前列腺癌干細(xì)胞的研究進(jìn)展

王蕾 鄭新民

在西方國(guó)家，前列腺癌（prostate cancer，PCa）是影響男性健康最常見(jiàn)的惡性腫瘤之一。最新的統(tǒng)計(jì)資料顯示，預(yù)計(jì)在2014年，PCa將占到男性新發(fā)病例的首位（27%，233 000例）及 死 亡 率 的 第 二 位 （10%，29 480 例）［1］。 目 前，PCa發(fā)生、發(fā)展的病因?qū)W以及其向雄激素非依賴階段進(jìn)展的分子機(jī)制尚不完全清楚。許多實(shí)體腫瘤研究系統(tǒng)顯示出的證據(jù)表明惡性腫瘤中存在一類(lèi)特殊的亞群，即類(lèi)干細(xì)胞樣癌細(xì)胞，被稱為腫瘤干細(xì)胞（cancer stem cells，CSCs）。CSCs假說(shuō)認(rèn)為一個(gè)單一的類(lèi)干細(xì)胞樣癌細(xì)胞能夠產(chǎn)生出腫瘤中所有表型的癌細(xì)胞，因此它可能是腫瘤發(fā)生、進(jìn)展、遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移和治療抵抗的根源并導(dǎo)致了腫瘤細(xì)胞的異質(zhì)性。腫瘤細(xì)胞的異質(zhì)性可以用兩種模型來(lái)解釋，即克隆演變（隨機(jī)）模型和CSCs（分層）模型，這兩種模型可能并不是相互獨(dú)立的?？寺⊙葑冸S機(jī)模型假說(shuō)認(rèn)為，在一些癌細(xì)胞中遺傳學(xué)和表觀遺傳學(xué)的改變賦予占主導(dǎo)地位的克隆以生存優(yōu)勢(shì)，并且所有腫瘤細(xì)胞中的克隆具有相似的腫瘤起始能力［2-4］。與克隆演變隨機(jī)模型不同，CSCs理論提出許多人類(lèi)腫瘤的癌細(xì)胞在組織學(xué)上是分層的，只有極少數(shù)的細(xì)胞處于“干性層次樹(shù)”的頂部并啟動(dòng)腫瘤的發(fā)生、驅(qū)動(dòng)腫瘤的發(fā)展，為腫瘤起始細(xì)胞。這些腫瘤起始細(xì)胞擁有與正常干細(xì)胞相同的細(xì)胞表型和相關(guān)的功能特性，故被稱為CSCs。盡管PCa的診斷及治療取得了明顯的進(jìn)步，但目前仍有幾個(gè)主要的臨床疑問(wèn)困惑著我們，如無(wú)法精準(zhǔn)地從活躍的PCa細(xì)胞中分離出惰性細(xì)胞；對(duì)于激素難治性PCa尚缺乏有效的治療手段；PCa定向骨轉(zhuǎn)移的機(jī)制尚不完全清楚。因此，更好地研究PCa進(jìn)展過(guò)程中潛在的分子機(jī)制將帶來(lái)新的診斷工具和新的治療策略。近年來(lái)，越來(lái)越多的證據(jù)顯示PCa干細(xì)胞在PCa的發(fā)生、發(fā)展及轉(zhuǎn)移中扮演著重要的角色。因此，靶向PCa干細(xì)胞的治療將成為PCa治療的一個(gè)新策略，這將使PCa患者獲得更好的生存。

一、干細(xì)胞與CSCs

1.干細(xì)胞：干細(xì)胞是特指一類(lèi)具有無(wú)限自我更新能力的多潛能細(xì)胞，并能產(chǎn)生出至少一種高度分化的子代細(xì)胞。根據(jù)干細(xì)胞的發(fā)生學(xué)來(lái)源可將其分為胚胎干細(xì)胞和成體干細(xì)胞，二者均具有多向分化潛能、永生性及無(wú)限的自我更新能力的特點(diǎn)。多向分化潛能和自我更新能力取決于一些轉(zhuǎn)錄因子，例如Oct-4、Sox2和 Nanog［5-6］。目前認(rèn)為每種器官的成體干細(xì)胞均可通過(guò)重構(gòu)分化成各器官的成熟（或分化）的細(xì)胞類(lèi)型。成體干細(xì)胞被認(rèn)為存在于一種特殊的微環(huán)境，即干細(xì)胞“壁龕”，并在正常組織的再生和修復(fù)過(guò)程中發(fā)揮著關(guān)鍵作用。研究發(fā)現(xiàn)調(diào)控正常干細(xì)胞自我更新的一些信號(hào)通路的失控往往導(dǎo)致人類(lèi)癌癥，例如 Wnt／β-catein、Notch、Hedgehog和 TGF-β信號(hào)通路［7］。

