蟾蜍靈抑制Raf/MEK/細胞外信號調(diào)節(jié)激酶信號通路活化影響人食管鱗癌細胞增殖及遷移機制研究

丁 妍，王小玲，鄧會巖，蘇麗宏，張 培，劉月平

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·論著·

蟾蜍靈抑制Raf/MEK/細胞外信號調(diào)節(jié)激酶信號通路活化影響人食管鱗癌細胞增殖及遷移機制研究

丁 妍，王小玲，鄧會巖，蘇麗宏，張 培，劉月平

目的 探討蟾蜍靈通過抑制人食管鱗癌細胞Raf/MEK/細胞外信號調(diào)節(jié)激酶(ERK)信號通路的活化從而影響人食管鱗癌細胞增殖及遷移的作用機制。方法 培養(yǎng)人食管鱗癌細胞株TE13，分為對照組、不同濃度蟾蜍靈組(蟾蜍靈10 nmol/L組、蟾蜍靈25 nmol/L組、蟾蜍靈50 nmol/L組、蟾蜍靈100 nmol/L組)、UO126組和蟾蜍靈100 nmol/L+UO126組，采用Western blotting方法和免疫細胞化學(xué)方法分別檢測各組Raf-1、磷酸化Raf-1(p-Raf-1)、MEK、磷酸化MEK(p-MEK)、ERK、磷酸化細胞外信號調(diào)節(jié)激酶(p-ERK)表達量和陽性表達率。劃痕實驗和Boyden小室實驗檢測各組細胞的遷移距離和穿過濾膜的細胞數(shù)量。結(jié)果 蟾蜍靈25 nmol/L組、蟾蜍靈50 nmol/L組和蟾蜍靈100 nmol/L組p-Raf-1、p-ERK表達量低于對照組(P<0.05)；蟾蜍靈50 nmol/L組和蟾蜍靈100 nmol/L組p-MEK表達量低于對照組(P<0.05)；蟾蜍靈100 nmol/L+UO126組p-Raf-1、p-MEK、p-ERK表達量低于UO126組(P<0.05)。蟾蜍靈25 nmol/L組、蟾蜍靈50 nmol/L組和蟾蜍靈100 nmol/L組p-Raf-1、p-ERK陽性表達率低于對照組(P<0.05)；蟾蜍靈50 nmol/L組和蟾蜍靈100 nmol/L組p-MEK陽性表達率低于對照組(P<0.05)；蟾蜍靈100 nmol/L+UO126組p-Raf-1、p-MEK、p-ERK陽性表達率低于UO126組(P<0.05)。劃痕實驗結(jié)果顯示，蟾蜍靈25 nmol/L組、蟾蜍靈50 nmol/L組和蟾蜍靈100 nmol/L組細胞遷移距離短于對照組(P<0.05)；蟾蜍靈100 nmol/L+UO126組細胞遷移距離短于UO126組(P<0.05)。Boyden小室實驗結(jié)果顯示，蟾蜍靈25 nmol/L組、蟾蜍靈50 nmol/L組和蟾蜍靈100 nmol/L組穿過濾膜的細胞數(shù)量少于對照組(P<0.05)；蟾蜍靈100 nmol/L+UO126組穿過濾膜的細胞數(shù)量少于UO126組(P<0.05)。結(jié)論 蟾蜍靈可下調(diào)細胞內(nèi)p-Raf-1、p-MEK、p-ERK表達量，提示蟾蜍靈可能是通過抑制Raf/MEK/ERK信號通路活化這一過程而發(fā)揮作用，從而抑制人食管鱗癌細胞的生長。蟾蜍靈對人食管鱗癌細胞株TE13的遷移和趨化運動能力具有明顯的抑制作用。

食管腫瘤；蟾蜍靈；絲裂原活化蛋白激酶；細胞增殖；細胞運動

丁妍，王小玲，鄧會巖，等.蟾蜍靈抑制Raf/MEK/細胞外信號調(diào)節(jié)激酶信號通路活化影響人食管鱗癌細胞增殖及遷移機制研究[J].中國全科醫(yī)學(xué)，2015，18(21)：2535-2541.[www.chinagp.net]

Ding Y, Wang XL, Deng HY, et al.Mechanism of Bufalin affecting the proliferation and migration of human esophageal carcinoma cells through inhibiting the activity of Raf/MEK/ERK pathway[J].Chinese General Practice，2015，18(21)：2535-2541.

