T－SPOT.TB技術(shù)在潛伏結(jié)核感染者免疫抑制劑治療中的臨床應(yīng)用＊

畢 艷，伊正君，付玉榮

（濰坊醫(yī)學(xué)院/山東省臨床檢驗(yàn)診斷學(xué)高校重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，山東濰坊261031）

潛 伏 結(jié) 核 感 染（latent mycobacterium tuberculosis infection，LTBI）通常是指體內(nèi)（通常是肺）存在結(jié)核桿菌，但仍未出現(xiàn)明顯的癥狀且痰中也無(wú)結(jié)核菌，當(dāng)機(jī)體免疫力下降時(shí)可由潛伏感染轉(zhuǎn)化為活動(dòng)性結(jié)核感染。據(jù)世界衛(wèi)生組織估計(jì)，全球有將近三分之一的人感染過(guò)結(jié)核分枝桿菌，而全國(guó)第4次結(jié)核病流行病學(xué)調(diào)查結(jié)果顯示，中國(guó)感染結(jié)核桿菌的人數(shù)超過(guò)了5億，占總?cè)丝诳倲?shù)的44.5%［1］。潛伏性感染者如果不進(jìn)行治療，約有5%～10%將會(huì)發(fā)展成活動(dòng)性結(jié)核，在伴有免疫抑制疾病的人群中，這一比例更大［2］。免疫抑制劑（激素或者生物制劑TNF－α）已經(jīng)成為慢性炎癥性疾?。ㄈ珙愶L(fēng)濕關(guān)節(jié)炎、強(qiáng)直性脊柱炎、或克羅恩病等）有效的治療方法。然而，接受免疫抑制劑患者誘發(fā)活動(dòng)性結(jié)核的風(fēng)險(xiǎn)將大幅增加。因此，對(duì)應(yīng)用免疫抑制劑患者進(jìn)行篩查和預(yù)防性治療是必不可少的。臨床上尚缺乏診斷潛伏性結(jié)核的“金標(biāo)準(zhǔn)”。結(jié)核菌素皮膚試驗(yàn)（TST）因以其成熟的檢測(cè)手段、低成本，成為目前高危人群潛伏性結(jié)核感染的檢測(cè)方法。但是多因素可影響TST的檢測(cè)結(jié)果，導(dǎo)致出現(xiàn)假陰性和假陽(yáng)性結(jié)果，如機(jī)體處于反應(yīng)前期、病毒和支原體感染性疾病、結(jié)核菌素保存不當(dāng)、劑量不足、注射過(guò)深、閱讀記錄偏差、與卡介苗發(fā)生交叉反映等［3，4］。近年來(lái)發(fā)展的酶聯(lián)免疫斑點(diǎn)法T－SPOT.TB技術(shù)是一種基于抗原特異性細(xì)胞免疫應(yīng)答反應(yīng)的新型免疫檢測(cè)技術(shù)，為早期診斷結(jié)核潛伏感染提供了新的方向。為此，本文對(duì)T－SPOT.TB技術(shù)在應(yīng)用免疫抑制劑前患者潛伏結(jié)核感染篩查中的應(yīng)用價(jià)值進(jìn)行評(píng)估。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選擇2010年8月至2013年12月在某院風(fēng)濕免疫科住院治療患者162例，男89例，女7例，年齡（38.6±3.8）歲。結(jié)締組織病98例，其中風(fēng)濕或類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎77例，皮肌炎4例，白塞綜合征7例，其中合并貝赫切特血管病5例且行外科手術(shù)治療；紅斑狼瘡10例；強(qiáng)直性脊柱炎54例；克羅恩病7例。排除確診的肺結(jié)核患者，肺結(jié)核確診要求：痰涂片或培養(yǎng)出結(jié)核分枝桿菌；或根據(jù)臨床表現(xiàn)、實(shí)驗(yàn)室檢查臨床診斷為肺結(jié)核。免疫抑制劑的應(yīng)用納入標(biāo)準(zhǔn)：所有應(yīng)用免疫抑制劑的患者在應(yīng)用前均行T－SPOT.TB檢查，TST試驗(yàn)。