2.CSCs：1855年，Rudolph Virchow最先暗指了 CSCs的存在，他觀察到腫瘤與胚胎組織具有組織學(xué)上的相似性，并將其命名為“胚停留假說(shuō)”。當(dāng)前干細(xì)胞研究被廣泛地應(yīng)用于造血系統(tǒng)疾病。CSCs假說(shuō)始于對(duì)白血病的研究，1994年，CSCs首次從白血病患者身上分離提純出來(lái)［8］。2001年Reya等［9］通過(guò)對(duì)急性髓性白血病的研究，強(qiáng)有力地證明了CSCs分層模型，在總結(jié)前人研究成果的基礎(chǔ)上首次提出了CSCs假說(shuō)，認(rèn)為一小群未分化并具有強(qiáng)大的自我更新能力的癌細(xì)胞導(dǎo)致了腫瘤的發(fā)生及持續(xù)生長(zhǎng)。它們是存在于腫瘤內(nèi)的極少數(shù)細(xì)胞，是“腫瘤的種子”，是驅(qū)動(dòng)腫瘤形成和生長(zhǎng)、保持腫瘤異質(zhì)性并促進(jìn)腫瘤無(wú)限增殖、復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移的根源，也是化療和放療抵抗的重要原因之一。最初支持CSCs理論的證據(jù)源于一系列的移植實(shí)驗(yàn)，這些實(shí)驗(yàn)表明癌細(xì)胞是由一群異質(zhì)性的細(xì)胞組成，它們具有不同的表型和自我更新能力。近十余年來(lái)，通過(guò)特定的分子標(biāo)記，假定的CSCs或腫瘤起始細(xì)胞在許多實(shí)體腫瘤中被鑒定出來(lái)，其中包括乳腺癌［10］、腦膠質(zhì)細(xì)胞瘤［11］、胰 腺 癌［12］、肺癌［13］、卵 巢 癌［14］、皮膚黑色素瘤［15］、PCa［16］、結(jié)腸癌［17］及頭頸部腫瘤［18］等，進(jìn)一步證實(shí)了CSCs假說(shuō)。CSCs被認(rèn)為是起源于正常器官的成體干細(xì)胞，具有一些與干細(xì)胞共有的特性，包括：①均具有無(wú)限增殖和分化的潛能；②具有相似的調(diào)節(jié)自我更新的信號(hào)傳導(dǎo)途徑；③具有不同的表型和異質(zhì)性；④端粒酶活性；⑤相似的歸巢和轉(zhuǎn)移的途徑。此外均能誘導(dǎo)血管生成及抵抗凋亡等特點(diǎn)。這些共同點(diǎn)提示CSCs可能來(lái)源于成體干細(xì)胞。同時(shí)CSCs也被認(rèn)為是腫瘤根治性治療失敗的原因［9］。因此，研究CSCs的生物學(xué)特性將極大地有利于臨床治療。目前積累的實(shí)驗(yàn)證據(jù)和臨床證據(jù)均支持這一假說(shuō)，即認(rèn)為腫瘤細(xì)胞中含有一種罕見(jiàn)的具有干細(xì)胞特性的亞群細(xì)胞，能夠自我更新并導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞團(tuán)的增殖和分化具有層次性。正是這一亞群細(xì)胞導(dǎo)致了腫瘤的發(fā)生、發(fā)展、復(fù)發(fā)以及遠(yuǎn)處臟器的轉(zhuǎn)移。

CSCs的兩個(gè)重要特性是自我更新和分化潛能。研究癌細(xì)胞是否具有無(wú)限的自我更新能力最嚴(yán)格的方法是將之移植入非肥胖糖尿?。匕Y聯(lián)合免疫缺陷（non-obese diabetes-SCID mice，NOD／SCID）小鼠。分析CSCs的分化能力最常用的方法是檢測(cè)其細(xì)胞表面分子標(biāo)記的改變。關(guān)于CSCs的鑒定，在傳統(tǒng)的體外評(píng)估中，CSCs的鑒定主要是利用低粘附環(huán)境的“球形成”培養(yǎng)，而體內(nèi)評(píng)估則是通過(guò)其細(xì)胞表面特殊的分子標(biāo)記，利用熒光激活的流式細(xì)胞分選術(shù)將之分選并連續(xù)移植于免疫缺陷的動(dòng)物模型以檢測(cè)它們的致瘤能力。隨之所形成的一系列的移植瘤均應(yīng)該包含異質(zhì)性的細(xì)胞表型和CSCs，因其具有自我更新和分化的潛能。然而，目前使用的免疫缺陷的動(dòng)物模型是有缺點(diǎn)的，它并不能真實(shí)地反映CSCs在人體微環(huán)境下的生物學(xué)特性。

盡管在不同的實(shí)體腫瘤中，CSCs的分子標(biāo)記是明顯多樣化的，但一些惡性腫瘤卻擁有相同的CSCs標(biāo)記。例如CD133（prominin 1），一種主要在胚胎上皮結(jié)構(gòu)的5次跨膜糖蛋白，已經(jīng)在一些實(shí)體腫瘤中被發(fā)現(xiàn)為重要的CSCs表面標(biāo)記，包括腦腫瘤、PCa、肝細(xì)胞癌、卵巢癌、結(jié)直腸癌和肺癌。有趣的是，CD133在小細(xì)胞肺癌中是一個(gè)暫時(shí)性的CSCs標(biāo)記，而在非小細(xì)胞肺癌中卻不是。同樣，CD44也被認(rèn)為是多種實(shí)體腫瘤CSCs的標(biāo)記，包括乳腺癌、結(jié)腸癌［19］、卵巢癌、頭頸部鱗狀細(xì)胞癌［18］和 PCa［20］。