食管癌是人類常見的惡性腫瘤之一，其發(fā)生是多因素作用、多基因參與、多階段共同發(fā)展的結(jié)果，然而其發(fā)生發(fā)展的確切機制尚不明確[1]。我國是世界上食管癌病死率最高的國家之一[2]。盡管近年來通過普查使得食管癌早發(fā)現(xiàn)、早診斷、早治療的水平有所提高，食管癌的預(yù)后有所改善，但5年生存率仍較低[3]。因此，繼續(xù)尋找新的抗腫瘤藥物，并了解其在腫瘤發(fā)生、發(fā)展過程中作用的信號通路成為食管癌臨床治療研究的重點。細胞外信號調(diào)節(jié)激酶(ERK)是絲裂原活化蛋白激酶(MAPK)信號通路家族的重要成員之一，參與將細胞外信號傳遞至細胞核的過程，與細胞的分化、增殖有關(guān)，并參與細胞的惡性轉(zhuǎn)化。其中，Ras/Raf/MEK/ERK是ERK信號通路的主要途徑。蟾蜍靈是從中華大蟾蜍或黑眶蟾蜍的耳后腺及皮膚腺的干燥分泌物中提取的主要活性成分之一，屬于強心苷類物質(zhì)[4]，已被用來作為一種傳統(tǒng)的中藥治療感染、腫瘤以及麻醉。研究發(fā)現(xiàn)，蟾蜍靈可以抑制膀胱癌、肝癌細胞的侵襲和遷移[5-6]，也可以通過抑制P13K/Akt信號通路誘導(dǎo)肺癌細胞的凋亡[7-8]。且有相關(guān)報道指出，蟾蜍靈是當(dāng)今用于臨床藥物治療肝癌等惡性腫瘤的注射用藥華蟾素的有效成分之一，其在臨床應(yīng)用方面已取得令人矚目的成績[9]。但蟾蜍靈在人食管鱗癌發(fā)生發(fā)展中的應(yīng)用在國內(nèi)外鮮有報道。本實驗將蟾蜍靈應(yīng)用于食管癌，并觀察其對人食管鱗癌細胞株TE13 Raf/MEK/ERK信號通路活化的抑制作用。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 細胞 人食管鱗癌細胞株TE13由河北醫(yī)科大學(xué)第四醫(yī)院科研中心提供。

1.1.2 主要試劑 RPMI 1640培養(yǎng)液(美國Gibco公司)；胎牛血清(杭州四季青生物工程材料有限公司)；蟾蜍靈、UO126(MEK/ERK磷酸化抑制劑)(上海源葉生物科技有限公司)；BCA法蛋白含量測定試劑盒(北京索萊寶生物科技有限公司)；兔抗Raf-1多克隆抗體(美國SANTACRUZ公司)；兔抗磷酸化Raf-1(p-Raf-1)多克隆抗體(美國SANTACRUZ公司)；兔抗 MEK1/2多克隆抗體(美國 SAB 公司)；兔抗磷酸化MEK1/2(p-MEK1/2)多克隆抗體(美國 SAB 公司)；兔抗人ERK多克隆抗體(美國SANTACRUZ公司)；小鼠抗人磷酸化細胞外信號調(diào)節(jié)激酶(p-ERK)單克隆抗體(美國SANTACRUZ公司)；通用型二抗(北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司)；二氨基聯(lián)苯胺(DAB)顯色試劑盒(北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司)。

1.2 方法

1.2.1 分組 人食管鱗癌細胞株TE13分為對照組、不同濃度蟾蜍靈組(蟾蜍靈10 nmol/L組、蟾蜍靈25 nmol/L組、蟾蜍靈50 nmol/L組、蟾蜍靈100 nmol/L組)、UO126組和蟾蜍靈100 nmol/L+UO126組。其中對照組選用生長狀態(tài)良好的細胞，將細胞培養(yǎng)于含10%胎牛血清的RPMI 1640培養(yǎng)液中，置37 ℃、5%CO2孵育箱中，1～2 d更換培養(yǎng)液，繼續(xù)培養(yǎng)細胞備用。其余組均選用生長狀態(tài)良好的細胞，當(dāng)細胞生長至80%時，更換無胎牛血清的RPMI 1640培養(yǎng)液培養(yǎng)12～16 h，分別加入不同濃度蟾蜍靈(10、25、50、100 nmol/L)、UO126(20 μmol/L)、蟾蜍靈100 nmol/L+UO126(20 μmol/L)，培養(yǎng)2 h后棄去培養(yǎng)液，并加入含15%胎牛血清的RPMI 1640培養(yǎng)液，培養(yǎng)30 min后收集細胞備用。

