產蛋前期和產蛋期鵝HPG軸OAZ1和OAZ2基因表達的研究

馬 容，康 波，姜冬梅，何 琿

(四川農業(yè)大學 動物科技學院，四川 雅安 625014)

產蛋前期和產蛋期鵝HPG軸OAZ1和OAZ2基因表達的研究

馬 容，康 波，姜冬梅，何 琿

(四川農業(yè)大學 動物科技學院，四川 雅安 625014)

【目的】 探討產蛋前期和產蛋期鵝HPG軸中OAZ1和OAZ2基因表達的差異?！痉椒ā?選取健康的產蛋前期和產蛋期四川白鵝母鵝各3只，采集下丘腦、垂體和卵巢組織樣品，提取總RNA并反轉錄合成cDNA，應用實時熒光定量PCR檢測產蛋前期和產蛋期四川白鵝下丘腦、垂體、卵巢組織中OAZ1和OAZ2基因的相對表達量?！窘Y果】 在產蛋前期和產蛋期四川白鵝下丘腦、垂體和卵巢組織中，OAZ1和OAZ2基因均有表達，并且產蛋期OAZ1和OAZ2表達量均極顯著高于產蛋前期(P<0.01)，產蛋期四川白鵝下丘腦、垂體和卵巢中OAZ1的表達量分別是產蛋前期的1.79倍(P<0.01)、2.96倍(P<0.01)和3.48倍(P<0.01)；產蛋期四川白鵝下丘腦、垂體和卵巢中OAZ2的表達量分別是產蛋前期的2.66倍(P<0.01)、1.38倍(P<0.01)和2.03倍(P<0.01)?！窘Y論】OAZ1和OAZ2可在HPG軸的各級水平發(fā)揮其調控鵝繁殖過程的功能，OAZ1主要參與卵巢功能的調控，而OAZ2主要參與下丘腦功能的調控。

四川白鵝；鳥氨酸脫羧酶抗酶1(OAZ1)；鳥氨酸脫羧酶抗酶2(OAZ2)；多胺；下丘腦-垂體-性腺軸；實時熒光定量PCR

多胺作為廣泛存在于動物機體中的一類低分子脂肪族陽離子化合物，在細胞周期、基因表達、胚胎發(fā)育、細胞生長和分化中起著至關重要的作用[1-2]。鳥氨酸脫羧酶(Ornithine decarboxylase,ODC)是多胺生物合成途徑的關鍵限速酶，對維持細胞內多胺水平的穩(wěn)定有重要作用，其活性可在轉錄、翻譯和翻譯后被精確調控[3]。鳥氨酸脫羧酶抗酶(Ornithine decarboxylase antizyme,OAZ)是多胺誘導的一種能負調控細胞多胺水平的蛋白酶[4]。研究表明，目前已發(fā)現(xiàn)的OAZ家族共包括4個成員，即OAZ1、OAZ2、OAZ3和OAZ4。OAZ1作為OAZ家族中最早被發(fā)現(xiàn)的成員，是目前研究最為廣泛的鳥氨酸脫羧酶抗酶。研究發(fā)現(xiàn)，OAZ1可與ODC結合并介導26S蛋白酶體降解ODC，從而負調控細胞內的多胺水平[5]。OAZ1還可以調節(jié)細胞周期，影響細胞凋亡；此外，OAZ1還具有抗腫瘤效應[6]。近年來的研究表明，OAZ1還可參與動物繁殖的調節(jié)，An等[7]研究發(fā)現(xiàn)，多胎(3羔)奶山羊卵巢組織中OAZ1基因的表達量顯著高于單胎奶山羊，提示OAZ1可能促進奶山羊的卵泡發(fā)育和排卵。而在家禽方面，Kang等[8]研究表明，產蛋期籽鵝卵巢組織中OAZ1表達量顯著高于產蛋前期，提示OAZ1可能參與鵝產蛋過程的調節(jié)。目前，關于OAZ1調節(jié)細胞周期和抗腫瘤方面的研究很多，而關于OAZ1調節(jié)機體多胺水平，進而調節(jié)動物繁殖方面的研究甚少，尤其是OAZ1對鵝繁殖方面的調控機制尚不清楚。OAZ2與OAZ1的結構和組織分布相似，但表達量相對較少。在體外，OAZ2不能促使蛋白酶體降解ODC，但仍能抑制ODC活性和多胺的攝?。辉隗w內，OAZ2不僅能促使蛋白酶體降解ODC，也能抑制ODC活性及動物對多胺的攝取[9]?？傊?，OAZ2也可通過降低ODC活性從而降低多胺的水平[10]。劉夢瑤等[11]研究表明，在B16-F1細胞中高表達OAZ2將使細胞阻滯于G0/G1期，說明OAZ2也能調節(jié)細胞周期。然而，OAZ2是否也具有調節(jié)動物繁殖功能的作用尚不清楚。動物生殖系統(tǒng)的發(fā)育和功能的維持受到下丘腦-垂體-性腺軸(Hypothalamic-pituitary-gonadal axis,HPG)的調控。因此，本研究定量檢測四川白鵝產蛋前期和產蛋期下丘腦、垂體、卵巢組織中OAZ1和OAZ2基因的表達量，旨在闡明OAZ1和OAZ2在四川白鵝不同繁殖階段HPG軸的表達差異，為探明OAZ1和OAZ2基因功能和提高鵝產蛋性能的研究奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 樣品的采集