1.2 T－SPOT.TB檢測(cè) T－SPOT.TB檢測(cè)采用英國(guó) Oxford Immunotee公司生產(chǎn)的試劑盒。每個(gè)入選患者用BD公司生產(chǎn)的CPT真空采血管采集外周血8mL，室溫放置不超過(guò)4h，不得冷藏和冷凍。實(shí)驗(yàn)過(guò)程嚴(yán)格按照試劑盒操作說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。顯微鏡或放大鏡進(jìn)行斑點(diǎn)計(jì)數(shù)。當(dāng)測(cè)試孔A或B達(dá)到以下標(biāo)準(zhǔn)則判定為陽(yáng)性結(jié)果：（1）陰性對(duì)照斑點(diǎn)數(shù)為0～5個(gè)，A或B孔斑點(diǎn)數(shù)－陰性孔斑點(diǎn)數(shù)為6個(gè)，判斷為陽(yáng)性（＋）；（2）陰性對(duì)照斑點(diǎn)數(shù)26，A或B孔斑點(diǎn)數(shù)22倍陰性孔，判斷為陽(yáng)性（＋）；若A、B孔斑點(diǎn)數(shù)不夠以上標(biāo)準(zhǔn)，且陽(yáng)性對(duì)照反應(yīng)良好，則為陰性（－）。若陰性對(duì)照孔斑點(diǎn)數(shù)超過(guò)10，陽(yáng)性對(duì)照孔斑點(diǎn)數(shù)低于20時(shí)，結(jié)果不能確定。陽(yáng)性結(jié)果說(shuō)明患者體內(nèi)存在針對(duì)結(jié)核桿菌的效應(yīng)T淋巴細(xì)胞，陰性結(jié)果提示患者可能不含針對(duì)結(jié)核桿菌的效應(yīng)T淋巴細(xì)胞。

1.3 TST檢測(cè) 采用成都生物制品研究所生產(chǎn)人型結(jié)核菌素純蛋白衍生物（purified protein derivative，PPD）試劑，對(duì)所有入選患者以0.1mL PPD（含BCG－PPD 5IU）采用孟都氏法于左側(cè)前臂內(nèi)側(cè)皮內(nèi)注射，使局部形成皮丘。48～72h測(cè)量皮膚硬結(jié)直徑，硬結(jié)平均直徑＝（橫徑＋縱徑）/2。按照標(biāo)準(zhǔn)OT試驗(yàn)判定標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行判斷，＜5mm陰性（－），5～＜10mm弱陽(yáng)性（＋），10～＜20mm陽(yáng)性（＋＋），≥20mm或出現(xiàn)破潰，水泡，雙圈強(qiáng)陽(yáng)性（＋＋＋）。

1.4 隨訪 對(duì)應(yīng)用T－SPOT.TB篩查陽(yáng)性的28例患者，在應(yīng)用抗TNF－α生物制劑治療前均給予預(yù)防性抗結(jié)核藥物治療4個(gè)月，并隨訪1年。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 應(yīng)用SPSS16.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析，計(jì)數(shù)資料用率表示，采用χ2檢驗(yàn)，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 T－SPOT.TB及TST試驗(yàn)檢查應(yīng)用免疫抑制劑患者陽(yáng)性率比較 162例患者中，T－SPOT.TB陽(yáng)性例數(shù)為59例，陽(yáng)性率為36.4%；TST陽(yáng)性例數(shù)為46例，陽(yáng)性率為28.4%，兩者比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），見(jiàn)表1。