1.2.2 Western blotting法檢測各組蛋白表達量 取對數(shù)生長期的細胞，提取總蛋白，測定蛋白濃度，蛋白上清液經(jīng)聚丙烯酰胺凝膠(SDS-PAGE)電泳(5%濃縮膠、15%分離膠)，電泳分離后，恒壓轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素膜，用含1%脫脂奶粉的TBST緩沖液封閉30 min, 一抗于4 ℃孵育過夜, TBST緩沖液洗滌3次，辣根過氧化物酶標(biāo)記的二抗于室溫孵育2 h，TBST 緩沖液洗滌3次，膜與化學(xué)發(fā)光底物孵育5 min，經(jīng)Alphainnotech凝膠成像系統(tǒng)顯影、測定灰度值，重復(fù)3次。

1.2.3 免疫細胞化學(xué)方法觀察各組蛋白表達陽性率 制備細胞玻片，取高壓消毒后的蓋玻片置于無菌的6孔培養(yǎng)板中。取對數(shù)生長期細胞，以2×104/ml接種于6孔板中，1 ml/孔。置37 ℃、5%CO2孵育箱培養(yǎng)并處理細胞，進行免疫細胞化學(xué)方法染色并計數(shù)結(jié)果，重復(fù)3次。

1.2.4 劃痕實驗、Boyden小室實驗檢測細胞遷移和穿過濾膜情況 劃痕實驗：制備細胞玻片，取高壓消毒后的蓋玻片置于無菌的6孔板中。取對數(shù)生長期的細胞，以2×104/ml接種于6孔板中，1 ml/孔。置37 ℃、5%CO2孵育箱培養(yǎng)。細胞完全融合時，棄去培養(yǎng)液，使用無菌槍頭將蓋玻片上的細胞輕輕劃出“一”字，力道均勻，寬窄一致，并用磷酸鹽緩沖液(PBS)清洗2次。根據(jù)不同分組處理細胞，冷甲醛固定，蘇木素-伊紅(HE)染色，24 h后顯微鏡下測量遷移距離。Boyden小室實驗：將高壓后的載玻片置于6孔板內(nèi)，用常規(guī)方法消化細胞，調(diào)整細胞濃度為2×104個/孔，加入不同溶度的蟾蜍靈(10、25、50、100 nmol/L)、UO126、蟾蜍靈100 nmol/L+UO126,培養(yǎng)后取600 μl分別接種于6孔板內(nèi)改良Boyden小室內(nèi)，加入含10%胎牛血清的RPMI 1640培養(yǎng)液常規(guī)孵育24 h，棉簽擦盡上室面的細胞和人工膠，甲醛溶液固定，HE染色，400倍光鏡下取上、下、左、右、中心5個視野，計數(shù)濾膜下室面的細胞數(shù)量，取均數(shù)，重復(fù)5次。

2 結(jié)果

2.1 Western blotting方法結(jié)果 各組Raf-1、MEK、ERK表達量比較，差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)；各組p-Raf-1、p-MEK、p-ERK表達量比較，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；其中蟾蜍靈25 nmol/L組、蟾蜍靈50 nmol/L組和蟾蜍靈100 nmol/L組p-Raf-1、p-ERK表達量低于對照組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；蟾蜍靈50 nmol/L組和蟾蜍靈100 nmol/L組p-MEK表達量低于對照組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；蟾蜍靈100 nmol/L+UO126組p-Raf-1、p-MEK、p-ERK表達量低于UO126組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05，見表1、圖1)。

2.2 免疫細胞化學(xué)方法結(jié)果 p-Raf-1、p-MEK、p-ERK均表達于細胞質(zhì)，呈棕黃色顆粒，并且隨著藥物濃度的增加，陽性細胞數(shù)量逐漸減少，棕黃色顆粒逐漸變小，密度逐漸減低(見圖2～4)。各組Raf-1、MEK、ERK陽性表達率比較，差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)；各組p-Raf-1、p-MEK、p-ERK陽性表達率比較，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；其中蟾蜍靈25 nmol/L組、蟾蜍靈50 nmol/L組和蟾蜍靈100 nmol/L組p-Raf-1、p-ERK陽性表達率低于對照組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；蟾蜍靈50 nmol/L組和蟾蜍靈100 nmol/L組p-MEK陽性表達率低于對照組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；蟾蜍靈100 nmol/L+UO126組p-Raf-1、p-MEK、p-ERK陽性表達率低于UO126組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05，見表2)。

