化學(xué)發(fā)光免疫法在腫瘤生物標(biāo)志物檢驗(yàn)中的應(yīng)用*

肖忠華 綜述,黃海兵 審校

(重慶三峽醫(yī)藥高等專科學(xué)校，重慶萬州 404120)

·綜 述·

化學(xué)發(fā)光免疫法在腫瘤生物標(biāo)志物檢驗(yàn)中的應(yīng)用*

肖忠華 綜述,黃海兵 審校

(重慶三峽醫(yī)藥高等?？茖W(xué)校，重慶萬州 404120)

化學(xué)發(fā)光免疫法；納米材料；腫瘤生物標(biāo)志物；核酸適配體；化學(xué)發(fā)光能量共振轉(zhuǎn)移

惡性腫瘤嚴(yán)重威脅人類健康，腫瘤生物標(biāo)志物檢驗(yàn)對(duì)于惡性腫瘤篩查、早期診斷、預(yù)后、療效評(píng)估具有重要意義?；瘜W(xué)發(fā)光免疫法指利用標(biāo)記在抗體上物質(zhì)發(fā)光檢驗(yàn)的方法，靈敏度高，選擇性好，通常包括酶標(biāo)化學(xué)發(fā)光和無酶標(biāo)記化學(xué)發(fā)光方法。化學(xué)發(fā)光免疫法廣泛應(yīng)用于腫瘤生物標(biāo)志物檢驗(yàn)。隨著納米金、石墨烯和多碳納米管等納米材料，核酸適配體，磁性微球，脂質(zhì)體，人工模擬酶等的應(yīng)用[1-3]，腫瘤生物標(biāo)志物化學(xué)發(fā)光免疫法檢驗(yàn)取得了較大的進(jìn)步。本文就近年來化學(xué)發(fā)光免疫法在腫瘤生物標(biāo)志物檢驗(yàn)研究進(jìn)展進(jìn)行綜述。

1 構(gòu)建功能界面

對(duì)磁性微球、納米金等納米材料等進(jìn)行親水性改造，構(gòu)建負(fù)載雙抗夾心中的一抗和競爭或非競爭免疫反應(yīng)中的標(biāo)記抗原或標(biāo)記抗體的功能界面，可提高非均相免疫反應(yīng)中免疫復(fù)合物濃度可以降低檢測(cè)限，提高檢測(cè)靈敏度。直徑在1～100 nm的納米金指金的微小顆粒，具有高電子密度、介電特性和催化作用；石墨烯是僅有單原子厚度的二維碳原子晶體，具有較大的比表面積；納米金和石墨烯均易與多種生物分子相結(jié)合且不影響其活性。應(yīng)用納米金和石墨烯兩種納米材料功能化微免疫反應(yīng)單元后 鏈霉親和素化后連接上親和素化AFP捕獲抗體，AFP檢測(cè)限低至0.61 pg/mL[4]，全部免疫反應(yīng)時(shí)間縮短為24 min，如與僅以鏈霉親和素連接生物素標(biāo)記AFP捕獲抗體功能化微免疫反應(yīng)單元化學(xué)發(fā)光信號(hào)強(qiáng)度相比較，納米金和石墨烯聯(lián)用信號(hào)強(qiáng)度增加了近7倍，單用氧化石墨烯或單用納米金信號(hào)強(qiáng)度增加幾乎一致，只增加了約2倍。