選取健康的產蛋前期和產蛋期四川白鵝母鵝各3只，采集下丘腦、垂體和卵巢組織樣品，液氮冷凍后，置于-80 ℃冰箱中保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 引物的設計及合成

根據四川農業(yè)大學動物生理實驗室克隆獲得的OAZ1和OAZ2編碼區(qū)序列，應用Oligo 6.0和Primer 5.0設計OAZ1和OAZ2基因特異性引物；同時根據NCBI中原雞和火雞的編碼區(qū)序列設計內參基因β-actin的引物。引物由上海生工合成，其序列信息見表1。

1.3 總RNA提取及cDNA的合成

根據Trizol試劑盒的操作說明，提取四川白鵝產蛋前期和產蛋期各組織樣品的總RNA。取5 μL總RNA樣品，用10 g/L瓊脂糖凝膠電泳檢測總RNA質量。參照M-MLV first strand cDNA Synthesis Kit (Invitrogen)說明書反轉錄合成cDNA 第一鏈。反轉錄體系為20 μL，先將總RNA 5 μL、 1 μL Oligo (dT)18(500 μg/mL)、1 μL dNTP混合物(10 mmol/L)、滅菌去離子水5 μL于70 ℃反應5 min，然后迅速置于冰上2 min；再加入4 μL的5×Buffer、1 μL的RNasin(40 U/μL)和2 μL的DTT(0.1 mol/L)混勻，37 ℃ 2 min，之后加入1 μL的M-MLV(200 U/μL)混勻，37 ℃ 50 min，70 ℃ 15 min，然后終止反應，將獲得的cDNA模板保存于-20 ℃冰箱中。

1.4 目的片段的PCR擴增

以合成的cDNA為模板進行PCR擴增，總體積20 μL，滅菌去離子水8.0 μL，上游引物(10 μmol/L)0.5 μL，下游引物(10 μmol/L) 0.5 μL，cDNA模板(50 ng/μL)1.0 μL，TaqDNA 聚合酶(5 U/μL)10.0 μL。PCR 反應程序為：94 ℃變性5 min；95 ℃變性10 s，62 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，35個循環(huán)。反應結束后，取5 μL PCR產物用于電泳檢測，確認PCR反應產物大小與目的片段是否一致。

1.5 OAZ1和OAZ2表達量的實時熒光定量PCR檢測

實時熒光定量PCR的反應體系為50 μL：模板cDNA 1 μL，SYBR?Premix Ex TaqTM(2×)25 μL，上、下游引物(10 μmol/L)各1 μL，RNase Free水補充至50 μL。循環(huán)參數(shù)為：94 ℃預變性10 s；94 ℃變性5 s，65 ℃退火30 s，72 ℃延伸20 s(采集熒光信號)，45個循環(huán)，并繪制溶解曲線。每個樣品進行3次重復，用β-actin作為內參基因，采用2-ΔΔCt法處理數(shù)據，計算產蛋前期和產蛋期四川白鵝下丘腦、垂體、卵巢組織OAZ1和OAZ2的相對表達量。

1.6 數(shù)據分析

應用SAS 9.2統(tǒng)計分析軟件中的MEANS程序進行描述性統(tǒng)計分析，用ANOVA程序進行方差分析和Duncan’s多重比較。OAZ1和OAZ2的相對表達量結果用“平均值±標準差 (Mean±SD)”表示。

