預(yù)處理方式對(duì)昆蟲病原線蟲冷凍存活的影響

李春杰，王麗芳，潘鳳娟，許艷麗

(中國(guó)科學(xué)院 東北地理與農(nóng)業(yè)生態(tài)研究所 黑土區(qū)農(nóng)業(yè)生態(tài)院重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，黑龍江 哈爾濱 150081)

預(yù)處理方式對(duì)昆蟲病原線蟲冷凍存活的影響

李春杰，王麗芳，潘鳳娟，許艷麗

(中國(guó)科學(xué)院 東北地理與農(nóng)業(yè)生態(tài)研究所 黑土區(qū)農(nóng)業(yè)生態(tài)院重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，黑龍江 哈爾濱 150081)

【目的】 探討提高昆蟲病原線蟲冷凍存活能力的方法，以改進(jìn)昆蟲病原線蟲儲(chǔ)存技術(shù)。【方法】 以我國(guó)高寒地區(qū)分離、篩選出的高致病力昆蟲病原線蟲Heterorhabditisbacteriophora-HBN(HBN，45°45′N)和從美國(guó)引進(jìn)的同種不同品系昆蟲病原線蟲H.bacteriophora-NJ(NJ，40°13′N)為研究對(duì)象，在實(shí)驗(yàn)室條件下研究了不同預(yù)處理方式對(duì)2個(gè)品系線蟲冷凍存活率的影響?！窘Y(jié)果】 HBN經(jīng)過25 ℃ 7 d、10 ℃ 7 d、4 ℃ 7 d、25 ℃ 3 d 10 ℃ 3 d和25 ℃ 3 d 10 ℃ 3 d 4 ℃ 3 d的預(yù)處理后，于-4 ℃冷凍5 d時(shí)的存活率為86.1%～95.2%，顯著高于直接冷凍法(25 ℃ 0 d)的存活率17.7%，而NJ經(jīng)25 ℃ 3 d 10 ℃ 3 d 4 ℃ 3 d的預(yù)處理后，于-4 ℃冷凍5 d時(shí)的存活率為83.0%，顯著高于其他預(yù)處理(2.2%～58.5%)。【結(jié)論】 適當(dāng)?shù)念A(yù)處理可提高2個(gè)品系線蟲的冷凍存活率，但生活在不同地理緯度的同種線蟲(HBN和NJ)適于不同的馴化方式。

昆蟲病原線蟲；預(yù)處理；低溫馴化；冷凍儲(chǔ)存；存活率

昆蟲病原線蟲(Entomopathogenic nematode，EPN)是指體內(nèi)攜帶具有病原性的共生細(xì)菌，并能引起昆蟲致病的一類寄生性線蟲，它是昆蟲的重要天敵類群，已經(jīng)成功用于防治200余種害蟲[1]，且這種生物殺蟲劑具有廣闊的應(yīng)用前景。但昆蟲病原線蟲常溫儲(chǔ)存貨架期短，是其推廣應(yīng)用的主要障礙因素之一。線蟲在低溫下處于靜止休眠狀態(tài)，新陳代謝速度減慢，體能消耗減少，其存活率下降速度減慢，從而可延長(zhǎng)線蟲貨架期。所以，線蟲低溫儲(chǔ)存已成為當(dāng)前研究熱點(diǎn)，但適于低溫儲(chǔ)存的線蟲材料和儲(chǔ)存技術(shù)尚未解決。

低溫馴化過程能使線蟲產(chǎn)生保護(hù)性脫水，然后進(jìn)行低濕休眠。Grewal[2]認(rèn)為，低濕休眠利于昆蟲病原線蟲的長(zhǎng)期儲(chǔ)存。經(jīng)過低溫馴化后，線蟲的耐寒能力得到增強(qiáng)[3-6]，但耐寒能力的增強(qiáng)程度受不同低溫馴化方式的影響。蕪菁夜蛾斯氏線蟲(Steinernemafeltiae)經(jīng)過直接降溫馴化后，低溫存活率顯著提高；而嗜菌異小桿線蟲(Heterorhabditisbacteriophora)經(jīng)過階段性降溫馴化后，其低溫存活率增加幅度比直接降溫馴化后的增加幅度更大[7]。Grewal[2]研究表明，階段性降溫馴化方式使蘋小卷夜蛾斯氏線蟲(S.carpocapsae)和夜蛾斯氏線蟲(S.riobrave)所獲得的耐寒性較直接馴化更強(qiáng)。楊秀芬等[8]試驗(yàn)結(jié)果證實(shí),低溫誘導(dǎo)有助于培育夜蛾斯氏線蟲A54適應(yīng)0 ℃以上的低溫特性，但返回25 ℃培養(yǎng)2個(gè)侵染循環(huán)后這種特性有不同程度的丟失。

