中青年復(fù)發(fā)性腦梗死與亞甲基四氫葉酸還原酶基因多態(tài)性相關(guān)性研究

李曉華,張 偉,董 齊，邵會(huì)權(quán)

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·論著·

中青年復(fù)發(fā)性腦梗死與亞甲基四氫葉酸還原酶基因多態(tài)性相關(guān)性研究

李曉華,張 偉,董 齊，邵會(huì)權(quán)

目的 探討亞甲基四氫葉酸還原酶(MTHFR)基因C677T位點(diǎn)多態(tài)性與中青年復(fù)發(fā)性腦梗死(RIS)的關(guān)系。方法 選取2010年1月—2014年8月齊齊哈爾醫(yī)學(xué)院附屬第三醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科收治的中青年RIS患者126例為復(fù)發(fā)組，另選擇同時(shí)期收治的首次發(fā)病的中青年腦梗死患者130例為首發(fā)組，采用聚合酶鏈反應(yīng)-限制片段長(zhǎng)度多態(tài)性法檢測(cè)分析MTHFR基因C677T位點(diǎn)多態(tài)性；采用高效液相色譜法測(cè)定血漿同型半胱氨酸(Hcy)水平，采用全自動(dòng)電化學(xué)發(fā)光免疫分析儀檢測(cè)血漿維生素B12、葉酸水平。結(jié)果 復(fù)發(fā)組患者高血壓病史、吸煙率均高于首發(fā)組(P<0.05)。兩組患者M(jìn)THFR基因C677T位點(diǎn)基因型分布比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；復(fù)發(fā)組患者T等位基因頻率較首發(fā)組升高(P<0.05)。復(fù)發(fā)組TT、CC基因型患者血漿Hcy水平較首發(fā)組TT、CC基因型患者升高(P<0.05)；兩組TC基因型患者血漿Hcy水平比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。兩組CT、CC基因型患者血漿維生素B12、葉酸水平比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；兩組TT基因型患者血漿維生素B12水平比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；復(fù)發(fā)組TT基因型患者血漿葉酸水平較首發(fā)組TT基因型患者降低(P<0.05)。結(jié)論 MTHFR基因TT基因型是中青年RIS的重要因素，TT基因型中青年RIS患者存在高Hcy及低葉酸，建議對(duì)此類患者應(yīng)盡早合理補(bǔ)充葉酸。

腦梗死；復(fù)發(fā)；亞甲基四氫葉酸還原酶；基因；多態(tài)性,單核苷酸

李曉華,張偉,董齊，等.中青年復(fù)發(fā)性腦梗死與亞甲基四氫葉酸還原酶基因多態(tài)性相關(guān)性研究[J].中國(guó)全科醫(yī)學(xué)，2015，18(21)：2516-2519.[www.chinagp.net]

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腦血管疾病具有高發(fā)病率、高致殘率、高病死率和高復(fù)發(fā)率等特點(diǎn)，據(jù)世界衛(wèi)生組織(WHO)評(píng)估，我國(guó)每年死于腦血管疾病者(約182萬(wàn)人)居聯(lián)合國(guó)192個(gè)成員國(guó)之首[1]。據(jù)《全國(guó)疾病監(jiān)測(cè)系統(tǒng)死因監(jiān)測(cè)數(shù)據(jù)集》分析，2006—2010年我國(guó)腦血管疾病死亡人數(shù)達(dá)452 906例(死亡率124.01/10萬(wàn))[2]。腦梗死是腦血管疾病中最常見(jiàn)類型，約占75%，其半年復(fù)發(fā)率為8.8%，1年復(fù)發(fā)率為6.0%，5年復(fù)發(fā)率為16.0%[3]?？梢?jiàn)復(fù)發(fā)性腦梗死(RIS)的發(fā)生率較高，且RIS的致死率、致殘率更高，預(yù)后更差。關(guān)于RIS危險(xiǎn)因素的研究日益成為熱點(diǎn)，且有不少學(xué)者將分子生物學(xué)技術(shù)和人類基因組引入到本領(lǐng)域的研究中。但隨著RIS發(fā)生的年輕化，關(guān)于中青年RIS基因水平的探討較為有限，本研究擬對(duì)本院收治的中青年RIS患者進(jìn)行亞甲基四氫葉酸還原酶(MTHFR)基因C677T位點(diǎn)檢測(cè)，分析了解MTHFR基因多態(tài)性與中青年RIS的關(guān)系。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 選取2010年1月—2014年8月齊齊哈爾醫(yī)學(xué)院附屬第三醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科收治的中青年RIS患者126例為復(fù)發(fā)組，其中男85例，女41例；年齡42～59歲，平均年齡(54.5±1.1)歲；平均復(fù)發(fā)時(shí)間(1.6±0.2)個(gè)月。另選擇同時(shí)期本院收治的首次發(fā)病的中青年腦梗死患者130例為首發(fā)組，其中男67例，女63例；年齡41～57歲，平均年齡(54.3±0.9)歲。兩組患者性別構(gòu)成比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=6.72，P=0.01)；兩組患者年齡比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=1.59，P=0.11)。