二、前列腺干細(xì)胞與PCa干細(xì)胞

1.前列腺干細(xì)胞：前列腺上皮細(xì)胞在結(jié)構(gòu)上和功能上都是一個(gè)復(fù)雜的組織，由雙層上皮細(xì)胞構(gòu)成腺體結(jié)構(gòu)，并由多種不同的細(xì)胞類(lèi)型組成，包括基底細(xì)胞、腺上皮細(xì)胞和神經(jīng)內(nèi)分泌細(xì)胞。除此以外，還有一小群特殊類(lèi)型的細(xì)胞，呈未分化狀態(tài)，具有自我更新能力和分化潛能，因此被稱為“干細(xì)胞”。腺上皮細(xì)胞是構(gòu)成腺體的主要細(xì)胞，其細(xì)胞表達(dá)細(xì)胞角蛋白8和18（CK8、CK18）、雄激素受體（androgen receptor，AR）、PSA和前列腺酸性磷酸酶（prostatic acid phosphatase，PAP）?；准?xì)胞在前列腺上皮細(xì)胞總數(shù)中的含量不足10%，其細(xì)胞表達(dá)細(xì)胞角蛋白5和14（CK5、CK14）、P63和CD44，不表達(dá)PAP和PSA。

成人的前列腺是一個(gè)生長(zhǎng)相對(duì)緩慢的組織，并且其細(xì)胞的增殖和凋亡也十分有限，因此人們關(guān)于成人前列腺干細(xì)胞是否存在爭(zhēng)議了很多年。在哺乳動(dòng)物的正常前列腺中存在干細(xì)胞的最早證據(jù)是基于鼠科實(shí)驗(yàn)，該實(shí)驗(yàn)證實(shí)成年鼠的前列腺可以經(jīng)歷重復(fù)多次的閹割引起的萎縮和雄激素所致的再生。因?yàn)樾奂に氐南瞬⒉荒苡绊懟准?xì)胞，所以人們推測(cè)有一種具有類(lèi)似干細(xì)胞特性的細(xì)胞存在于基底層，不需要雄激素的刺激便可導(dǎo)致前列腺的生長(zhǎng)。這一假設(shè)得到了許多研究結(jié)果的支持。這些研究結(jié)果表明，不僅前列腺組織的生成及發(fā)育需要P63基因的表達(dá)（一種基底細(xì)胞的分子標(biāo)記），而且管腔分泌細(xì)胞也是由表達(dá)P63基因的基底細(xì)胞分化而來(lái)［21］。前列腺干細(xì)胞在基質(zhì)中一種特殊的壁龕周?chē)?，通過(guò)旁分泌來(lái)維持干細(xì)胞的存活和組織再生。然而，Kurita等［22］在組織再生及移植實(shí)驗(yàn)中觀察到小鼠P63-的泌尿生殖竇的胚胎間充質(zhì)細(xì)胞可以再生前列腺導(dǎo)管上皮，這表明在前列腺中存在較P63＋更原始的細(xì)胞并由之產(chǎn)生出腺上皮細(xì)胞。目前關(guān)于正常的成體前列腺干細(xì)胞的起源及發(fā)展仍存在爭(zhēng)議，一些學(xué)者認(rèn)為存在一種基底細(xì)胞和腺上皮細(xì)胞共同的祖細(xì)胞，由基底細(xì)胞分化出腺上皮細(xì)胞。另一些學(xué)者則認(rèn)為基底細(xì)胞和腺上皮細(xì)胞擁有各自的祖細(xì)胞以維持它們自身的生長(zhǎng)［23］。

在成人前列腺中，曾有數(shù)個(gè)分子標(biāo)記被認(rèn)為可能是前列腺干細(xì)胞的標(biāo)記。后來(lái)在體外實(shí)驗(yàn)的研究中發(fā)現(xiàn)基底細(xì)胞中存在前列腺干細(xì)胞，表達(dá)CK5＋、CK14＋、CD133＋、CD44＋并且高表達(dá)整聯(lián)蛋白β1［23］。這類(lèi)細(xì)胞僅占前列腺基底上皮細(xì)胞的1%，并從基底細(xì)胞層分化成腺上皮細(xì)胞。尤其是表達(dá)CD44、整聯(lián)蛋白α2β1和CD133分子的前列腺上皮細(xì)胞，能夠分化成前列腺正常形態(tài)的細(xì)胞并具有高增殖能力。Collins等［16］利用前列腺干細(xì)胞標(biāo)記（CD44＋、α2β1hi、CD133＋）從人前列腺切除術(shù)的標(biāo)本中分離出假定的前列腺干細(xì)胞，這些細(xì)胞不表達(dá)AR，但將它們置于含有血清和二氫睪丸酮的培養(yǎng)環(huán)境時(shí)，它們便呈現(xiàn)出更多的腺上皮表型，表達(dá)AR、CK18和PAP。盡管這一研究并沒(méi)有將這些假定的前列腺干細(xì)胞移植入NOD／SCID鼠模型進(jìn)行體內(nèi)研究，但他們提供了可靠的體外實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)證實(shí) CD44＋／α2β1hi／CD133＋的細(xì)胞具有前列腺干細(xì)胞的特性，與對(duì)照組相比具有更強(qiáng)的穿透Matrigel基質(zhì)膠的能力。然而，近期 Missol-Kolka等［24］的研究報(bào)道CD133在人前列腺的表達(dá)并不僅僅在少數(shù)的基底干細(xì)胞和祖細(xì)胞，還表達(dá)于一些腺上皮分泌細(xì)胞。此外，他們還發(fā)現(xiàn)CD133在PCa組織中下調(diào)而在癌旁組織的腺上皮細(xì)胞中上調(diào)。與人前列腺中CD133的表達(dá)不同，鼠前列腺組織中CD133表達(dá)十分廣泛。還有幾個(gè)其他的分子標(biāo)記被用于前列腺干細(xì)胞的研究，如醛脫氫酶（ALDH）、腫瘤相關(guān)鈣信號(hào)傳感器2（Trop2）、三磷酸腺苷結(jié)合轉(zhuǎn)運(yùn)體G2（ATP-binding cassette superfamily G member 2，ABCG2）、P63等均被報(bào)道用于人和鼠的前列腺干細(xì)胞的分離和鑒定［25］。此外，Trop2＋CD44＋CD49f＋的基底干細(xì)胞被證實(shí)具有更強(qiáng)的前列腺球形成能力和組織再生能力［26］。

