豬Jiv基因的克隆表達(dá)與多克隆抗體制備

劉 偉，郭抗抗，林 鷙，盛 潔，趙 娣，趙紫印，張彥明

(西北農(nóng)林科技大學(xué) 動(dòng)物醫(yī)學(xué)院，陜西 楊凌 712100)

豬Jiv基因的克隆表達(dá)與多克隆抗體制備

劉 偉，郭抗抗，林 鷙，盛 潔，趙 娣，趙紫印，張彥明

(西北農(nóng)林科技大學(xué) 動(dòng)物醫(yī)學(xué)院，陜西 楊凌 712100)

【目的】 克隆豬Jiv蛋白核心區(qū)的2 112 bp的基因片段，構(gòu)建其原核表達(dá)載體后進(jìn)行蛋白的表達(dá)和純化，制備抗豬Jiv蛋白的多克隆抗體。【方法】 利用RT-PCR方法，從豬脾臟組織RNA中擴(kuò)增得到豬Jiv基因，將其克隆到pMD19-T載體并測(cè)序，以此為基礎(chǔ)構(gòu)建原核表達(dá)載體pET32a-Jiv，轉(zhuǎn)化E.coliRosetta(DE3)感受態(tài)細(xì)胞中，利用IPTG誘導(dǎo)表達(dá)，獲得大量包涵體形式的豬Jiv融合蛋白。通過鎳離子螯合層析柱對(duì)表達(dá)的目的蛋白進(jìn)行純化，對(duì)純化后的包涵體蛋白進(jìn)行透析復(fù)性，以每只新西蘭白兔400 μg蛋白的初次免疫劑量和500 μg蛋白的加強(qiáng)免疫劑量進(jìn)行免疫，共免疫5次，采集血清，采用間接ELISA法檢測(cè)抗體效價(jià)達(dá)到一定水平后，收集抗體，利用Western blot檢測(cè)抗體特異性。【結(jié)果】 克隆得到長(zhǎng)度為2 112 bp的豬Jiv基因片段；構(gòu)建的pET32a-Jiv在E.coliRosetta(DE3)感受態(tài)細(xì)胞中經(jīng)誘導(dǎo)后高效表達(dá)，SDS-PAGE結(jié)果顯示，純化得到分子質(zhì)量約為95 ku的豬Jiv融合蛋白；測(cè)得的豬Jiv蛋白多克隆抗體效價(jià)達(dá)1∶6 400；Western blot檢測(cè)結(jié)果證實(shí)，所獲得抗體能夠有效地應(yīng)用于豬Jiv蛋白抗原的檢測(cè)。【結(jié)論】 成功地克隆了豬Jiv基因，制備了抗豬Jiv蛋白的多克隆抗體。

豬Jiv蛋白；原核表達(dá)；多克隆抗體；豬瘟病毒

Jiv(J-domain protein interacting with viral protein)蛋白最早發(fā)現(xiàn)與致細(xì)胞病變型(Cytopathogenic，CP)牛病毒性腹瀉病毒(Bovine viral diarrhea virus, BVDV)存在相互作用。Mendez等[1]發(fā)現(xiàn)， 自然情況下BVDV NADL株基因組中插入了一段編碼90個(gè)氨基酸的mRNA外源序列，在對(duì)這一序列進(jìn)行人工缺失后引起B(yǎng)DVD NADL株由CP型轉(zhuǎn)變?yōu)榉侵录?xì)胞病變型(Non-cytopathogenic，NCP)。后經(jīng)研究發(fā)現(xiàn)這一外源序列來自宿主細(xì)胞的熱應(yīng)激蛋白HSP40家族[2]，所編碼的蛋白可與BVDV非結(jié)構(gòu)蛋白NS2相互作用，促進(jìn)NS2-3蛋白前體的裂解，進(jìn)而引起細(xì)胞產(chǎn)生病變(Cytopathogenic effect，CPE)[3]。豬瘟病毒(Classical swine fever virus，CSFV)作為與BVDV同屬病毒，在自然界中并未發(fā)現(xiàn)有Jiv序列插入的嵌合病毒株，但是通過人工構(gòu)建嵌合CSFV Alfort-Jiv株感染SK-6細(xì)胞后發(fā)現(xiàn)，病毒NS3蛋白和RNA大量增加，同時(shí)引起細(xì)胞病變(CPE)[4]。更為有趣的是，CSFV Alfort-Jiv株可以引起豬體內(nèi)產(chǎn)生高滴度的中和抗體，并保護(hù)由CSFV引起的死亡，這一結(jié)果與自然界存在的其他CP型CSFV可以引起豬的典型豬瘟臨床癥狀正好相反[5]。同時(shí)，本實(shí)驗(yàn)室前期研究發(fā)現(xiàn)，對(duì)豬臍靜脈血管內(nèi)皮細(xì)胞內(nèi)Jiv90基因進(jìn)行過表達(dá)，接入CSFV后發(fā)現(xiàn)表達(dá)Jiv90基因的試驗(yàn)組細(xì)胞死亡率高于對(duì)照組[6]，說明無論是通過CSFV基因組插入Jiv90序列還是單純過表達(dá)細(xì)胞內(nèi)的Jiv90基因都會(huì)對(duì)CSFV的復(fù)制產(chǎn)生影響。郭抗抗等[7]篩選到1株穩(wěn)定表達(dá)靶向干擾細(xì)胞內(nèi)Jiv基因序列shRNA的細(xì)胞株，進(jìn)行豬瘟接毒試驗(yàn)后，發(fā)現(xiàn)CSFV RNA含量明顯降低。由此可見，Jiv蛋白可能對(duì)CSFV的復(fù)制和毒力有較大影響。目前，此方面研究都集中在從基因水平來探討Jiv和Jiv90與CSFV的相互作用上，為了進(jìn)一步揭示Jiv蛋白在抗豬瘟中的作用，急需相應(yīng)的檢測(cè)豬Jiv蛋白或Jiv90蛋白的抗體來滿足試驗(yàn)需求。