表1 T－SPOT.TB及TST試驗(yàn)陽(yáng)性率

2.2 T－SPOT.TB及TST試驗(yàn)檢查應(yīng)用免疫抑制劑患者確診率比較 59例T－SPOT.TB陽(yáng)性患者中，確診為結(jié)核感染56例，確診率為94.9%；46例TST陽(yáng)性患者中，確診為結(jié)核感染32例，確診率為69.6%；兩者比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），見(jiàn)表2。

表2 T－SPOT.TB及TST試驗(yàn)確診率

2.3 T－SPOT.TB技術(shù)篩查后應(yīng)用免疫抑制劑患者管理 鑒于T－SPOT.TB陽(yáng)性患者爆發(fā)結(jié)核感染率較高（94.9%，56/59），有28例應(yīng)用抗TNF－α生物制劑治療且T－SPOT.TB陽(yáng)性患者被納入，對(duì)于LTBI患者，給予目標(biāo)性治療方案（包括單用異煙肼、異煙肼和利福平聯(lián)用、利福平和吡嗪酰胺聯(lián)用等，持續(xù)4個(gè)月。在藥物治療過(guò)程中嚴(yán)密監(jiān)測(cè)患者的肝功能，一旦出現(xiàn)肝炎臨床表現(xiàn)，立即停藥。28例患者應(yīng)用抗TNF－α生物制劑治療，治療前均給予預(yù)防性抗結(jié)核藥物治療4個(gè)月，在1年的隨訪過(guò)程中，28例患者其中2例爆發(fā)肝炎，停抗結(jié)核藥物治療，其中1例死于肝功能衰竭。所有患者均未發(fā)生結(jié)核感染。

3 討 論

結(jié)核病是全球主要的公共衛(wèi)生問(wèn)題之一，嚴(yán)重危害人類的健康。據(jù)世界衛(wèi)生組織估計(jì)全球約有1/3的人口接近2億人是潛伏性結(jié)核的感染者。我國(guó)是世界上22個(gè)結(jié)核病高負(fù)擔(dān)國(guó)家之一，結(jié)核病患者數(shù)量居世界第2位，全國(guó)約有肺結(jié)核病患者450萬(wàn)人，每年因患結(jié)核病死亡的人數(shù)達(dá)到13萬(wàn)人［5］。因此早期發(fā)現(xiàn)及時(shí)確診結(jié)核病在控制結(jié)核病措施中顯得極為重要。目前臨床上免疫抑制劑制劑已經(jīng)成為慢性炎癥性疾病有效的治療方法。但是應(yīng)用免疫抑制劑，導(dǎo)致機(jī)體細(xì)胞免疫功能下降，包括淋巴細(xì)胞、單核、巨噬細(xì)胞、中性粒細(xì)胞、嗜酸粒細(xì)胞等功能的抑制，容易引發(fā)潛伏結(jié)核分支桿菌感染，引起活動(dòng)性結(jié)核。我國(guó)目前很多醫(yī)院特別是基層的醫(yī)院沒(méi)有對(duì)需要應(yīng)用免疫抑制劑的患者并發(fā)潛伏結(jié)核感染引起足夠的重視，有的醫(yī)院僅做TST篩查，有的根本就沒(méi)篩查，從而導(dǎo)致應(yīng)用免疫抑制劑誘發(fā)結(jié)核病［6－7］。

TST是診斷LTBI的傳統(tǒng)方法，但影響因素很多，導(dǎo)致陽(yáng)性率并不高，張然等回顧性分析了2 682例SLE應(yīng)用免疫抑制劑患者中93例患結(jié)核，93例TST試驗(yàn)強(qiáng)陽(yáng)性僅13例（13.98%），陰性高達(dá)80例（86.02%）［8］。Xie等［9］采用 Meta分析法對(duì)國(guó)內(nèi)常見(jiàn)3種生物制劑治療RA過(guò)程中發(fā)生感染、重癥感染以及結(jié)核感染等的風(fēng)險(xiǎn)進(jìn)行系統(tǒng)評(píng)價(jià)。發(fā)現(xiàn)涉及的14例結(jié)核患者在使用生物制劑前的結(jié)核篩查項(xiàng)目為T(mén)ST皮試、胸部平片等傳統(tǒng)手段，篩查結(jié)果均為陰性，說(shuō)明了傳統(tǒng)結(jié)核檢測(cè)手段并不能有效發(fā)現(xiàn)潛伏性結(jié)核患者，達(dá)不到早期診斷的目的。