1.2 納入與排除標(biāo)準(zhǔn) 入選患者均符合《各類腦血管病診斷要點(diǎn)》(中華醫(yī)學(xué)會(huì)第四屆全國(guó)腦血管病學(xué)術(shù)會(huì)議)[4]，并經(jīng)顱腦CT或MRI檢查確診為腦梗死。RIS診斷標(biāo)準(zhǔn)：患者在原神經(jīng)缺失癥狀及體征好轉(zhuǎn)或消失后，超過(guò)1個(gè)月后再次出現(xiàn)同側(cè)或?qū)?cè)神經(jīng)缺失癥狀或體征，并經(jīng)顱腦CT或MRI檢查發(fā)現(xiàn)有新的病灶，同時(shí)排除其他原因引起的腦梗死[2]。根據(jù)2000年WHO人類年齡段劃分標(biāo)準(zhǔn)[5]：青年<44歲，中年45～59歲，故本次納入患者年齡需在18～59歲?；颊呔鶠樵诒镜鼐幼?20年者。

排除標(biāo)準(zhǔn)：近3個(gè)月服用維生素、葉酸、左旋多巴、利尿劑等藥物；嚴(yán)重器質(zhì)性疾病、自身免疫性疾病、感染性疾病；肝腎功能不全、甲狀腺疾病、消化不良、糖尿病、惡性腫瘤、血液系統(tǒng)疾?。粌山M間患者有一、二、三級(jí)血緣關(guān)系者。

1.3 方法 入選患者均于入院當(dāng)日22:00開(kāi)始禁食，次日8:00空腹時(shí)采集肘靜脈血9 ml，分3份于乙二胺四乙酸二鈉(EDTANa2)抗凝管中，其中2管2 ml，1管5 ml，并置于4 ℃冰箱內(nèi)保存待用。

1.3.1 MTHFR基因測(cè)定 (1)取2 ml靜脈血，于采血后 1 h內(nèi)3 500 r/min離心10 min(離心半徑13.5 cm)。用人全血DNA提取試劑盒(離心柱型，小量樣品，<1 ml，編號(hào)GK1042，上海捷瑞生物工程有限公司)提取DNA，操作按試劑盒說(shuō)明書進(jìn)行，并于-20 ℃保存。(2)應(yīng)用聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)法擴(kuò)增：應(yīng)用primer 5.0設(shè)計(jì)PCR擴(kuò)增引物，擴(kuò)增片段長(zhǎng)度為655 bp，PCR體系為25 μl；反應(yīng)條件為95 ℃預(yù)變性5 min，進(jìn)入循環(huán)，94 ℃變性30 s，60 ℃復(fù)性45 s，70 ℃延伸1 min，共36個(gè)循環(huán)，后72 ℃延伸10 min，4 ℃終止。(3)限制片段長(zhǎng)度多態(tài)性(RFLP)分析：20 μl反應(yīng)體系中加入2 μl酶切緩沖溶液，15 U HinfⅠ限制性內(nèi)切酶，1 μl去離子水補(bǔ)足至20 μl；在37 ℃恒溫箱中消化3 h后取出，采用紫外分光光度計(jì)和1%瓊脂糖凝膠檢測(cè)基因組DNA濃度、純度。

1.3.2 血漿同型半胱氨酸(Hcy)水平測(cè)定 取5 ml靜脈血，在取血后30 min完成如下操作，4 ℃、3 000 r/min離心10 min(離心半徑13.5 cm)，分離出上層血漿標(biāo)本置于-80 ℃保存；采用高效液相色譜儀(P1201依利特，大連依利特分析儀器有限公司)及熒光探測(cè)儀(LIFD230 激光誘導(dǎo)熒光檢測(cè)器，大連依利特分析儀器有限公司)測(cè)定血漿Hcy水平，質(zhì)控標(biāo)準(zhǔn)為Sigm公司提供的Hcy標(biāo)準(zhǔn)品。

1.3.3 血漿維生素B12、葉酸水平測(cè)定 取2 ml靜脈血，采用全自動(dòng)電化學(xué)發(fā)光免疫分析儀〔ELEC-SYC-2010，羅氏診斷產(chǎn)品(上海)有限公司〕檢測(cè)血漿維生素B12、葉酸水平。