2.PCa干細(xì)胞：CSCs被定義為具有無(wú)限的自我更新能力、高增殖能力及致瘤性。鑒定CSCs的“金標(biāo)準(zhǔn)”是能夠在免疫缺陷的老鼠體內(nèi)形成組織學(xué)上與親代相似的可連續(xù)移植的腫瘤［27］。絕大多數(shù)的CSCs的實(shí)驗(yàn)研究方法都取決于正常干細(xì)胞的富集方法，如利用細(xì)胞表面的分子標(biāo)記采用流式細(xì)胞分選（fluorescence-activated cell sorting，F(xiàn)ACS）、免疫磁珠分選（magnetic activated cell sorting，MACS）或通過(guò)側(cè)群細(xì)胞（side population，SP）達(dá)到富集分選的目的。PCa干細(xì)胞被認(rèn)為是PCa發(fā)生、發(fā)展、復(fù)發(fā)及遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移的根源。目前已有一些研究明確了PCa干細(xì)胞的存在［28-29］。例如，Collins等［16］發(fā)現(xiàn)CD44＋／α2β1hi／CD133＋的人PCa細(xì)胞具有強(qiáng)的克隆形成能力并具備CSCs特有的潛能。在長(zhǎng)期培養(yǎng)的PCa細(xì)胞系（如DU145）中，CD44＋的PCa細(xì)胞優(yōu)先表達(dá)“干性”基因并大多數(shù)處于靜止?fàn)顟B(tài)，并且與分離純化的CD44-細(xì)胞相比具有更強(qiáng)的致瘤能力和轉(zhuǎn)移能力。隨后的研究顯示，CD44＋α2β1hi的PCa細(xì)胞在LAPC9模型中進(jìn)一步富集了PCa干細(xì)胞。另有一些研究通過(guò)不同的分子標(biāo)記研究了PCa干細(xì)胞，這些分子標(biāo)記有CD133、CXCR4和TRA-1-60／CD151／CD166［30］。不依賴分子標(biāo)記也能富集PCa干細(xì)胞，例如在LAPC9模型中SP細(xì)胞的致瘤性10倍于非SP細(xì)胞［31］；ALDH＋的PCa細(xì)胞表現(xiàn)出高的致瘤性和強(qiáng)的轉(zhuǎn)移能力［32］。PSA-／low的PCa細(xì)胞與PSA＋的細(xì)胞相比表現(xiàn)出更多的干細(xì)胞特征：①PSA-／low的PCa細(xì)胞有更強(qiáng)的克隆形成能力及球形成能力；②PSA-／low的PCa細(xì)胞更多地處于細(xì)胞靜止期；③PSA-／low的PCa細(xì)胞過(guò)表達(dá)許多干細(xì)胞相關(guān)的基因，如 Nanog、CD44、SPP1等；④PSA-／low的PCa細(xì)胞對(duì)于去勢(shì)治療及化療（如紫杉醇）具有更強(qiáng)的抵抗性；⑤PSA-／low的PCa細(xì)胞所形成的連續(xù)移植瘤在組織學(xué)上與親代腫瘤相似；⑥PSA-／low的PCa細(xì)胞可以通過(guò)不對(duì)稱分裂來(lái)完成自我更新并產(chǎn)生PSA＋的細(xì)胞。重要的是，PSA-／low的PCa細(xì)胞亞群依然是異質(zhì)性的，真正的具有對(duì)去勢(shì)治療抵抗的PCa干細(xì)胞只是其中的小部分細(xì)胞。為了支持這一猜想，有研究從PSA-／low的PCa細(xì)胞中分離出 ALDH＋CD44＋α2β1hi的亞群細(xì)胞，并證明這些細(xì)胞能夠在完全閹割的老鼠身上形成連續(xù)性的移植瘤。

