻咽癌移植瘤上皮細胞釋放的HLA-Ⅱ+外泌體中發(fā)現(xiàn)galectin9。后者使用抗HLA-Ⅱ的磁珠從鼻咽癌患者的血漿中捕獲特異性的外泌體，這些外泌體中包含有高濃度的galectin9，然而在對照組則沒有檢測出。研究證明，LMP1豐富的外泌體也增加外泌體中galectin9的水平，兩種蛋白同時出現(xiàn)在外泌體時減少外周血T細胞的凋亡。然而外泌體中單獨出現(xiàn)其中一種蛋白時，LMP1(0.17 nM)對比galectin9(46 nM)具有一個更低的IC50，說明外泌體中LMP1的抗凋亡與galectin9關系不大[10]。進一步的研究發(fā)現(xiàn)起源于一個不同EBV感染的鼻咽癌克隆LMP1-且galectin9+的外泌體明顯增加對來自健康EBV攜帶者的EBV反應性 CD4+ T細胞的凋亡作用[11]。

2.3 外泌體在鼻咽癌中的作用

2.3.1 維持EBV潛伏感染 EBV雖然已被發(fā)現(xiàn)超過50年，然而其感染和致病機制仍未闡明。外泌體維持EBV潛伏感染[6]，這可能是EBV在鼻咽癌發(fā)生發(fā)展過程中的作用機制之一。外泌體對EBV感染的調(diào)控可能主要是通過攜帶和運輸病毒編碼產(chǎn)物和宿主功能蛋白，調(diào)控EBV免疫逃避，維持其潛伏感染。鼻咽癌外泌體中豐富的LMP1的抗T細胞凋亡作用與galectin9的促T細胞凋亡作用可能是EBV逃避免疫監(jiān)視，維持潛伏感染的一對機制[10-11]。目前研究還發(fā)現(xiàn)，包含有gp350的外泌體通過CD21選擇性的結合B細胞阻止EBV的感染[14]。LMP1+外泌體被B細胞內(nèi)化后不僅增加B細胞的凋亡而且引起B(yǎng)細胞向漿母細胞的方向分化[24]。Ye等[25]發(fā)現(xiàn)鼻咽癌細胞系TW03來源的外泌體通過抑制T細胞的增殖和TH1和TH17細胞的分化以及促進調(diào)節(jié)性T細胞的誘導來損傷T細胞的功能。這些研究結果提示鼻咽癌外泌體通過改變T細胞的增殖，分化，細胞因子的釋放來誘導T細胞功能障礙(包括特異性和非特異性免疫反應)。

2.3.2 促進鼻咽癌發(fā)生和演進 外泌體能釋放自身細胞因子等物質(zhì)，作用于內(nèi)皮細胞膜表面受體，導致血管形成并促進腫瘤的遷移[7]。Nanb等[26]發(fā)現(xiàn)LMP1+外泌體能改變鼻咽癌細胞間黏附分子ICAM-1的表達水平，引起細胞表型的改變。LMP1通過外泌體促進鼻咽癌細胞成纖維細胞生長因子2(FGF-2)的分泌，外泌體中有活性的FGF-2可能促進鼻咽癌血管生長[27]。轉錄活性的缺氧誘導因子1-α(HIF1-α)也被發(fā)現(xiàn)通過外泌體的內(nèi)吞和胞吐作用從LMP1+的鼻咽癌細胞中分泌出來然后進入鄰近細胞改變鈣黏素的表達水平，從而影響上皮間質(zhì)轉化[28]。研究者對鼻咽癌患者血清和鼻咽癌細胞外泌體中普遍過度表達的5種miRNA(HSA-MIR-24-3p、HSA-MIR-891a、HSA-MIR-106A-5P、HSA-MIR-20A-5P和HSA-MIR-1908)進行了鑒定分析，發(fā)現(xiàn)這些過表達的miRNA簇下調(diào)MARK信號通路從而改變細胞的增殖和分化[25]。目前已發(fā)現(xiàn)32種miRNA與鼻咽癌有關，miRNA參與鼻咽癌腫瘤細胞的增殖、凋亡、黏附、血管生成等生物學過程的調(diào)控，在腫瘤形成中也發(fā)揮重要作用[29]。在鼻咽癌中外泌體與miRNA調(diào)控作用的關系還需要進一步的研究。