2 結(jié)果

2.1 Hardy-Weinberg遺傳平衡定律檢測(cè) MTHFR基因C677T位點(diǎn)基因型分布在復(fù)發(fā)組與首發(fā)組均符合Hardy-Weinberg遺傳平衡定律(P>0.05)，具有群體代表性。

2.2 兩組患者高血壓病史及吸煙、飲酒率比較 復(fù)發(fā)組患者高血壓病史、吸煙率均高于首發(fā)組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；兩組患者飲酒率比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05，見(jiàn)表1)。

表1 兩組患者高血壓病史及吸煙、飲酒率比較〔n(%)〕

Table 1 Comparison of the rates of hypertension history,smoking and drinking rate between the two groups

組別例數(shù)高血壓病史吸煙飲酒復(fù)發(fā)組12692(73.0)50(39.7)44(34.9)首發(fā)組13079(60.8)36(27.7)34(26.2)χ2值4.334.122.32P值0.040.040.13

2.3 兩組患者M(jìn)THFR基因C677T位點(diǎn)基因型分布及等位基因頻率比較 兩組患者M(jìn)THFR基因C677T位點(diǎn)基因型分布比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；復(fù)發(fā)組患者T等位基因頻率較首發(fā)組升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05，見(jiàn)表2)。

表2 兩組患者M(jìn)THFR基因C677T位點(diǎn)基因型分布及等位基因頻率比較〔n(%)〕

Table 2 Comparison of genotype distribution and allele frequency of MTHFR gene C677T between the two groups

組別例數(shù)基因型CC CT TT 等位基因C T復(fù)發(fā)組12625(19.8)56(44.4)45(35.7)55(43.6)71(56.3)首發(fā)組13044(33.8)55(42.3)31(23.8)76(58.5)54(41.5)χ2值7.765.62P值0.020.02

2.4 兩組不同基因型患者血漿Hcy水平比較 復(fù)發(fā)組TT、CC基因型患者血漿Hcy水平較首發(fā)組TT、CC基因型患者升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；兩組TC基因型患者血漿Hcy水平比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05，見(jiàn)表3)。

Table 3 Comparison of plasma Hcy levels in patients with different genotypes between the two groups

組別TT例數(shù) HcyCT例數(shù) HcyCC例數(shù) Hcy復(fù)發(fā)組2531.3±8.35624.8±6.14522.1±5.5首發(fā)組4427.9±7.05523.4±5.13120.4±6.0t值3.501.842.39P值<0.010.070.02

注：Hcy=同型胱氨酸

2.5 兩組不同基因型患者血漿維生素B12、葉酸水平比較 兩組CT、CC基因型患者血漿維生素B12、葉酸水平比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；兩組TT基因型患者血漿維生素B12水平比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；復(fù)發(fā)組TT基因型患者血漿葉酸水平較首發(fā)組TT基因型患者降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05，見(jiàn)表4)。

3 討論

在腦梗死復(fù)發(fā)危險(xiǎn)因素中，高血壓、吸煙、飲酒已被多項(xiàng)研究表明是重要因素[6-7]。本研究中，復(fù)發(fā)組高血壓病史、吸煙率高于首發(fā)組，且復(fù)發(fā)組男性比例高于首發(fā)組。姜巖等[8]在對(duì)240例中青年腦梗死患者進(jìn)行復(fù)發(fā)危險(xiǎn)因素研究中發(fā)現(xiàn)，復(fù)發(fā)組高血壓病史、吸煙率、飲酒率均高于初發(fā)組(分別高出25.8%、10.0%、8.4%)。本研究中，兩組間性別構(gòu)成有差異，但是否構(gòu)成危險(xiǎn)因素有待下一步研究觀察。

本研究結(jié)果顯示，兩組間MTHFR基因C677T位點(diǎn)基因型分布有差異，且復(fù)發(fā)組T等位基因頻率高于首發(fā)組，說(shuō)明MTHER基因C677T位點(diǎn)基因突變?cè)赗IS發(fā)生中扮演了重要角色。MTHFR基因C677T位點(diǎn)是目前研究的熱點(diǎn)，位于重要的功能結(jié)構(gòu)區(qū)中，該突變位點(diǎn)在MTHFR基因的N端，可影響酶的耐熱性、活性變化[9]。