很多學(xué)者通過各種方法均提高了昆蟲病原線蟲暫時(shí)的耐寒性，而李春杰等[9]從我國(guó)高寒地區(qū)分離、篩選獲得的高致病力線蟲本身具有很好的耐寒性。根據(jù)該線蟲能在黑龍江省越冬的自然現(xiàn)象，其低溫儲(chǔ)存潛力及儲(chǔ)存條件已得到初步探索[10-13]。本研究以2個(gè)不同品系線蟲為材料，采用不同預(yù)處理方式，研究線蟲冷凍儲(chǔ)存前的預(yù)處理方式對(duì)冷凍后線蟲存活率的影響，進(jìn)而改善昆蟲病原線蟲儲(chǔ)存技術(shù)，以加快我國(guó)寒區(qū)高致病力線蟲的開發(fā)應(yīng)用速度。

1 材料與方法

1.1 材 料

Heterorhabditisbacteriophora-HBN(HBN)，從黑龍江省哈爾濱市(45°45′N)分離得到的昆蟲病原線蟲，低溫致死中溫度是-12.4 ℃，由加拿大線蟲博物館館長(zhǎng)郁慶教授鑒定為嗜菌異小桿線蟲哈爾濱品系。H.bacteriophora-NJ(NJ)，從美國(guó)新澤西州(40°13′N)引進(jìn)，也是市場(chǎng)上常用制劑中的線蟲，低溫致死中溫度為-6.1 ℃，相對(duì)HBN視為非耐寒線蟲。兩線蟲均保存于中國(guó)科學(xué)院東北地理與農(nóng)業(yè)生態(tài)研究所農(nóng)田有害生物控制學(xué)科組。

1.2 試驗(yàn)方法

所用線蟲均采用White-Trap法繁殖[14]，對(duì)新繁殖出來的感染期線蟲進(jìn)行不同溫度和時(shí)間的預(yù)處理。預(yù)處理方式有：A為25 ℃放置0 d (記為25 ℃ 0 d，下同)、B為25 ℃放置3 d (25 ℃ 3 d)、C為25 ℃放置7 d (25 ℃ 7 d)、D為10 ℃放置7 d (10 ℃ 7 d)、E為4 ℃放置7 d (4 ℃ 7 d)、F為25 ℃放置3 d然后10 ℃放置3 d (25 ℃ 3 d 10 ℃ 3 d)、G為25 ℃放置3 d然后10 ℃放置3 d然后再4 ℃放置3 d (25 ℃ 3 d 10 ℃ 3 d 4 ℃ 3 d)。分別取新繁殖出來的線蟲200 μL (107/mL)置于慢速定量濾紙片(北京天宇祥瑞科技有限公司)上，真空抽濾(此時(shí)水分與濾紙質(zhì)量比為10.7∶8.0)后放于0.3 mL離心管中進(jìn)行不同預(yù)處理，然后再經(jīng)歷-4 ℃的低溫冷凍，5 d后升溫至10 ℃保持24 h，于室溫放置1 h后，再將帶有線蟲的濾紙片置于裝有1 mL水的直徑為6 cm的培養(yǎng)皿中振蕩1 min，解剖鏡下調(diào)查線蟲存活率[15]。每種預(yù)處理10個(gè)離心管，試驗(yàn)重復(fù)3次。預(yù)處理過程中25 ℃采用恒溫培養(yǎng)箱(天津泰斯特儀器有限公司，DH6000A)控制，10，4和-4 ℃采用置于控溫冰箱(青島海爾股份有限公司，BCD-226ST V)內(nèi)。

1.3 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與分析

試驗(yàn)中所調(diào)查的原始數(shù)據(jù)經(jīng)Excel處理和SPSS 11.5軟件分析，計(jì)算所得存活率經(jīng)反正弦平方根轉(zhuǎn)換，然后采用單因素0.05水平方差分析(One-Way ANOVA)和LSD多重比較檢驗(yàn)各處理組間的差異顯著性。