磁性微球是具有一定磁性及特殊結(jié)構(gòu)的復(fù)合微球，可通過共聚及表面改性等方法賦予其表面功能基(如-OH、-COOH、-CHO、-NH2等)，在外加磁場作用下還具有導(dǎo)向功能。比表面積較大的磁性微球不僅可以包被更多的捕獲抗體，同時(shí)也起著分離免疫復(fù)合物的作用，便于增大非均相反應(yīng)中免疫復(fù)合物濃度，提高線性范圍和降低檢測(cè)限，縮短反應(yīng)時(shí)間，如化學(xué)發(fā)光免疫雙抗夾心法檢驗(yàn)CEA、甲胎蛋白(AFP)、PSA中[5-7]，而將抗體包被于磁性微反應(yīng)管中則效果相對(duì)較差。正如納米金具有催化作用一樣，應(yīng)用磁性納米球在快速靈敏檢驗(yàn)?zāi)[瘤生物標(biāo)志物中有更好的前景，Zhang等[8]比較包被磷脂酰肌醇蛋白聚糖-3(GPC3)抗體的磁納米(100 nm)和磁性微球(2 μm)競爭免疫法測(cè)定血清GPC3水平，結(jié)果表明，相對(duì)于采用包被GPC3的磁性微球，采用包被GPC3磁納米雖然線性范圍卻沒有變化，但檢測(cè)限降低了近3倍，反應(yīng)時(shí)間縮短了一半。

2 信號(hào)探針放大

雙抗夾心免疫中，直接將酶標(biāo)二抗包被在納米金上、包被二抗在層層封裝多層酶的碳納米管或封裝較多酶的脂質(zhì)體等改進(jìn)信號(hào)探針的方式均可以增強(qiáng)化學(xué)發(fā)光信號(hào)，進(jìn)一步提高檢驗(yàn)靈敏度。

以一抗包被磁性微球，張書圣課題組分別基于二抗包被雙編碼納米金對(duì)碘酚增強(qiáng)HRP魯米諾體系[9]、二抗包被膠體納米金溴酚藍(lán)增強(qiáng)HRP魯米諾體系[10]、多碳納米管層層組裝HRP酶標(biāo)二抗溴酚藍(lán)增強(qiáng)魯米諾體系檢驗(yàn)AFP[11]以G-四聯(lián)體/血紅素-二抗包被納米金基于增強(qiáng)HRP魯米諾體系分析CEA[12]，他們的檢測(cè)限都低至pg級(jí)，比不用納米金時(shí)檢測(cè)限降低了1個(gè)數(shù)量級(jí)，證實(shí)金納米具有較好催化和信號(hào)放大作用，同時(shí)G-四聯(lián)體/血紅素具有類似HRP的酶活性。

脂質(zhì)體(liposome)是一種人工膜，當(dāng)兩性分子如磷脂和鞘脂分散于水相時(shí)，分子的疏水尾部傾向于聚集在一起，避開水相，而親水頭部暴露在水相，形成具有雙分子層結(jié)構(gòu)的封閉囊泡，稱為liposome。Zheng等[13]將二抗包被在封裝HRP脂質(zhì)體上，與包被在微孔板上的PSA一抗反應(yīng)，線性范圍達(dá)到6個(gè)數(shù)量級(jí)，檢測(cè)限為0.7 pg級(jí)。

錳卟啉人工模擬酶具有與HRP類似的催化活性，可與雙鏈DNA以溝槽作用相結(jié)合而不與單聯(lián)DNA結(jié)合，有抗原存在時(shí)，以鏈霉親和素和生物素接合引物鏈的二抗與包被在磁性微球上的一抗形成的免疫復(fù)合物，在存在兩條互補(bǔ)發(fā)夾結(jié)構(gòu)DNA和錳卟啉時(shí)，互補(bǔ)發(fā)夾DNA在引物引發(fā)下發(fā)生滾環(huán)擴(kuò)增，從而接合大量的錳卟啉酶，基于對(duì)碘酚增強(qiáng)魯米諾體系測(cè)定CEA，其線性范圍達(dá)5個(gè)數(shù)量級(jí)，檢測(cè)限6.8 pg/mL[14]。

3 化學(xué)發(fā)光共振能量轉(zhuǎn)移(CRET)