近年來(lái)，越來(lái)越多的證據(jù)表明，一些分子和信號(hào)通路參與了PCa干細(xì)胞活性的調(diào)節(jié)。例如Nanog，一種同源轉(zhuǎn)錄因子，在調(diào)節(jié)胚胎干細(xì)胞的多能性中起著決定性的作用。在PCa干細(xì)胞的活性和致瘤能力上也起著重要的作用。在CD44＋的PCa細(xì)胞中Nanog的表達(dá)增強(qiáng)，而沉默Nanog基因可抑制腫瘤增殖。miR-34a在CD44＋PCa細(xì)胞中起負(fù)性調(diào)節(jié)作用，隨之的實(shí)驗(yàn)證實(shí)miR-34a對(duì)于CD44＋PCa細(xì)胞的負(fù)性調(diào)控作用強(qiáng)大，通過(guò)靶向CD44＋PCa細(xì)胞而達(dá)到抑制PCa干細(xì)胞的致瘤能力和轉(zhuǎn)移能力［33］。最近的一些研究表明，Trop2在正常前列腺干細(xì)胞的自我更新能力的調(diào)節(jié)中起著重要的作用，這說(shuō)明Trop2可能不僅是分子表型標(biāo)記，而且從機(jī)能上影響前列腺干細(xì)胞和PCa干細(xì)胞的活性［34］。

三、PCa干細(xì)胞的分子標(biāo)記及富集、分選方法

PCa干細(xì)胞僅是PCa細(xì)胞中一小類(lèi)亞群細(xì)胞，可以在體外形成大的克隆并在免疫缺陷動(dòng)物體內(nèi)形成移植瘤。因?yàn)镻Ca干細(xì)胞的自我更新能力及持續(xù)生長(zhǎng)能力導(dǎo)致了PCa的復(fù)發(fā)、遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移及治療失敗。目前學(xué)者們致力于研究如何將這群特殊的細(xì)胞分離并研究它們的特性，以期更好地研發(fā)出針對(duì)它們的靶向治療。

大量的學(xué)者圍繞CSCs理論展開(kāi)了激烈的辯論。從PCa細(xì)胞系和PCa患者瘤體分離出的PCa干細(xì)胞在細(xì)胞表型上有明顯的異質(zhì)性，這種異質(zhì)性使得PCa干細(xì)胞表面標(biāo)記的鑒定變得復(fù)雜，并且阻礙了針對(duì)其特異性的靶向治療的研究。關(guān)于PCa細(xì)胞的起源我們知之甚少，有證據(jù)表明不論在人體還是老鼠模型中，PCa既可能來(lái)源于基底細(xì)胞也可能來(lái)源于腺上皮細(xì)胞［35］。同樣，干細(xì)胞轉(zhuǎn)化為CSCs的具體機(jī)制也不清楚。因此弄清楚PCa干細(xì)胞的表型及其生物學(xué)特性對(duì)研究PCa干細(xì)胞是十分重要的。

研究PCa干細(xì)胞的分子標(biāo)記將為我們分離純化PCa干細(xì)胞并研究其特性提供幫助。分子標(biāo)記利于我們從細(xì)胞系或原發(fā)腫瘤中分離PCa干細(xì)胞。CD44是一種透明質(zhì)酸結(jié)合的細(xì)胞膜表面糖蛋白，近來(lái)常被用來(lái)在許多組織中分選可能的CSCs，包括PCa。當(dāng)用于PCa干細(xì)胞的研究時(shí)，CD44常常需要和其他的分子標(biāo)記聯(lián)合使用。有研究表明從四種不同的PCa細(xì)胞系中獲得的“前列腺球”均高表達(dá)CD44。由DU145的“前列腺球”中純化的CD44＋／CD24-的細(xì)胞具有分化潛 能［36］。Collins等［16］發(fā) 現(xiàn) CD44＋／α2β1hi／CD133＋的人PCa干細(xì)胞在患者前列腺腫瘤活組織內(nèi)的含量?jī)H占0.1%。免疫熒光檢測(cè)法被用于從DU145細(xì)胞球中檢測(cè)一些可能的PCa干細(xì)胞分子標(biāo)記，如CD44、CD24和α2β1hi整聯(lián)蛋白。在這一研究中使用的標(biāo)記是 CD44＋／CD24＋／α2β1hi，而非CD44＋／CD24-。這提示在惡性腫瘤細(xì)胞中可能不止一種類(lèi)干細(xì)胞樣的細(xì)胞存在，并且在分離PCa干細(xì)胞中單一的抗原是不夠的。ABC轉(zhuǎn)運(yùn)體超家族中的ABCG2在多種腫瘤中被用作為鑒定CSCs的分子標(biāo)記。ABCG2可能與CSCs化療耐藥有關(guān)。但其作為CSCs的分子標(biāo)記仍有爭(zhēng)議，可以用其來(lái)鑒定治療抵抗的亞群細(xì)胞。近來(lái)，ABCG2聯(lián)合其他的分子標(biāo)記被用來(lái)從人體PCa組織中鑒定PCa干細(xì)胞，如CD133＋／CD44＋／ABCG2／CD24-。目前知道一些決定胚胎干細(xì)胞的多能性的基因如Nanog、Oct-4和Sox2在成體干細(xì)胞和CSCs中均有表達(dá)，DU145細(xì)胞所形成的“前列腺球”中就表達(dá)上述基因。研究表明，從人PCa組織中獲得的原代細(xì)胞中表達(dá)Nanog和Oct-4者預(yù)后差，在異種移植瘤實(shí)驗(yàn)中，少量CD44＋的PCa干細(xì)胞樣細(xì)胞中也發(fā)現(xiàn)有Nanog的表達(dá)［37］。