2 結(jié)果與分析

由圖1可以看出，在25 ℃下分別預(yù)處理0，3和7 d，即隨著預(yù)處理時(shí)間的延長(zhǎng)，-4 ℃冷凍5 d后HBN和NJ的存活率下降速度逐漸減慢，并且HBN的下降速度較NJ更慢。25 ℃預(yù)處理7 d的HBN和NJ冷凍5 d時(shí)的存活率分別為93.0%和53.2%，顯著高于2個(gè)品系線蟲預(yù)處理0 d和3 d時(shí)的存活率(17.7%和35.5%，1.6%和2.2%)。

圖1 不同預(yù)處理方式對(duì)昆蟲病原線蟲冷凍存活率的影響
-◆-.HBN;-□-.NJ
Fig.1 Effect of different pretreatment methods on freezing survival of EPN

在25，10和4 ℃下均預(yù)處理7 d，隨著預(yù)處理溫度的降低，NJ冷凍5 d時(shí)的存活率逐漸下降，分別為53.2%，39.1%和11.0%，差異顯著，而HBN的存活率分別為93.0%，86.1%和94.1%，差異不顯著。

在25 ℃ 3 d、25 ℃ 3 d 10 ℃ 3 d和25 ℃ 3 d 10 ℃ 3 d 4 ℃ 3 d的預(yù)處理方式下，NJ冷凍5 d時(shí)的存活率逐漸增加，分別為2.2%，58.5%和83.0%，而HBN經(jīng)25 ℃ 3 d 10 ℃ 3 d和25 ℃ 3 d 10 ℃ 3 d 4 ℃ 3 d預(yù)處理的存活率分別為95.2%和94.1%，顯著高于25 ℃ 3 d處理(35.4%)。

25 ℃ 0 d即直接冷凍的2個(gè)品系線蟲-4 ℃冷凍5 d時(shí)的存活率最低，HBN為17.7%，NJ為 1.6%。對(duì)于HBN而言，除25 ℃ 0 d和25 ℃ 3 d的預(yù)處理外，經(jīng)其他5種方式預(yù)處理后-4 ℃冷凍5 d時(shí)的存活率差異均不顯著(86.1%～95.2%)；而NJ線蟲只有25 ℃ 3 d 10 ℃ 3 d 4 ℃ 3 d預(yù)處理(83.0%)顯著高于其他所有預(yù)處理方式。

綜上所述，預(yù)處理方式對(duì)2個(gè)品系線蟲的冷凍存活率有很大影響，并且所有預(yù)處理方式均可提高HBN線蟲于-4 ℃冷凍5 d后的存活率，預(yù)處理時(shí)間對(duì)HBN線蟲冷凍存活的影響比預(yù)處理溫度更明顯，只要預(yù)處理時(shí)間達(dá)到足夠長(zhǎng)(6～7 d)，其存活率較直接冷凍法(25 ℃ 0 d)顯著提高；而NJ對(duì)預(yù)處理溫度和預(yù)處理時(shí)間均很敏感。根據(jù)2個(gè)品系線蟲在-4 ℃冷凍5 d時(shí)的存活率，HBN選擇25 ℃ 7 d、10 ℃ 7 d、4 ℃ 7 d、25 ℃ 3 d 10 ℃ 3 d和25 ℃ 3 d 10 ℃ 3 d 4 ℃ 3 d的預(yù)處理方式均有助于增強(qiáng)其冷凍存活能力，而對(duì)于NJ線蟲選用25 ℃ 3 d 10 ℃ 3 d 4 ℃ 3 d的預(yù)處理方式最適于提高-4 ℃的冷凍存活能力?？梢酝茰y(cè)生活在不同緯度的同種線蟲(HBN和NJ)對(duì)不同預(yù)處理溫度適應(yīng)能力表現(xiàn)出明顯不同。