2.3 劃痕實驗、Boyden小室實驗方法結(jié)果 劃痕實驗結(jié)果顯示，各組細胞遷移距離比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；其中，蟾蜍靈25 nmol/L組、蟾蜍靈50 nmol/L組和蟾蜍靈100 nmol/L組低于對照組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；蟾蜍靈100 nmol/L+UO126組低于UO126組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05，見表3、圖5)。Boyden小室實驗結(jié)果顯示，各組穿過濾膜的細胞數(shù)量比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；其中，蟾蜍靈25 nmol/L組、蟾蜍靈50 nmol/L組和蟾蜍靈100 nmol/L組低于對照組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；蟾蜍靈100 nmol/L+UO126組低于UO126組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05，見表3)。

注：p-Raf-1=磷酸化Raf-1，p-MEK=磷酸化MEK，ERK=細胞外信號調(diào)節(jié)激酶，p-ERK=磷酸化細胞外信號調(diào)節(jié)激酶；1為對照組，2為蟾蜍靈10 nmol/L組，3為蟾蜍靈25 nmol/L組，4為蟾蜍靈50 nmol/L組，5為蟾蜍靈100 nmol/L組，6為UO126組，7為蟾蜍靈100 nmol/L+UO126組

圖1 Western blotting方法檢測各組Raf-1、p-Raf-1、MEK、p-MEK、ERK、p-ERK在人食管鱗癌細胞株TE13中的表達

Figure 1 Expressions of Raf-1, p-Raf-1, MEK, p-MEK, ERK and p-ERK in human esophageal carcinoma cell lines TE13 among different groups were detected by Western blotting method

表1 各組Raf-1、p-Raf-1、MEK、p-MEK、ERK、p-ERK表達量比較

注：p-Raf-1=磷酸化Raf-1，p-MEK=磷酸化MEK，ERK=細胞外信號調(diào)節(jié)激酶，p-ERK=磷酸化細胞外信號調(diào)節(jié)激酶；與對照組比較，aP<0.05；與UO126組比較，bP<0.05

圖2 各組p-Raf-1在細胞中的表達(免疫細胞化學(xué)方法，×400)

圖3 各組p-MEK在細胞中的表達(免疫細胞化學(xué)方法，×400)

圖3 各組p-ERK在細胞中的表達(免疫細胞化學(xué)方法，×400)

注：1為對照組，2為蟾蜍靈10 nmol/L組，3為蟾蜍靈25 nmol/L組，4為蟾蜍靈50 nmol/L組，5為蟾蜍靈100 nmol/L組，6為UO126組，7為蟾蜍靈100 nmol/L+UO126組

圖5 各組細胞遷移距離

Figure 5 The migration distance of esophageal carcinoma TE13 cells in different groups

表2 各組Raf-1、p-Raf-1、MEK、p-MEK、ERK、p-ERK陽性表達率比較(%，n=3)

Table 2 Comparison of the positive expression rates of Raf-1, p-Raf-1, MEK, p-MEK, ERK and p-ERK among different groups

組別Raf-1p-Raf-1MEKp-MEKERKp-ERK對照組80.3180.2376.5880.3376.4079.60蟾蜍靈10nmol/L組80.2378.6776.4768.4176.8068.00蟾蜍靈25nmol/L組80.1652.22a76.0467.3075.6057.00a蟾蜍靈50nmol/L組80.0549.28a75.4052.62a77.6044.20a蟾蜍靈100nmol/L組80.0137.59a74.9827.00a76.2011.00aUO126組80.1135.4875.8826.0476.2012.23蟾蜍靈100nmol/L+UO126組80.1920.03b76.2415.23b76.337.02bχ2值0.40812011.40310.98715432.0096.83916604.184P值0.999<0.0010.089<0.0010.336<0.001

注：與對照組比較，aP<0.05；與UO126組比較，bP<0.05

Table 3 Comparison of the migration distance and the number of cells which have penetrated filter membrane among different cell groups

組別遷移距離(mm)細胞數(shù)量(個)對照組1.003±0.058164±3蟾蜍靈10nmol/L組0.993±0.058160±5蟾蜍靈25nmol/L組0.666±0.151a131±4a蟾蜍靈50nmol/L組0.460±0.100a83±2a蟾蜍靈100nmol/L組0.303±0.153a54±3aUO126組0.313±0.05856±2 蟾蜍靈100nmol/L+UO126組0.210±0.200b37±3bF值2157.060779.895P值<0.001<0.001