T－SPOT.TB檢測(cè)原理是利用結(jié)核分枝桿菌RD1區(qū)域編碼的6×103早期分泌抗原靶分子蛋白和10×103培養(yǎng)濾液蛋白的肽段作為特異性抗原，刺激T細(xì)胞釋放γ－干擾素，再分別通過(guò)酶聯(lián)免疫斑點(diǎn)試驗(yàn)和全血酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)檢測(cè)γ－干擾素水平來(lái)判斷是否存在結(jié)核分枝桿菌感染。T－SPOT.TB技術(shù)是目前檢測(cè)抗原特異性T細(xì)胞最敏感的方法，可檢測(cè)出1/100 000～1/50 000外周血單個(gè)核細(xì)胞中經(jīng)某種抗原刺激后釋放某種細(xì)胞因子的細(xì)胞，在2008年，美國(guó)FDA已將TSPOT作為第4種IGRAs批準(zhǔn)使用。Mandalakas等［10］比較T－SPOT.TB與TST對(duì)診斷的準(zhǔn)確性，得出IGRAs在診斷潛伏性結(jié)核感染時(shí)比TST有更大的優(yōu)勢(shì)，而且在排除結(jié)核感染中可信度更大。本研究也說(shuō)明T－SPOT.TB在潛伏性結(jié)核感染診斷的準(zhǔn)確性上要優(yōu)于TST。

日本Takeuchi等［11］報(bào)道5 000例使用英夫利西單抗治療的RA患者中，前2 000例RA患者中結(jié)核發(fā)病數(shù)為11例，由于加強(qiáng)對(duì)后3 000例患者的結(jié)核篩查和預(yù)防性治療，結(jié)核發(fā)病例數(shù)由11/2 000例減少至3/3 000例。因此，本研究中遵循了專家組建議，對(duì)潛伏結(jié)核感染的患者，在使用免疫抑制劑前，先行預(yù)防性抗結(jié)核治療至少4個(gè)月［12］。通過(guò)對(duì)28例高?；颊撸═－SPOT.TB篩查陽(yáng)性），給予預(yù)防性治療的患者1年的隨訪，無(wú)一例結(jié)核病發(fā)生，這與國(guó)外相關(guān)研究結(jié)果是一致的［9，11－12］。所以對(duì) T－SPOT.TB陽(yáng)性的患者給以抗結(jié)核藥物的預(yù)防性治療非常必要的。

由于目前LTBI的診斷缺乏金標(biāo)準(zhǔn)，惟一能證實(shí)的較好方法就是對(duì)未經(jīng)治療的陽(yáng)性個(gè)體進(jìn)行隨訪，這在臨床研究中是難以實(shí)現(xiàn)的。在應(yīng)用免疫抑制劑前對(duì)潛伏結(jié)核感染的篩查就具有重要的臨床價(jià)值。T－SPOT試驗(yàn)具有較高的特異性和敏感性，是目前快速篩查L(zhǎng)TBI感染最有潛力的新方法。本研究認(rèn)為對(duì)于T－SPOT.TB陽(yáng)性的患者給以預(yù)防性的抗結(jié)核治療，加強(qiáng)免疫抑制劑（尤其生物制劑）使用前對(duì)潛伏性結(jié)核感染的檢測(cè)和預(yù)防性治療，可有效且最大程度減低免疫制劑致結(jié)核感染風(fēng)險(xiǎn)。對(duì)T－SPOT.TB確診的陽(yáng)性LTBI患者給予預(yù)防性抗結(jié)核藥物治療也是非常必要的。

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