2 結果與分析

2.1 四川白鵝總RNA提取及目的基因的PCR擴增

圖1顯示，四川白鵝卵巢總RNA的28S和18S rRNA條帶清晰，并且28S和18S rRNA的條帶亮度比值為(1～2)∶1。下丘腦和垂體組織總RNA質量與卵巢一致(圖略)。圖2顯示，以卵巢cDNA為模板進行PCR擴增，PCR產物經15 g/L瓊脂糖凝膠電泳獲得了β-actin(222 bp)、OAZ1(142 bp)、OAZ2(142 bp)的基因片段，擴增片段的長度與預期結果一致，而且特異性較好。下丘腦和垂體組織的PCR結果與卵巢一致(圖略)。結果表明，試驗合成的不同組織的cDNA可以用于后續(xù)的實時熒光定量PCR檢測。

圖1 四川白鵝卵巢總RNA
Fig.1 Total RNA in ovary of Sichuan white goose

圖2 四川白鵝卵巢組織β-actin、OAZ1和OAZ2基因的PCR擴增結果Marker.DL 2000 DNA Marker
Fig.2 PCR amplification ofOAZ1,OAZ2 andβ-actingenes in ovary of Sichuan white goose

2.2 四川白鵝HPG軸中OAZ1和OAZ2基因的相對表達量

圖3顯示，產蛋期四川白鵝下丘腦、垂體和卵巢組織中OAZ1和OAZ2表達量均極顯著高于產蛋前期(P<0.01)，分別是產蛋前期的1.79和2.66倍；2.96和1.38倍；3.48和2.03倍。

3 討 論

動物繁殖涉及細胞遷移、增殖、分化和死亡等過程。多胺廣泛存在于動物機體中，參與細胞生長和分化的調節(jié)。Pietila等[12]研究表明，適宜濃度的多胺可以促進小鼠卵泡發(fā)育，而多胺過量將抑制卵泡的發(fā)育。多胺可通過與動物體內的多種生殖激素作用，從而參與動物繁殖功能的調節(jié)[13]。本研究發(fā)現(xiàn)，產蛋期四川白鵝下丘腦OAZ1和OAZ2的表達量極顯著高于產蛋前期，提示OAZ1和OAZ2可能通過抑制ODC活性，降低下丘腦中多胺的生物合成，進而參與四川白鵝繁殖功能的調節(jié)。研究表明，由卵巢分泌的雌激素需通過其受體的介導，從而發(fā)揮其調節(jié)基因表達的功能，而雌激素受體在包括下丘腦在內的腦內分布廣泛[14]。天然多胺可以促進雌激素受體和雌激素應答元件之間的識別[13]。故筆者推測下丘腦中高水平表達的OAZ1和OAZ2可降低多胺的合成，從而影響雌激素及其應答元件之間的識別，進而參與調控四川白鵝的繁殖功能。

促性腺激素(促黃體生成素和促卵泡激素)對卵泡發(fā)育及排卵有重要的調控作用。在大鼠卵巢中，促性腺激素可誘導ODC的活性[15]。在豬的卵泡顆粒細胞中，促性腺激素能通過cAMP上調ODC水平[16]。本研究結果表明，產蛋期四川白鵝垂體組織中OAZ1和OAZ2的表達量均極顯著高于產蛋前期，提示OAZ1和OAZ2可在垂體通過調節(jié)HPG途徑參與調控四川白鵝的繁殖功能，其可能的機制是：高水平的OAZ1和OAZ2均能抑制ODC活性，從而使體內多胺水平降低，影響垂體促性腺激素的分泌，進而調控四川白鵝的繁殖功能。