注：與對照組比較，aP<0.05;與UO126組比較，bP<0.05

3 討論

我國是食管癌高發(fā)國家，世界衛(wèi)生組織(WHO)調(diào)查資料顯示，我國食管癌患者占全球的47%[10]。目前傳統(tǒng)的食管癌治療方法主要是早期患者盡量采用手術(shù)治療并輔助放射治療，晚期患者則采用姑息治療即放化療相配合。近年來隨著化療藥物和分子靶向藥物的開發(fā)應(yīng)用、分子生物學(xué)的不斷發(fā)展以及學(xué)科之間綜合治療模式的研究進展，食管癌的治療效果較前有所提高，但患者總體預(yù)后仍然較差[11]。因此，尋找新的抗腫瘤藥物、研究抗腫瘤藥物作用的靶點及與食管癌發(fā)生發(fā)展相關(guān)的信號通路成為食管癌治療研究的重點。

ERK作為經(jīng)典的絲裂原活化的MAPK在腫瘤的發(fā)生中起了重要作用。Raf/MEK/ERK信號通路是MAPK信號通路的主要途徑[12]，參與細胞的生長、發(fā)育、增殖、分化、凋亡和惡性轉(zhuǎn)化，與腫瘤發(fā)生、發(fā)展存在不可忽視的聯(lián)系[13-15]，并在細胞的侵襲遷移方面發(fā)揮重要作用，人類腫瘤中約70%可見到該信號通路的異常激活。一些細胞因子、外界刺激物通過該途徑磷酸化激活ERK，活化的ERK將細胞外刺激信號傳至細胞內(nèi)，引起一系列細胞反應(yīng)，從而參與并調(diào)節(jié)細胞生長、發(fā)育及分裂。有研究表明，ERK信號通路中活化水平的改變與包括食管癌在內(nèi)的多種惡性腫瘤的發(fā)生發(fā)展有關(guān)[16]，因此該信號通路一直以來均是研究的焦點。為深入探討Raf/MEK/ERK信號通路的基因調(diào)控機制以及其生物學(xué)功能，本研究進一步深化了對食管癌發(fā)病機制的認(rèn)識，以便阻斷Raf/MEK/ERK信號通路的異常激活，抑制細胞異常增殖分化及腫瘤侵襲轉(zhuǎn)移。

蟾蜍靈(即蟾蜍素)是從中華大蟾蜍或黑眶蟾蜍的耳后腺及皮膚腺的干燥分泌物中提取的主要活性成分之一，屬于強心苷類物質(zhì)[4, 17]，也是當(dāng)今用于臨床藥物治療卵巢癌[18]、肺癌[19-20]、前列腺癌[21]、肝癌[22-23]等惡性腫瘤的注射用藥華蟾素的有效成分之一，其在臨床應(yīng)用方面已取得令人矚目的成績。本實驗通過觀察蟾蜍靈對食管癌Raf/MEK/ERK信號通路的抑制作用證實，蟾蜍靈可通過抑制Raf/MEK/ERK信號通路活化下調(diào)細胞內(nèi)p-Raf-1、p-MEK、p-ERK表達量，從而阻斷ERK信號通路的異常傳導(dǎo)，對食管癌細胞的增殖分化、侵襲轉(zhuǎn)移具有明顯的抑制作用。本研究結(jié)果表明，ERK信號通路的異常傳導(dǎo)導(dǎo)致Raf、MEK、ERK的過度激活是影響腫瘤生長與侵襲轉(zhuǎn)移的關(guān)鍵，而蟾蜍靈可顯著抑制Raf、MEK、ERK的活化，從而有效降低細胞內(nèi)p-Raf-1、p-MEK、p-ERK表達量，MEK/ERK磷酸化抑制劑UO126可增強其抑制作用。蟾蜍靈對食管癌增殖的這種抑制作用有效降低了食管癌的發(fā)生，并為食管癌的臨床治療提供了實驗基礎(chǔ)。在細胞遷移趨化方面，本實驗結(jié)果表明，蟾蜍靈可使食管癌細胞的遷移趨化能力明顯減弱，UO126同樣可增強其對細胞遷移趨化作用的抑制，有力證實了蟾蜍靈在抑制食管癌侵襲轉(zhuǎn)移方面發(fā)揮重要作用，這為臨床治療食管癌提供了可靠的理論依據(jù)。