CRET是將能量由化學(xué)發(fā)光反應(yīng)的供體分子傳遞給合適的能量受體分子，由于其不需要激發(fā)光源,降低了背景光的干擾,消除了體系的熒光漂白,減少了自發(fā)熒光，日益受到人們的關(guān)注。Yang等[15]以HRP標(biāo)記抗原，異硫氰酸熒光素標(biāo)記抗體，競爭免疫反應(yīng)后經(jīng)微芯片電泳分離過量酶標(biāo)抗原后，加入魯米諾化學(xué)發(fā)光，基于CRET到異硫氰酸熒光素而信號(hào)增強(qiáng)來測(cè)定NSE，相比較于不采用CRET，檢測(cè)限低了2個(gè)數(shù)量級(jí)；Ogaidi等[16]、Huang等[17]將一抗分別包被于負(fù)載量子點(diǎn)的石墨烯功能化反應(yīng)管和納米金中，HRP酶標(biāo)記二抗，基于雙抗夾心法形成的免疫復(fù)合物在魯米諾體系中的化學(xué)發(fā)光可以被石墨烯、納米金淬滅測(cè)定了CA125、AFP，檢測(cè)限分別可達(dá)0.05 U/L、2.5 ng/mL。

4 核酸適配體(aptamer)

aptamer是一類具有類似抗體對(duì)靶分子具有高親和性、高特異性結(jié)合的單鏈寡核苷酸，可以是單鏈DNA(ssDNA)，也可以是RNA。吸附2-氧甲基改性p53 RNA 核酸適配體的金納米不容易聚集成較大顆粒，對(duì)魯米諾化學(xué)發(fā)光催化作用較弱，如果樣本中存在p53，則aptamer結(jié)合p53后脫附金納米，結(jié)果金納米發(fā)生聚集，強(qiáng)烈催化魯米諾體系發(fā)光，既可以利用金納米從紅色到紫色的顏色反應(yīng)也可以利用化學(xué)發(fā)光強(qiáng)度檢驗(yàn)p53，顏色反應(yīng)檢測(cè)限低至ng，而化學(xué)發(fā)光則檢測(cè)限低至pg級(jí)[18]。在以TEX615標(biāo)記的PSA aptamer捕獲PSA后，以磁性石墨烯吸附分離未反應(yīng)完的PSA aptamer,N,N′-二咪唑基乙二酰胺(1,10-oxalyldiimidazole chemiluminescence)作為化學(xué)發(fā)光劑檢驗(yàn)PSA，結(jié)果表明以磁性石墨烯吸附分離后化學(xué)發(fā)光信號(hào)比只用石墨烯或不用石墨烯(如只用石墨烯，游離aptamer也可被吸附，但其發(fā)光可因共振到石墨烯上而淬滅；值得注意的是不用石墨烯時(shí)其信號(hào)僅下降了1/20)時(shí)下降了近100倍，大大提高了檢測(cè)靈敏度并縮短反應(yīng)時(shí)間為40 min[19]?；谶B接6-羧基熒光素的富含鳥嘌呤DNA aptamer與3，4,5-三甲氧基苯乙?；兹?TMPG)反應(yīng)形成高能中間體能量可轉(zhuǎn)移到6-羧基熒光素增強(qiáng)化學(xué)發(fā)光，而存在PSA抗原時(shí)，化學(xué)發(fā)光被PSA淬滅測(cè)定血清中PSA，檢測(cè)限達(dá)到1.0 ng/mL，反應(yīng)時(shí)間縮短為30 min[20]。

5 展 望

近年來，由于采用直接或間接使用納米材料等構(gòu)建的功能界面，結(jié)合應(yīng)用脂質(zhì)體、納米材料等信號(hào)放大探針、核酸適配體，以及化學(xué)能量共振轉(zhuǎn)移等，腫瘤生物標(biāo)志物化學(xué)發(fā)光免疫法檢驗(yàn)朝著高靈敏方向快速發(fā)展。而由于采用傳感器陣列[21]、多酶標(biāo)記[22]等的應(yīng)用，化學(xué)發(fā)光免疫法在快速和多組分方面也取得了長足進(jìn)步[23]。

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10.3969/j.issn.1671-8348.2015.28.038

重慶市教委科學(xué)技術(shù)研究項(xiàng)目(KJ131804)。

：肖忠華(1974-)，碩士，副教授，主要從事生物分析化學(xué)的研究。

R446.6

A

1671-8348(2015)28-4003-02

2015-04-13

2015-06-20)