研究表明，處于發(fā)育時期的大鼠卵巢中ODC維持著較高的生物活性[17]。Bastida等[18]研究發(fā)現(xiàn)，促黃體生成素和人絨毛膜促性腺激素可提高雌鼠竇狀卵泡顆粒細胞中的ODC活性，表明ODC對動物卵泡發(fā)育具有調控作用。本研究結果顯示，OAZ1和OAZ2在產蛋期四川白鵝的卵巢組織中的表達量極顯著高于產蛋前期，這與Kang等[8]的研究結果相似，推測產蛋期卵巢組織中高表達的OAZ1和OAZ2可能抑制了ODC的活性，從而抑制多胺的生物合成，進而影響四川白鵝卵泡細胞的發(fā)育，提示OAZ1和OAZ2在產蛋期四川白鵝卵巢組織中的高水平表達可能與鵝的產蛋性能有關。宿甲子等[19]研究也表明，籽鵝產蛋期卵巢中OAZ1基因mRNA的相對表達量顯著高于產蛋前期，提示本研究中OAZ1可能通過調控卵泡的發(fā)育來影響四川白鵝的繁殖功能。另有研究表明，骨形態(tài)發(fā)生蛋白(Bone morphogenetic proteins,BMPs)能夠調控雌性哺乳動物的生殖能力，尤其是參與哺乳動物卵泡發(fā)生[20]。BMPs的作用可以被靶細胞中的下游信號分子Smad6抑制[21]。Ku等[22]研究表明，Smad6的轉錄激活需要OAZ作為輔因子，OAZ通過與Smad1/4形成復合物從而激活Smad6的轉錄，最終抑制BMPs通路。由此推測，在四川白鵝產蛋期卵巢中，高水平表達的OAZ1和OAZ2可能通過激活Smad6的轉錄，從而抑制BMPs通路，最終調控鵝卵泡的發(fā)育，影響四川白鵝的繁殖功能。

4 結 論

四川白鵝下丘腦、垂體、卵巢中均表達OAZ1和OAZ2，并且產蛋期下丘腦、垂體、卵巢組織中OAZ1和OAZ2的表達量均極顯著高于產蛋前期，說明OAZ1和OAZ2可在HPG軸的各級水平參與動物繁殖功能的調節(jié)，OAZ1主要參與卵巢功能的調控，而OAZ2主要參與下丘腦功能的調控。

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Expressions ofOAZ1 andOAZ2 genes in HPG axis of goose at pre-laying and laying stages

MA Rong,KANG Bo,JIANG Dong-mei,HE Hui

(CollegeofAnimalScienceandTechnology,SichuanAgriculturalUniversity,Ya’an,Sichuan625014,China)

【Objective】 This study aimed to explore the differences in expressions of ornithine decarboxylase antizyme 1 (OAZ1) and ornithine decarboxylase antizyme 2 (OAZ2) genes in the hypothalamic-pituitary-gonadal axis of Sichuan white geese at pre-laying and laying stages.【Method】 Healthy female Sichuan white geese at pre-laying and laying stages (n=3,respectively) were selected,and hypothalamic,pituitary and ovary tissues were collected.Total RNA was extracted and cDNA was synthesized.The expression levels ofOAZ1 andOAZ2 in hypothalamus,pituitary gland and ovary samples were determined by quantitative real-time PCR.【Result】OAZ1 andOAZ2 genes expressed in hypothalamus,pituitary and ovarian tissues of Sichuan white goose at both pre-laying and laying stages, and the expressions ofOAZ1 andOAZ2 at laying period were significantly higher than at pre-laying period (P<0.01).The expression levels ofOAZ1 mRNA in hypothalamus,pituitary and ovarian tissues of geese at laying stage were 1.79 (P<0.01),2.96 (P<0.01) and 3.48 (P<0.01) times of those for geese at pre-laying stage,respectively.The levels ofOAZ2 mRNA expression in hypothalamus,pituitary and ovarian tissue of geese at laying stage were 2.66 (P<0.01),1.38 (P<0.01) and 2.03 (P<0.01) times of those in geese at pre-laying stage,respectively.【Conclusion】OAZ1 andOAZ2 mediated the biological function of HPG axis.OAZ1 may play a more important role in ovary whileOAZ2 may play a more important role in hypothalamic.

Sichuan white goose;ornithine decarboxylase antizyme 1 (OAZ1);ornithine decarboxylase antizyme 2 (OAZ2);polyamines;hypothalamic-pituitary-gonadal axis;quantitative real-time PCR

2013-09-29

國家自然科學基金項目(31201798)；高等學校博士學科點專項科研基金項目(20105103120003)

馬 容(1990-)，女，四川內江人，在讀碩士，主要從事動物卵泡發(fā)育機理研究。E-mail:marong53@sina.com

姜冬梅(1978-)，女，黑龍江海林人，實驗師，主要從事環(huán)境生理研究。E-mail:jiangdm9277@163.com

時間:2015-01-05 08:59

10.13207/j.cnki.jnwafu.2015.02.033

S835;Q786

A

1671-9387(2015)02-0044-05

網絡出版地址:http://www.cnki.net/kcms/detail/61.1390.S.20150105.0859.033.html