目前從人體前列腺腫瘤組織或PCa細(xì)胞系成功富集分離獲得PCa干細(xì)胞的途徑主要有三種：①SP法，能夠主動(dòng)地將熒光染料Hoechst33342排出細(xì)胞外，再通過(guò)流式細(xì)胞術(shù)將其分選出來(lái)。這一方法的劣勢(shì)是Hoechst染料具有細(xì)胞毒性，所選細(xì)胞可能不適合做進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)；②通過(guò)細(xì)胞膜表面特殊的分子標(biāo)記，用相對(duì)應(yīng)的抗體與之結(jié)合，再通過(guò)FACS和／或MACS將其分選出來(lái)；③CSCs可在添加了特殊生長(zhǎng)因子的無(wú)血清培養(yǎng)基中形成懸浮球狀生長(zhǎng)并得到富集。

四、PCa干細(xì)胞與治療抵抗

有學(xué)者通過(guò)選擇對(duì)標(biāo)準(zhǔn)抗癌治療抵抗的細(xì)胞而成功分離CSCs，這是基于一些研究中觀察到CSCs可在暴露于化療藥物的環(huán)境中生存。同樣，PCa干細(xì)胞被觀察到能夠抵抗放射治療和去勢(shì)治療［38］。如果PCa中存在PCa干細(xì)胞，那么它就可能從多種治療中逃逸并最終導(dǎo)致腫瘤復(fù)發(fā)、進(jìn)展及轉(zhuǎn)移。這一激動(dòng)人心的治療新靶標(biāo)值得我們進(jìn)一步的分析及研究。下面從PCa干細(xì)胞治療抵抗的多個(gè)方面來(lái)闡述。

1.PCa干細(xì)胞與化療抵抗：通過(guò)SP細(xì)胞來(lái)分選CSCs是常用的方法之一，它利用熒光染料Hoechst33342將活細(xì)胞染色，而類(lèi)干細(xì)胞樣的細(xì)胞可將這種熒光染料排出細(xì)胞外，因此便可通過(guò)流式細(xì)胞儀將這群不被染色的細(xì)胞分選出來(lái)。這種能將Hoechst染料排出細(xì)胞外的能力源于其表達(dá)ABC轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白，即ABCG2，它也能將化學(xué)治療的藥物排出細(xì)胞外。借助這一原理，當(dāng)我們無(wú)法確定CSCs的細(xì)胞表型時(shí)可通過(guò)化療耐藥的細(xì)胞來(lái)尋找并鑒定CSCs。Liu等［33］從PCa 22Rv1細(xì)胞系中分選出了CD117＋／ABCG2＋PCa干細(xì)胞，同時(shí)表達(dá)干細(xì)胞標(biāo)記物如Nanog、Oct-4、Sox2、巢蛋白以及CD133，對(duì)順鉑、紫杉醇、阿霉素及甲氨蝶呤等多種化療藥物耐藥。進(jìn)一步研究證實(shí)ABCG2啟動(dòng)子CpG島的甲基化水平降低可能是CD117＋／ABCG2＋PCa干細(xì)胞化療耐藥的重要原因。

在一些細(xì)胞培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)中，直接將癌細(xì)胞暴露于化療藥物（如多西紫杉醇）中以此獲得化療耐藥細(xì)胞。Domingo等［29］采用體外和體內(nèi)試驗(yàn)，分選出一部分對(duì)多西紫杉醇耐藥的PCa細(xì)胞，這部分細(xì)胞具有CSCs特性，高表達(dá)Notch和Hedgehog信號(hào)，靶向Notch和Hedgehog信號(hào)通路能通過(guò)抑制AKT和Bcl-2清除這部分對(duì)多西紫杉醇耐藥的細(xì)胞，提示Notch和Hedgehog信號(hào)通路的高表達(dá)可能是PCa干細(xì)胞化療耐藥的重要原因。

2.PCa干細(xì)胞與放療抵抗：一些被分離出的CSCs顯示出對(duì)放射治療的抵抗。目前已經(jīng)發(fā)現(xiàn)乳腺癌干細(xì)胞和惡性腦膠質(zhì)瘤的干細(xì)胞對(duì)放射治療抵抗［39］。目前，在PCa干細(xì)胞的特性中尚未明確其是否放射抵抗。在兩種PCa細(xì)胞系的研究中發(fā)現(xiàn)它們對(duì)放射治療的反應(yīng)是不同的［38］。LNCaP中的CSCs與親代細(xì)胞相比在經(jīng)過(guò)放療后表現(xiàn)為存活細(xì)胞數(shù)量增加，而DU145中的CSCs與親代細(xì)胞相比則無(wú)變化。這些研究表明PCa干細(xì)胞對(duì)放射治療抵抗的具體機(jī)制是不明確的，因此需要更多的研究以明確放射抵抗是否為PCa干細(xì)胞的一個(gè)明顯特征［40］。