表4 兩組不同基因型患者血漿維生素B12、葉酸水平比較

杜麗麗等[10]在研究我國(guó)人群MTHFR基因分布情況時(shí)指出，MTHFR基因是Hcy代謝途徑中的關(guān)鍵酶，其C677T位點(diǎn)多態(tài)性與血脂水平有一定關(guān)系。本研究在MTHFR基因型與血漿Hcy水平關(guān)系的觀察中顯示，復(fù)發(fā)組TT基因型患者Hcy水平高于首發(fā)組。蔣萍等[11]在關(guān)于MTHFR基因多態(tài)性研究中指出，TT基因型患者的酶活性僅為正常的30%，因此TT基因型患者血漿Hcy水平明顯高于純合野生型CC基因型患者。陳星霖[12]在對(duì)比147例腦卒中患者與188例健康人時(shí)發(fā)現(xiàn)，病例組TT基因型和CT基因型患者血漿高Hcy檢出率明顯高于正常組，且Hcy水平TT基因型最高。

葉酸是從食物中提取出來(lái)的一種B族維生素，與維生素B12共同參與Hcy再甲基化過(guò)程[13-14]。本研究中，復(fù)發(fā)組TT基因型患者葉酸水平低于首發(fā)組，由于葉酸在Hcy代謝中的作用，其水平降低則易導(dǎo)致高Hcy，而高Hcy是RIS發(fā)生的重要因素?？梢?jiàn)，MTHRF基因C677T位點(diǎn)TT基因型者發(fā)生RIS可能性較大。

綜上所述，中青年RIS發(fā)生與MTHRF基因C677T位點(diǎn)的關(guān)系甚密，其中TT基因型者Hcy水平升高，并存在葉酸低水平的情況。因此，對(duì)初發(fā)腦梗死者進(jìn)行MTHFR基因篩選，并對(duì)TT基因型患者進(jìn)行葉酸干預(yù)，積極控制血壓、戒煙對(duì)預(yù)防中青年RIS的發(fā)生有積極意義。

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(本文編輯：陳素芳)

Correlation Between the Polymorphism of Methylenetetrahydrofolate Reductase Gene and Recurrent Cerebral Infarction in Young and Middle-aged People

LIXiao-hua,ZHANGWei,DONGQi,etal.

TheThirdAffiliatedHospitalofQiqiharMedicalSchool,Qiqihar161000,China

Objective To explore the relationship between methylenetetrahydrofolate reductase(MTHFR) C677T gene polymorphism and recurrent cerebral infarction in young and middle-aged people.Methods We enrolled 126 young and middle-aged patients with recurrent cerebral infarction who were admitted into the Neurology Department of the Third Affiliated Hospital of Qiqihar Medical School from January 2010 to August 2014 as relapse group.And another 130 young and middle-aged patients with first-episode cerebral infarction who were admitted into the hospital in the same period were enrolled as first-episode group.The polymerase chain reaction-restriction fragment length polymorphism(PCR-RFLP) method was used to analyze the MTHFR C677T gene polymorphism.Plasma total homocysteine(Hcy) level was measured using high performance liquid chromatography,and the level of vitamin B12and folic acid were measured by automatic electrochemiluminescence immunoassay analyzer.Results The relapse group was higher(P<0.05) than the first-episode group in the rate of patients with history of hypertension and smoking rate.Significant difference(P<0.05) was noted in the genotype distribution of MTHFR C677T gene between the two groups;the relapse group was higher(P<0.05) than the first-episode group in T-allele frequency.The relapse group was higher(P<0.05) than the first-episode group in Hcy level in patients with TT or CC genotype;the two groups were not significantly different(P>0.05) in Hcy level in patients with TC genotype.The two groups were not significantly different(P>0.05) in the levels of vitamin B12and folic acid in patients with CT or CC genotype;the two groups were not significantly different(P>0.05) in the level of vitamin B12in patients with TT genotype;the relapse group was lower than the first-episode group in the level of folic acid in patients with TT genotype.Conclusion TT genotype of MTHFR gene is an important factor for recurrent cerebral infarction in young and middle-aged people.Young and middle-aged people have high Hcy level,low vitamin B12level and low folic acid level.We suggest that group of patients supplement vitamin B12and folic acid in a rational way and as early as possible.

Brain infarction；Recurrence；Methylenetetrahydrofolate reductase；Genes；Polymorphism,single nucleotide

161000黑龍江省齊齊哈爾市，齊齊哈爾醫(yī)學(xué)院附屬第三醫(yī)院(李曉華,張偉，邵會(huì)權(quán))；哈爾濱醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院(董齊)

邵會(huì)權(quán)，161000 黑龍江省齊齊哈爾市，齊齊哈爾醫(yī)學(xué)院附屬第三醫(yī)院；E-mail：lxh004100@163.coms

R 743.33

A

10.3969/j.issn.1007-9572.2015.21.006

2014-10-21；

2015-06-08)