本實驗結(jié)果提示，蟾蜍靈可能是通過抑制Raf/MEK/ERK信號通路中蛋白的活化來發(fā)揮抑制腫瘤細胞增殖、侵襲、遷移等的作用。大量研究發(fā)現(xiàn)，信號轉(zhuǎn)導(dǎo)調(diào)節(jié)系統(tǒng)的異常在腫瘤發(fā)生發(fā)展、侵襲遷移過程中發(fā)揮重要作用[24-26]。Watabe等[27]研究發(fā)現(xiàn)，蟾蜍靈的抗腫瘤作用與MAPK信號通路的活化密切相關(guān)。亦有研究證實，蟾蜍靈可以抑制肝癌細胞的遷移[28]，但蟾蜍靈對食管癌細胞的抑制作用及其機制的研究報道甚少。本實驗研究證實，蟾蜍靈在食管癌發(fā)生發(fā)展、侵襲遷移過程中發(fā)揮抑制作用，為蟾蜍靈在食管癌方面的研究提供新的資料，對臨床治療食管癌提供了有力的實驗基礎(chǔ)與治療新動向，具有指導(dǎo)意義。

由于細胞凋亡及腫瘤的發(fā)生發(fā)展是一個多步驟、多因子參與的極其復(fù)雜的過程,本實驗僅在腫瘤的增殖和遷移方面進行了研究，蟾蜍靈誘導(dǎo)腫瘤細胞凋亡、抗癌的詳細機制及臨床受益程度尚不明確，仍需進一步深入研究。

[1]Han SJ,Wei WQ,Zhang ST,et al.Risk factors of esophageal cancer in a high-risk area in China[J].Chinese General Practice,2012，15(11)：3745.(in Chinese) 韓書婧，魏文強，張澍田，等.食管癌高發(fā)地區(qū)人群危險因素的調(diào)查研究[J].中國全科醫(yī)學(xué),2012，15(11)：3745.

[2]Hou JL.Clinical effectation of Shenqifuzheng injection combined with concurrent chemoradiotherapy in treating esophageal carcinoma[J].Chinese Journal of Coal Industry Medicine,2012,15(8)：1244-1246.(in Chinese) 侯激流.參芪扶正注射液在食管癌同步放化療中的作用[J].中國煤炭工業(yè)醫(yī)學(xué)雜志,2012,15(8)：1244-1246.

[3] Yue F,Jia T.Clinical observation of paclitaxel liposome and paclitaxel in the treatment of patients with advanced esophageal cancer[J].Pratical Journal of Cardiac Cerebral Pneumal and Vascular Disease,2010，18(10)：1474.(in Chinese) 岳峰，賈濤.紫杉醇脂質(zhì)體與紫杉醇治療晚期食管癌的療效研究[J].實用心腦肺血管病雜志,2010，18(10)：1474.

[4]Krenn L,Kopp B.Bufadienolides from animal and plant sources[J].Phytochemistry, 1988, 48(1):1-29.

[5]Hong SH,Kim GY,Chang YC,et al.Bufalin prevents the migration and invasion of T24 bladder carcinoma cells through the inactivation of matrix metalloproteinases and modulation of tight junctions[J].Int J Oncol,2013,42(1):277-286.

[6]Chen YY,Lu HF,Hsu SC,et al.Bufalin inhibits migration and invasion in human hepatocellular carcinoma SK-Hep1 cells through the inhibitions of NF-κB and matrix metalloproteinase-2/-9-signaling pathways [J].Environ Toxicol,2015,30(1):74-82.

[7]Zhu Z,Sun H,Ma G,et al.Bufalin induces lung cancer cell apoptosis via the inhibition of P13K/Akt pathway[J].In J Mol Sci,2012,13(2):2025-2035.

[8]Yin PH, Liu X, Qiu YY, et al.Anti-tumor activity and apoptosis-regulation mechanisms of bufalin in various cancers:new hope for cancer patients[J].Asian Pac J Cancer Prev，2012，13(11):5339-5343.

[9] Qiu DZ,Zhang ZJ,Wu WZ,et al.Bufalin, a component in Chansu, inhibits proliferation and invasion of hepatocellular carcinoma cells[J].BMC Complement Altern Med,2013,19(13):185.

[10]Zhang ZB, Zhu Y, Xi JF.The observation of clinical effect of docetaxel combinate cisplatin applied in advanced esophageal cancer[J].Modern Medicine Journal of China, 2014, 16(8):73-74.(in Chinese) 張志斌，朱艷，席俊峰.晚期食管癌應(yīng)用多西他賽聯(lián)合順鉑治療的臨床療效觀察[J].中國現(xiàn)代醫(yī)藥雜志，2014, 16(8):73-74.

[11]Hu Z, Zhou GS, Zhou GB.Molecular-targeted therapy for cancer[J].Chinese Medicinal Biotechnology，2010, 5(5):335-341.(in Chinese) 胡政，周桂生，周光飚.腫瘤的分子靶向治療[J].中國醫(yī)藥生物技術(shù)雜志，2010, 5(5):335-341.