3.PCa干細(xì)胞與激素難治性PCa：雄激素和AR對(duì)于前列腺的發(fā)育及PCa都是至關(guān)重要的。雄激素剝奪治療是治療進(jìn)展期PCa的常用方法，大多數(shù)的腫瘤細(xì)胞會(huì)死亡或緩解。然而，經(jīng)過(guò)一段時(shí)間后大部分患者會(huì)進(jìn)展為激素難治性PCa（hormone-refractory prostate cancer，HRPC）并導(dǎo)致復(fù)發(fā)及轉(zhuǎn)移。HRPC的病因?qū)W目前仍不完全清楚。Miki等［38］研究發(fā)現(xiàn)將AR-的干細(xì)胞樣PCa細(xì)胞球培養(yǎng)于可誘導(dǎo)分化的環(huán)境時(shí)，細(xì)胞可轉(zhuǎn)化為AR＋。有研究表明缺乏AR可能是PCa干細(xì)胞的一個(gè)重要特性，CD133＋PCa細(xì)胞為AR-，從人PCa細(xì)胞系中獲得的CD44＋細(xì)胞也是AR-［38］。因此檢測(cè)雄激素抵抗和AR的表達(dá)對(duì)于鑒定PCa干細(xì)胞是非常重要的，而研究PCa干細(xì)胞將有助于解釋HRPC進(jìn)展中尚不明確的機(jī)制。

五、展望

CSCs這一概念受到越來(lái)越多的學(xué)者的關(guān)注和肯定，目前已在多種實(shí)體瘤中得到證實(shí)，包括PCa。闡明PCa干細(xì)胞的表型、功能特性及其分子調(diào)節(jié)系統(tǒng)將有助于我們更好地認(rèn)識(shí)PCa的發(fā)生、發(fā)展及轉(zhuǎn)移的機(jī)制。目前尚有許多疑惑困擾著大家，如PCa干細(xì)胞眾多不同的分子表型之間的聯(lián)系；PCa干細(xì)胞耐受化療及放療的具體機(jī)制；PCa干細(xì)胞生長(zhǎng)的微環(huán)境等等。這些均需要深入的研究，以期尋找到針對(duì)PCa干細(xì)胞的特異性靶向治療藥物及方法，使PCa患者受益。

［1］ Siegel R，Ma J，Zou Z，et al.Cancer statistics，2014［J］.CA Cancer J Clin，2014，64（1）：9-29.

［2］ Shackleton M，Quintana E，F(xiàn)earon ER，et al.Heterogeneity in cancer：cancer stem cells versus clonal evolution［J］.Cell，2009，38（5）：822-829.

［3］ Tang DG.Understanding cancer stem cell heterogeneity and plasticity［J］.Cell Res，2012，22（3）：457-472.

［4］ Visvader JE，Lindeman GJ.Cancer stem cells：current status and evolving complexities［J］.Cell Stem Cell，2012，10（6）：717-728.

［5］ Avilion AA，Nicolis SK，Pevny LH，et al.Multipotent cell lineages in early mouse development depend on SOX2function［J］.Genes Dev，2003，17（1）：126-140.

［6］ Mitsui K，Tokuzawa Y，Itoh H，et al.The homeoprotein Nanog is required for maintenance of pluripotency in mouse epiblast and ES cells［J］.Cell，2003，113（5）：631-642.

［7］ Huntly BJ，Gilliland DG.Leukaemia stem cells and the evolution of cancer-stem-cell research［J］.Nat Rev Cancer，2005，5（4）：311-321.

［8］ Lapidot T，Sirard C，Vormoor J，et al.A cell initiating human acute myeloid leukaemia after transplantation into SCID mice［J］.Nature，1994，367（6464）：645-648.

［9］ Reya T，Morrison SJ，Clarke MF，et al.Stem cells，cancer，and cancer stem cells［J］.Nature，2001，414（6859）：105-111.

［10］ Marsden CG，Wright MJ，Pochampally R，et al.Breast tumorinitiating cells isolated from patient core biopsies for study of hormone action［J］.Methods Mol Biol，2009，590：363-375.

［11］ Singh SK，Hawkins C，Clarke ID，et al.Identification of human brain tumour initiating cells［J］.Nautre，2004，432（7015）：396-401.

［12］ Hermann PC，Huber SL，Herrler T，et al.Distinct populations of cancer stem cells determine tumor growth and metastatic activity in human pancreatic cancer［J］.Cell Stem Cell，2007，1（3）：313-323.

［13］ Kim CF，Dirks PB.Cancer and stem cell biology：how tightly intertwined？［J］.Cell Stem Cell，2008，3（2）：147-150.

［14］ Zhang S，Balch C，Chan MW，et al.Identification and characterization of ovarian cancer-initiating cells from primary human tumors［J］.Cancer Res，2008，68（11）：4311-4320.

［15］ Monzani E，F(xiàn)acchetti F，Galmozzi E，et al.Melanoma contains CD133and ABCG2positive cells with enhanced tumourigenic potential［J］.Eur J Cancer，2007，43（5）：935-946.

［16］ Collins AT，Berry PA，Hyde C，et al.Prospective identification of tumorigenic prostate cancer stem cells［J］.Cancer Res，2005，65（23）：10946-10951.

［17］ Ricci-Vitiani L，Lombardi DG，Pilozzi E，et al.Identification and expansion of human colon-cancer-initiating cells［J］.Nature，2007，45（7123）：111-115.