2.3.3 外泌體可作為鼻咽癌的生物標志物 腫瘤在生長過程中會不斷地將外泌體釋放到周圍環(huán)境中去，而且外泌體能在4 ℃保存96 h，在-70 ℃下保存更長時間[30]。臨床可以通過檢測血清，尿液和唾液等體液中外泌體的相關分子的改變，對疾病進行診斷和監(jiān)測[31]。鼻咽癌患者血漿中能持續(xù)檢測到腫瘤外泌體[10]。此外，鼻咽癌患者血清中外泌體濃度的增加與鼻咽癌晚期淋巴結轉移和預后不良密切相關[25]。值得注意的是，鼻咽癌外泌體具有高含量HLA-Ⅱ分子[10]，使用抗HLA-Ⅱ的磁珠捕獲是一個從鼻咽癌患者血漿中采集腫瘤外泌體的強大工具。因為在相同的實驗條件下對照血漿樣品中不會有外泌體被捕獲[10]，所以這種方法捕獲的鼻咽癌腫瘤外泌體具有良好的特異性。除了HLA-Ⅱ，鼻咽癌外泌體還具有高濃度的galectin9[11]，因此本文認為鼻咽癌外泌體適合作為生物學標志。

3 展 望

外泌體整合或者攜帶EBV編碼的產(chǎn)物及宿主細胞內(nèi)的功能性物質(zhì)，逃避宿主機體免疫監(jiān)視，從感染的細胞釋放出來，可以被暴露其中的未感染細胞攝取。載有EBV編碼產(chǎn)物的外泌體被未感染細胞內(nèi)化后，激活多條細胞內(nèi)信號通路，操控細胞的增殖和凋亡。EBV相關外泌體在EBV的潛伏感染以及致病過程中的作用可能在鼻咽癌的發(fā)生發(fā)展過程中扮演很重要的角色[32]。進一步了解EBV如何調(diào)控鼻咽癌外泌體的產(chǎn)生和功能可能有助于闡明EBV在鼻咽癌中致病的機制。外泌體在鼻咽癌免疫逃避機制中的探索可能將為鼻咽癌的免疫治療開辟新道路。此外，鼻咽癌外泌體具有的腫瘤標志物的潛能及與預后的關系，將來可能被應用于指導鼻咽癌的臨床診斷和治療。當然，這些研究還處于初始階段，外泌體是否能指導鼻咽癌的臨床診斷和治療以及被應用于鼻咽癌的篩查，還需要將來進一步的研究。

[1]趙素萍.鼻咽癌基礎與臨床[M].長沙:湖南科學技術出版社,2012:171.

[2]Corrado RS,Chiesi A,Ciccia F,et al.Exosomes as intercellular signaling organelles involved in health and disease:basic science and clinical applications[J].Int J Mol Sci,2013,14(3):5338-5366.

[3]楊子楠，魏繼武.外泌體在腫瘤發(fā)展中的研究進展[J].腫瘤,2011,31(6):565-569.

[4]Meckes DG Jr,Raab-Traub N.Microvesicles and viral infection[J].J Virol,2011,85(24):12844-12854.

[5]De Toro J,Herschlik L,Waldner C,et al.Emerging roles of exosomes in normal and pathological conditions:new insights for diagnosis and therapeutic applications[J].Front Immunol,2015,6:203.

[6]Meckes DG Jr,Shair KH,Marquitz AR,et al.Human tumor virus utilizes exosomes for intercellular communication[J].Proc Natl Acad Sci U S A,2010,107(47):20370-20375.

[7]劉長紅，武明花，李桂源.腫瘤細胞來源的外泌體與惡性腫瘤的進展及化療[J].中國生物化學與分子生物學報,2014,30(6):526-532.

[8]Salido-Guadarrama I,Romero-Cordoba S,Peralta-Zaragoza O,et al.MicroRNAs transported by exosomes in body fluids as mediators of intercellular communication in cancer[J].Onco Targets Ther,2014,7:1327-1338.

[9]鄭慧.EBV編碼產(chǎn)物與免疫逃避[J].國外醫(yī)學:免疫學分冊,2003,26(5):246-248.

[10]Keryer-Bibens C,Pioche-Durieu C,Villemant C,et al.Exosomes released by EBV-infected nasopharyngeal carcinoma cells convey the viral latent membrane protein 1 and the immunomodulatory protein galectin 9[J].BMC Cancer,2006,6:283.

[11]Klibi J,Niki T,Riedel A,et al.Blood diffusion and Th1-suppressive effects of galectin-9-containing exosomes released by Epstein-Barr virus-infected nasopharyngeal carcinoma cells[J].Blood,2009,113(9):1957-1966.

[12]Gourzones C,Gelin A,Bombik I,et al.Extra-cellular release and blood diffusion of BART viral micro-RNAs produced by EBV-infected nasopharyngeal carcinoma cells[J].Virol J,2010,7:271.

[13]Ikeda M,Longnecker R.Cholesterol is critical for Epstein-Barr virus latent membrane protein 2A trafficking and protein stability[J].Virology,2007,360(2):461-468.

[14]Vallhov H,Gutzeit C,Johansson SM,et al.Exosomes containing glycoprotein 350 released by EBV-transformed B cells selectively target B cells through CD21 and block EBV infection in vitro[J].J Immunol,2011,186(1):73-82.