3 討 論

3.1 低溫脅迫對(duì)不同線蟲品種(系)存活的影響

昆蟲病原線蟲對(duì)低溫的抵御能力，在不同種屬間，同一種的不同地理種群間，甚至同一個(gè)體的不同發(fā)育階段都存在差異。不同種屬的昆蟲病原線蟲對(duì)低溫脅迫表現(xiàn)出不同的耐受能力，這首先取決于其遺傳特性[16]。Brown和Gaugler[7]對(duì)異小桿科(Heterorhabditidae)和斯氏科(Steinernematidae)線蟲的冷凍耐受力研究發(fā)現(xiàn)，經(jīng)過相同條件的冷凍處理后，嗜菌異小桿線蟲(H.bacteriophora)、S.anomali和蕪菁夜蛾斯氏線蟲(S.feltiae)的存活率分別為55.3%，73.6%和92.8%，差異明顯。本研究中經(jīng)不同預(yù)處理后-4 ℃冷凍HBN和NJ 2個(gè)品系線蟲5 d時(shí)的存活率差異明顯，說明同種不同品系的昆蟲病原線蟲對(duì)冷凍的耐受能力明顯不同。這可能與其最初的自然生長(zhǎng)環(huán)境有關(guān)[17]。Smith等[18]比較了自由生活線蟲南極大衛(wèi)全凹線蟲(Panagrolaimusdavidi)、全齒復(fù)活線蟲(Panagrellusredivivus)，植物寄生線蟲鱗球莖線蟲(Ditylenchusdipsaci)和昆蟲病原線蟲蘋小卷夜蛾斯氏線蟲(S.carpocapsae)于-15 ℃的冷凍存活率，發(fā)現(xiàn)生活在南極的自由生活線蟲P.davidi的存活率最高。金永玲等[19]認(rèn)為，線蟲的地理起源對(duì)線蟲的生存溫度需求是非常重要的。本研究中，從黑龍江省哈爾濱市分離的線蟲H.bacteriophora-HBN(HBN)經(jīng)不同預(yù)處理后于-4 ℃冷凍5 d的存活率均高于從美國(guó)引進(jìn)的H.bacteriophora-NJ(NJ)線蟲，主要可能是由于2個(gè)品系線蟲的自然棲息地不同，使得其生態(tài)適應(yīng)性不同，也可能是長(zhǎng)期進(jìn)化的結(jié)果，導(dǎo)致HBN對(duì)低溫脅迫的耐受能力強(qiáng)于NJ。

3.2 低溫馴化對(duì)線蟲冷凍存活的影響

Burman等[20]認(rèn)為，通過長(zhǎng)期的某種環(huán)境馴化可能會(huì)使線蟲適應(yīng)不同的溫度范圍。研究發(fā)現(xiàn)經(jīng)過低溫馴化后，線蟲的耐寒能力得到增強(qiáng)，但耐寒能力的增強(qiáng)程度受到不同低溫馴化方式的影響[2]。從本研究2個(gè)品系線蟲冷凍前的預(yù)處理結(jié)果可以看出，HBN和NJ的冷凍存活率對(duì)不同預(yù)處理溫度和時(shí)間的反映不同，但適當(dāng)?shù)牡蜏伛Z化利于這2個(gè)品系線蟲的冷凍存活。原因可能是未冷凍前的預(yù)處理過程使線蟲體內(nèi)積累了相關(guān)抗凍物質(zhì)，如海藻糖和抗凍蛋白等[21]，以應(yīng)對(duì)即將到來的低溫。

線蟲在低溫馴化過程中，利用其特定的發(fā)育階段來抵御不良的環(huán)境脅迫。Wharton等[21-22]指出，H.zealandica的殼能預(yù)防無(wú)害的結(jié)冰，能允許最大限度的溫度達(dá)-32 ℃，該線蟲有過冷卻現(xiàn)象，即在冰點(diǎn)以下保持體液流動(dòng)的能力。昆蟲病原線蟲的侵染期線蟲是3齡幼蟲包在2齡幼蟲脫下的體鞘內(nèi)，其體鞘起著重要的保護(hù)作用。關(guān)于線蟲HBN和NJ對(duì)低溫馴化過程中的生理生化反應(yīng)及分子水平研究，還有待于下一步的深入挖掘。

志謝：感謝美國(guó)Rutgers大學(xué)王義老師在試驗(yàn)過程中的幫助！

[1] Gaugler R.Entomopathogenic nematology [M].Wallingford:CABI Publishing,2002.