［18］ Prince ME，Sivanandan R，Kaczorowski A，et al.Identification of a subpopulation of cells with cancer stem cell properties in head and neck squamous cell carcinoma［J］.Proc Natl Acad Sci USA，2007，104（3）：973-978.

［19］ Chu P，Clanton DJ，Snipas TS，et al.Characterization of a subpopulation of colon cancer cells with stem cell-like properties［J］.Int J Cancer，2009，124（6）：1312-1321.

［20］ Patrawala L，Calhoun-Davis T，Schneider-Broussard R，et al.Hierarchical organization of prostate cancer cells in xenograft tumors：the CD44＋alpha2beta1＋ cell population is enriched in tumor-initiating cells［J］.Cancer Res，2007，67（14）：6796-6805.

［21］ Signoretti S，Pires MM，Lindauer M，et al.p63regulates commitment to the prostate cell lineage［J］.Proc Natl Acad Sci USA，2005，102（32）：11355-11360.

［22］ Kurita T，Medina RT，Mills AA，et al.Role of p63and basal cells in the prostate［J］.Development，2004，131（20）：4955-4964.

［23］ Choi N，Zhang B，Zhang L，et al.Adult murine prostate basal and luminal cells are self-sustained lineages that can both serve as targets for prostate cancer initiation［J］.Cancer Cell，2012，21（2）：253-265.

［24］ Missol-Kolka E，KarbanováJ，Janich P，et al.Prominin-1（CD133）is not restricted to stem cells located in the basal compartment of murine and human prostate［J］.Prostate，2011，71（3）：254-267.

［25］ Burger PE，Gupta R，Xiong X，et al.High aldehyde dehydrogenase activity：a novel functional marker of murine prostate stem／progenitor cells［J］.Stem Cells，2009，27（9）：220-2228.

［26］ Garraway IP，Sun W，Tran CP，et al.Human prostate sphereforming cells represent a subset of basal epithelial cells capable of glandular regeneration in vivo［J］.Prostate，2010，70（5）：491-501.

［27］ Clarke MF，Dick JE，Dirks PB，et al.Cancer stem cellsperspectives on current status and future directions：AACR Workshop on cancer stem cells［J］.Cancer Res，2006，66（19）：339-9344.

［28］ Qin J，Liu X，Laffin B，et al.The PSA（-／lo）prostate cancer cell population harbors self-renewing long-term tumor-propagating cells that resist castration［J］.Cell Stem Cell，2012，10（5）：556-569.

［29］ Domingo-Domenech J，Vidal SJ，Rodriguez-Bravo V，et al.Suppression of acquired docetaxel resistance in prostate cancer through depletion of notch-and hedgehog-dependent tumor-initiating cells［J］.Cancer Cell，2012，22（3）：373-388.

［30］ Vander Griend DJ，Karthaus WL，Dalrymple S，et al.The role of CD133in normal human prostate stem cells and malignant cancer-initiating cells［J］.Cancer Res，2008，68（23）：9703-9711.

［31］ Patrawala L，Calhoun T，Schneider-Broussard R，et al.Side population is enriched in tumorigenic，stem-like cancer cells，whereas ABCG2＋and ABCG2-cancer cells are similarly tumorigenic［J］.Cancer Res，2005，65（14）：6207-6219.

［32］ van den Hoogen C，van der Horst G，Cheung H，et al.High aldehyde dehydrogenase activity identifies tumor-initiating and metastasis-initiating cells in human prostate cancer［J］.Cancer Res，2010，70（12）：5163-5173.

［33］ Liu C，Kelnar K，Liu B，et al.The microRNA miR-34ainhibits prostate cancer stem cells and metastasis by directly repressing CD44［J］.Nat Med，2011，17（2）：211-215.

［34］ Stoyanova T，Goldstein AS，Cai H，et al.Regulated proteolysis of Trop2drives epithelial hyperplasia and stem cell selfrenewal viaβ-catenin signaling［J］.Genes Dev，2012，26（20）：2271-2285.

［35］ Taylor RA，Toivanen R，F(xiàn)rydenberg M，et al.Human epithelial basal cells are cells of origin of prostate cancer，independent of CD133status［J］.Stem Cells，2012，30（6）：1087-1096.

［36］ Salvatori L，Caporuscio F，Verdina A，et al.Cell-to-cell signaling influences the fate of prostate cancer stem cells and their potential to generate more aggressive tumors［J］.PLoS One，2012，7（2）：e31467.

［37］ Germann M，Wetterwald A，Guzmán-Ramirez N，et al.Stemlike cells with luminal progenitor phenotype survive castration in human prostate cancer［J］.Stem Cells，2012，30（6）：1076-1086.

［38］ Miki J，F(xiàn)urusato B，Li H，et al.Identification of putative stem cell markers，CD133and CXCR4，in hTERT-immortalized primary nonmalignant and malignant tumor-derived human prostate epithelial cell lines and in prostate cancer specimens［J］.Cancer Res，2007，67（7）：3153-3161.

［39］ Schepers AG，Snippert HJ，Stange DE，et al.Lineage tracing reveals Lgr5＋stem cell activity in mouse intestinal adenomas［J］.Science，2012，337（6095）：730-735.

［40］ Sharpe B，Beresford M，Bowen R，et al.Searching for prostate cancer stem cells：markers and methods［J］.Stem Cell Rev，2013，9（5）：721-730.