[12]McCubrey JA,Steelman LS,Chappell WH,et al.Roles of the Raf/MEK/ERK pathway in cell growth, malignant transformation and drug resistance[J].Biochim Biophys Acta,2007,1773(8):1263-1284.

[13]Xu YB,Du QH,Zhang MY,et al.Propofol suppresses proliferation, invasion and angiogenesis by down-regulating ERK-VEGF/MMP-9 signaling in Eca-109 esophageal squamous cell carcinoma cells[J].Eur Rev Med Pharmacol Sci,2013,17(18):2486-2494.

[14]Li G,Mu ZY,Huang Y,et al.Anti-prostate cancer effect of carvacrol via MAPK signaling pathway[J].Academic Journal of Second Military Medical University,2014,35(3):285-290.(in Chinese) 李剛,穆中一,黃炎,等.香芹酚通過MAPK信號通路抗前列腺癌作用機制研究[J].第二軍醫(yī)大學(xué)學(xué)報,2014,35(3):285-290.

[15]Kim SO,Kim MR.Gingerol prevents disassembly of cell junctions and activities of MMPs in invasive human pancreas cancer cells through ERK/NF-κB/snail signal transduction pathway[J].Evid Based Complement Alternat Med,2013,2013:761852-761860.

[16]Zhao M,Liu YP,Liu SZ,et al.Expression and clinical significance of ERK in esophageal squamous cell carcinoma [J].Chinese Journal of Cancer Biotherapy,2011,18(5):447-449.(in Chinese) 趙萌,劉月平,劉世正,等.食管鱗狀細胞癌中ERK的表達及其臨床意義[J].中國腫瘤生物治療雜志,2011,18(5):447-449.

[17]Panesar NS.Bufalin and unidentified substance(s) in traditional Chinese medicine cross-react in commercial digoxin assay[J].Clin Chem,1992,38(10):2155-2156.

[18]Takai N,Kira N,Ishii T,et al.Bufalin, a traditional oriental medicine, induces apoptosis in human cancer cells[J].Asian Pac J Cancer Prev,2012,13(1):399-402.

[19]Zhu Z,Sun H,Ma G,et al.Bufalin induces lung cancer cell apoptosis via the inhibition of P12K/Akt pathway [J].Int Mol Sci,2012,13(2):2025-2035.

[20]Ding DW,Zhang YH,Huang XE,et al.Bufalin induces mitochondrial pathway-mediated apoptosis in lung adenocarcinoma cells[J].Asian Pac J Cancer Prev,2014,15(23):10495-10500.

[21]Yin PH,Liu X,Qiu YY,et al.Anti-tumor activity and apoptosis-regulation mechanisms of bufalin in various cancers:new hope for cancer patients[J].Asian Pac J Cancer Prev,2012,13(11):5339-5343.

[22]Tsai SC,Yang JS,Peng SF,et al.Bufalin increases sensitivity to AKT/mTOR-induced autophagic cell death in SK-HEP-1 human hepatocellular carcinoma cells[J].Int J Oncol,2012,41(4):1431-1442.

[23]Miao Q, Bi LL, Li X, et al.Anticancer effects of bufalin on human hepatocellular carcinoma HepG2 cells:roles of apoptosis and autophagy[J].Int J Mol Sci,2013,14(1):1370-1382.

[24]Zhao M,Liu YP,Liu SZ,et al.The role and significance of ERK and its activation in esophageal squamous cell carcinoma[J].Chinese Journal of Clinical and Experimental Pathology,2011,27(11):1037-1040.(in Chinese) 趙萌,劉月平,劉世正,等.食管鱗癌中ERK及其活化形式蛋白的表達及意義[J].臨床與實驗病理學(xué)雜志,2011,27(11):1037-1040.

[25]Li F,Wang H,Niu GL,et al.Effect of curcumin on radiosensitization of breast cancer cell MDA-MB-231[J].China Journal of Modern Medicine,2013,23(35):33-37.(in Chinese) 李峰,王輝,牛國梁,等.姜黃素對乳腺癌MDA-MB-231細胞株放射增敏作用的研究[J].中國現(xiàn)代醫(yī)學(xué)雜志,2013,23(35):33-37.

[26]Wang X,Gao P,Lin F,et al.Wilms′ tumour suppressor gene 1(WT1) is involved in the carcinogenesis of lung cancer through interaction with PI3K/Akt pathway[J].Cancer Cell Int,2013,13(1):114.

[27]Watabe M,Masuda Y,Nakajo S,et al.The cooperative interaetion of two different signaling pathways in response to bufalin induces apoptosis in human leukemia U937 cells[J].J Biol Chem,1996,271(24):14067-14072.