[2] Grewal P S.Enhanced ambient storage stability of an entomopathogenic nematode through anhydrobiosis [J].Pest Mana-gement Science,2000,56(5):401-406.

[3] Ash C P J,Atkinson H J.Nematodirus battus:Development of cold hardiness in dormant eggs [J].Experiment Parasitology,1986,62:24-28.

[4] Forge D J,Macguidwin A E.Cold hardening ofMeloidogynehaplasecond stage juveniles [J].Journal of Nematology,1990,22:101-105.

[5] Smith H J.Preconditioning ofTrichinellaspiralisnativa juveniles in musculature to low temperatures [J].Veterinary Parasitology,1984,17:85-90.

[6] Smith H J.Factors affecting preconditioning ofTrichinellaspi-ralisnativa juveniles in musculature to low temperatures [J].Canadian Journal of Veterinary Research,1987,51:169-173.

[7] Brown I M,Gaugler R.Cold tolerance of Steinernematid and Heterorhabditid nematodes [J].Journal of Thermal Biology,1996,21(2):115-121.

[8] 楊秀芬，楊懷文，簡(jiǎn) 恒，等.低溫誘導(dǎo)培養(yǎng)對(duì)夜蛾斯氏線蟲A54品系適低溫特性的影響 [J].植物保護(hù)，1999，25(3)：8-10．

Yang X F,Yang H W,Jian H,et al.Influence of the induced culture ofSteinernemafeltiaeA54 strain in cold condition on its low temperature adaptability [J].Plant Protection,1999,25(3):8-10.(in Chinese)

[9] 李春杰，譚國(guó)忠，王 義，等．黑龍江省昆蟲病原線蟲資源和越冬情況調(diào)查初報(bào) [J].植物保護(hù)， 2011，37(2)：120-123.

Li C J,Tan G Z,Wang Y,et al.Occurrence of entomopathogenic nematodes resources and overwintering conditions in Heilongjiang Province [J].Plant Protection,2011,37(2):120-123.(in Chinese)

[10] 譚國(guó)忠.北方寒區(qū)昆蟲病原線蟲越冬條件研究 [D].哈爾濱：東北農(nóng)業(yè)大學(xué)，2008.

Tan G Z.Study on entomopathogenic nematode overwinter in cold zone of northern [D].Harbin:Northeast Agricultural University,2008.(in Chinese)

[11] 王麗芳．寒區(qū)昆蟲病原線蟲耐寒性和生存策略 [D].哈爾濱：中國(guó)科學(xué)院東北地理與農(nóng)業(yè)生態(tài)研究所，2010.

Wang L F.Cold tolerance and survival strategy of entomopathogenic nematodeHeterorhabditisbacteriophora-ZT in Heilongjiang Province [D].Harbin:Northeast Institute of Geography and Agroecology of Chinese Academy of Sciences,2010.(in Chinese)

[12] 李春杰.寒區(qū)昆蟲病原線蟲低溫儲(chǔ)存條件及耐寒機(jī)制研究 [D].哈爾濱：東北農(nóng)業(yè)大學(xué)，2011.

Li C J.Cryogenic storage conditions and cold tolerance mechanism of the entomopathogenic nematode in cold regions [D].Harbin:Northeast Agricultural University,2011.(in Chinese)

[13] 李春杰，許艷麗.一種用于寒區(qū)嗜菌異小桿昆蟲病原線蟲冷凍儲(chǔ)存方法：中國(guó)，ZL 200910071751.1 [P].2009-04-09.

Li C J，Xu Y L.The method of refrigerated storage ofHeterorhabditisbacteriophorafrom the cold region,Heilongjiang Province：China,ZL200910071751.1 [P].2009-04-09.(in Chinese)

[14] White G F.A method for obtaining infective nematode larvae from cultures [J].Science,1927,66:302-303.

[15] Jagdale G B,Grewal P S.Acclimation of entomopathogenic nematodes to novel temperatures:Trehalose accumulation and the acquisition of thermotolerance [J].International Journal for Parasitology,2003,33:145-152.

[16] 曹翠玲，劉 倩，簡(jiǎn) 恒，等．昆蟲病原線蟲對(duì)非生物脅迫的響應(yīng)機(jī)制 [J].昆蟲學(xué)報(bào)，2009，52(3)：312-318.