[15]Ruiss R,Jochum S,Mocikat R,et al.EBV-gp350 confers B-cell tropism to tailored exosomes and is a neo-antigen in normal and malignant B cells--a new option for the treatment of B-CLL[J].PLoS One,2011,6:e25294.

[16]Waldman WJ,Williams MV Jr,Lemeshow S,et al.Epstein-Barr virus-encoded dUTPase enhances proinflammatory cytokine production by macrophages in contact with endothelial cells:evidence for depression-induced atherosclerotic risk[J].Brain Behav Immun,2008,22(2):215-223.

[17]Ariza ME,Rivailler P,Glaser R,et al.Epstein-Barr virus encoded dUTPase containing exosomes modulate innate and adaptive immune responses in human dendritic cells and peripheral blood mononuclear cells[J].PLoS One,2013,8(7):e69827.

[18]Pegtel DM,Cosmopoulos K,Thorley-Lawson DA,et al.Functional delivery of viral miRNAs via exosomes[J].Proc Natl Acad Sci U S A,2010,107(14):6328-6333.

[19]Choi H,Lee H,Kim SR,et al.Epstein-Barr Virus-Encoded MicroRNA BART15-3p Promotes Cell Apoptosis Partially by Targeting BRUCE[J].J Virol,2013,87(14):8135-8144.

[20]Gourzones C,Ferrand FR,Amiel C,et al.Consistent high concentration of the viral microRNA BART17 in plasma samples from nasopharyngeal carcinoma patients - evidence of non-exosomal transport[J].Virol J,2013,87(10):119.

[21]Haneklaus M,Gerlic M,Kurowska-Stolarska M,et al.Cutting Edge:miR-223 and EBV miR-BART15 Regulate the NLRP3 Inflammasome and IL-1 beta Production[J].J Immunol,2012,189(8):3795-3799.

[22]Canitano A,Venturi G,Borghi M,et al.Exosomes released in vitro from Epstein-Barr virus (EBV)-infected cells contain EBV-encoded latent phase mRNAs[J].Cancer Letters,2013,337(2):193-199.

[23]Ahmed W,Philip PS,Tariq S,et al.Epstein-Barr virus-encoded small RNAs (EBERs) are present in fractions related to exosomes released by EBV-transformed cells[J].PLoS One,2014,9(6):e99163.

[24]Gutzeit C,Nagy N,Gentile M et al.Exosomes derived from Burkitt′s lymphoma cell lines induce proliferation,differentiation,and class-switch recombination in B cells[J].J Immunol,2014,192(12):5852-5862.

[25]Ye SB,Li ZL,Luo DH,et al.Tumor-derived exosomes promote tumor progression and T-cell dysfunction through the regulation of enriched exosomal microRNAs in human nasopharyngeal carcinoma[J].Oncotarget,2014,5(14):5439-5452.

[26]Nanbo A,Kawanishi E,Yoshida R,et al.Exosomes derived from Epstein-Barr virus-infected cells are internalized via caveola-dependent endocytosis and promote phenotypic modulation in target cells[J].J Virol,2013,87(18):10334-10347.

[27]Ceccarelli S,Visco V,Raffa S,et al.Epstein-Barr virus latent membrane protein 1 promotes concentration in multivesicular bodies of fibroblast growth factor 2 and its release through exosomes[J].Int J Cancer,2007,121(7):1494-1506.

[28]Aga M,Bentz GL,Raffa S,et al.Exosomal HIF1alpha supports invasive potential of nasopharyngeal carcinoma-associated LMP1-positive exosomes[J].Oncogene,2014,33(37):4613-4622.

[29]Tan G,Tang X,Tang F.The role of microRNAs in nasopharyngeal carcinoma[J].Tumour Biol,2015,36(1):69-79.

[30]Taylor DD,Gercel-Taylor C,et al.MicroRNA signatures of tumor-derived exosomes as diagnostic biomarkers of ovarian cancer[J].Gynecologic Oncology,2008,110(1):13-21.

[31]Properzi F,Logozzi M,Fais S,et al.Exosomes:the future of biomarkers in medicine[J].Biomark Med,2013,7(5):769-778.

[32]Gourzones C,Barjon C,Busson P.Host-tumor interactions in nasopharyngeal carcinomas[ J].Semin Cancer Biol,2012,22(2):127-136.

10.3969/j.issn.1671-8348.2015.29.044

國家自然科學基金資助項目(81260404)。

：鄢勤文(1987-)，碩士，主要從事鼻咽癌腫瘤生物學及綜合防治的研究工作?！?/p>

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R739.6

A

1671-8348(2015)29-4159-04

2014-12-12

2015-06-16)