[28]Gai JQ,Qin JM,Fan YZ,et al.Bufalin inhibits and invasion of cancer cells proliferation human liver[J].World Chinese Journal of Digestology,2014,22(14):1921-1927.(in Chinese) 蓋吉欽,秦建民,范躍祖,等.蟾毒靈對人肝癌細胞增殖與侵襲的影響[J].世界華人消化雜志,2014,22(14):1921-1927.

(本文編輯：陳素芳)

Mechanism of Bufalin Affecting the Proliferation and Migration of Human Esophageal Carcinoma Cells Through Inhibiting the Activity of Raf/MEK/ERK Pathway

DINGYan,WANGXiao-ling,DENGHui-yan,etal.

DepartmentofPathology,theFourthHospitalofHebeiMedicalUniversity,Shijiazhuang050011,China

Objective To explore the mechanism of Bufalin affecting the proliferation and migration of human esophageal carcinoma cells through inhibiting the activity of Raf/MEK/ERK pathway.Methods The esophageal carcinoma cell lines TE13 were divided into control group, bufalin 10 nmol/L group, bufalin 25 nmol/L group, bufalin 50 nmol/L group, bufalin 100 nmol/L group, Uo126 group and bufalin 100 nmol/L+UO126 group, Western blotting and immunocytochemistry were performed to detect the expression quantities of Raf-1/p-Raf-1, MEK/p-MEK and ERK/p-ERK in different groups of TE13 cells, and positive expression rates of Raf-1/p-Raf-1, MEK/p-MEK and ERK/p-ERK were calculated.Wound Healing assay and Boyden cabin experiment were used to explore the cell migration distance in different cell groups and the number of cells which had penetrated filter membrane.Results The expression quantities of p-Raf-1 and p-ERK in bufalin 25 nmol/L group, bufalin 50 nmol/L group and bufalin 100 nmol/L group were significantly fewer than those in control group, respectively(P<0.05).The expression quantities of p-MEK in bufalin 50 nmol/L group and bufalin 100 nmol/L group were significantly fewer than those in control group, respectively(P<0.05).The expression quantities of p-Raf-1, p-MEK and p-ERK in bufalin 100 nmol/L+UO126 group were significantly fewer than those in UO126 group, respectively(P<0.05).The positive expression rates of p-Raf-1 and p-ERK in bufalin 25 nmol/L group, bufalin 50 nmol/L group and bufalin 100 nmol/L group were significantly lower than those in control group, respectively(P<0.05).The positive expression rates of p-MEK in bufalin 50 nmol/L group and bufalin 100 nmol/L group were significantly lower than those in control group, respectively(P<0.05).The positive expression rates of p-Raf-1, p-MEK and p-ERK in bufalin 100 nmol/L+UO126 group were significantly lower than those in control group, respectively(P<0.05).According to results of Wound Healing assay, the cell migration distance in bufalin 25 nmol/L group, bufalin 50 nmol/L group and bufalin 100 nmol/L group was significantly shorter than that in control group, respectively(P<0.05)；the cell migration distance in bufalin 100 nmol/L+UO126 group was significantly shorter than that in UO126 group(P<0.05).According to results of Boyden cabin experiment, the number of cells which had penetrated filter membrane in bufalin 25 nmol/L group, bufalin 50 nmol/L group and bufalin 100 nmol/L group was significantly fewer than that in control group(P<0.05)；the number of cells which had penetrated filter membrane in bufalin 100 nmol/L+UO126 group was significantly fewer than that in UO126 group(P<0.05).Conclusion Bufalin can reduce the expression quantities of p-Raf-1, p-MEK and p-ERK.Bufalin may inhibit esophageal carcinoma cells growth though inhibiting the activity of Raf/MEK/ERK pathway.Bufalin can inhibit the migration and chemotaxis of human esophageal carcinoma cell lines TE13.

Esophageal neoplasms；Bufalin；Mitogen-activated protein kinase；Cell proliferation；Cell movement

國家自然科學(xué)基金青年基金資助項目(81303271)；河北省衛(wèi)生廳2013年醫(yī)學(xué)科學(xué)研究課題計劃(20130545)

050011 河北省石家莊市，河北醫(yī)科大學(xué)第四醫(yī)院病理科

劉月平，050011 河北省石家莊市，河北醫(yī)科大學(xué)第四醫(yī)院病理科；E-mail：annama@163.com

R 571

A

10.3969/j.issn.1007-9572.2015.21.010

2014-12-10；

2015-03-17)