Cao C L,Liu Q,Jian H,et al.Response mechanisms of entomo-pathogenic nematode to abiotic stress [J].Acta Entomologica Sinica,2009,52(3)：312-318.(in Chinese)

[17] Strauch O,Niemann I,Neumann A,et al.Storage and formulation of the entomopathogenic nematodesHeterorhabditisindicaandH.bacteriophora[J].Biocontrol，2000,45(4):483-500.

[18] Smith T,Wharton D A,Marshall C J.Cold tolerance of an Antarctic nematode that survives intracellular freezing:Comparisons with other nematode species [J].Journal of Comparative Physiolog Biochemical,2008,178:93-100.

[19] 金永玲，韓日疇，叢 斌．昆蟲病原線蟲應(yīng)用研究概況 [J].昆蟲天敵，2003，25(4)：176-183.

Jin Y L,Han R C,Cong B.General situation of the application research on entomopathogenic nematodes [J].Natural Enemies of Insects，2003，25(4)：176-183.(in Chinese)

[20] Burman M,Pye A E.Neoplectanacarpocapsae:Respiration of infective juveniles [J].Nematology,1980,26:214-218.

[21] Wharton D A,Block W.Freezing tolerance in some Antarctic nematodes [J].Functional Ecology,1993,7:578-584.

[22] Wharton D A,Surrey M R.Cold tolerance mechanisms of the infective larvae of the insect parasitic nematode,HeterorhabditiszealandicaPoinar [J].Cryo-Letters,1994，15(6):353-360.

Effect of pretreatment method on freezing survival of entomopathogenic nematodes

LI Chun-jie,WANG Li-fang,PAN Feng-juan,XU Yan-li

(KeyLaboratoryofMollisolsAgroecology,NortheastInstituteofGeographyandAgroecology,ChineseAcademyofSciences,Harbin,Heilongjiang150081,China)

【Objective】 In order to improve storage technology of entomopathogenic nematodes (EPNs),the methods to increase freezing survival of EPNs were explored.【Method】 Two strong virulence strains of EPNs,Heterorhabditisbacteriophora-HBN (HBN) with cold tolerance isolated from Harbin (China,45°45′N) andH.bacteriophora-NJ (NJ) from New Jersey (USA,40°13′N),were used in this study.The survival rates of HBN and NJ at -4 ℃ for 5 days after different pretreatment methods were compared.【Result】 The freezing survival rates of HBN pretreated at 25 ℃ for 7 d,10 ℃ for 7 d,4 ℃ for 7 d,25 ℃ for 3 d then 10 ℃ for 3 d,and 25 ℃ for 3 d and 10 ℃ for 3 d before 4 ℃ for 3 d were 86.1% to 95.2%,which were significantly higher than that of 25 ℃ for 0 d (17.7%).The highest freezing survival rate of 83.0%,was obtained for NJ when pretreated at 25 ℃ for 3 d and 10 ℃ for 3 d before 4 ℃ for 3 d,which was significantly higher than those of other pretreatment methods (2.2% to 58.5%).【Conclusion】 Freezing survival rates of HBN and NJ could be increased by appropriate pretreamtents.But the best pretreatment methods for the same species (HBN and NJ) isolated from different geographical latitudes were different.

entomopathogenic nematode;preprocessing;cold acclimation;freezing storage;survival rate

2013-09-29

國(guó)家科技計(jì)劃農(nóng)業(yè)成果轉(zhuǎn)化項(xiàng)目(2007GB24910482)；國(guó)家自然科學(xué)基金項(xiàng)目(31000205)；黑龍江省青年科學(xué)基金項(xiàng)目(QC2010070)；哈爾濱市科技創(chuàng)新人才項(xiàng)目(2009RFQYN092)

李春杰(1976-)，女，黑龍江依安人，副研究員，博士，主要從事作物病蟲害生物生態(tài)控制及機(jī)理研究。 E-mail:lichunjie@neigaehrb.ac.cn

許艷麗(1958-)，女，遼寧本溪人，研究員，博士，主要從事農(nóng)田有害生物控制研究。

時(shí)間:2015-01-05 08:59

10.13207/j.cnki.jnwafu.2015.02.026

S432.4+5

A

1671-9387(2015)02-0198-05

網(wǎng)絡(luò)出版地址:http://www.cnki.net/kcms/detail/61.1390.S.20150105.0859.026.html