本研究對(duì)豬Jiv基因的核心區(qū)進(jìn)行了克隆，并構(gòu)建其原核表達(dá)載體進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)，利用鎳金屬離子螯合層析柱(Ni-NTA His Resin柱)純化表達(dá)蛋白，免疫新西蘭白兔后，制備了抗豬Jiv多克隆抗體，為進(jìn)一步鑒定Jiv蛋白功能奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材 料

1.1.1 組織與試驗(yàn)動(dòng)物 脾臟組織采自3日齡長(zhǎng)白系CSFV陰性小豬，采集后置-80 ℃保存?zhèn)溆茫?2月齡雄性健康成年新西蘭白兔2只，購(gòu)自陜西楊凌某兔場(chǎng)，常規(guī)飼養(yǎng)。

1.1.2 主要試劑 限制性內(nèi)切酶、T4 DNA連接酶、PrimeScriptTMRT Kit、pMD19-T 載體，購(gòu)自TaKaRa公司；Pfu高保真擴(kuò)增酶，購(gòu)自Fermentas公司；膠回收試劑盒、高純質(zhì)粒小量提取試劑盒，購(gòu)自北京百泰克生物公司；弗氏完全佐劑和弗式不完全佐劑、HRP標(biāo)記的羊抗兔IgG二抗、牛血清白蛋白，購(gòu)自Sigma公司；TMB底物溶液，購(gòu)自北京天根生物公司；Ni-NTA His Resin柱，購(gòu)自北京全式金生物公司；蛋白Marker，購(gòu)自北京鼎國(guó)昌盛生物公司；E.coliDH5α、Rosetta(DE3)菌株、原核表達(dá)載體pET-32a(+)，均由西北農(nóng)林科技大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)院畜禽疫病防治與畜產(chǎn)品安全實(shí)驗(yàn)室保存。

1.2 方 法

1.2.1 引物設(shè)計(jì)與合成 針對(duì)豬Jiv基因最大ORF序列用Primer Premier 6.0引物設(shè)計(jì)軟件設(shè)計(jì)2對(duì)引物，克隆用引物：上游引物JivF 5′-ATGGCCCAGAAGCACCCC-3′，下游引物JivR 5′-ACGTTGGAAGGGCCTCCTC-3′；表達(dá)用引物：上游引物 Jivf 5′-GAAGATCTCATGGCCCAGAAGCACCC-3′(下劃線為BglⅡ酶切位點(diǎn))，下游引物 Jivr 5′-CCCAAGCTTACGTTGGAAGGGCCTCC-3′(下劃線為Hind Ⅲ酶切位點(diǎn))。引物由北京華大基因公司合成。

1.2.2 豬Jiv基因序列的擴(kuò)增與原核載體的構(gòu)建 用Trizol法從豬脾臟組織中提取RNA，按反轉(zhuǎn)錄試劑盒說明反轉(zhuǎn)錄合成cDNA。以cDNA為模板，JivF和JivR為上、下游引物，利用Pfu高保真擴(kuò)增酶進(jìn)行PCR擴(kuò)增，同時(shí)設(shè)立陰性對(duì)照(以ddH2O代替cDNA模板)。PCR擴(kuò)增體系25 μL：5×Pfubuffer with MgSO42.5 μL，dNTPs (各2 mmol/L) 2.5 μL，JivF (10 μmol/L) 1.0 μL，JivR (10 μmol/L) 1.0 μL，cDNA 1 μg，Pfu高保真擴(kuò)增酶0.5 μL，ddH2O加至25 μL。反應(yīng)條件如下：95 ℃預(yù)變性5 min；94 ℃變性30 s，65 ℃退火30 s，72 ℃延伸2 min，共35個(gè)循環(huán)；72 ℃延伸10 min。按膠回收試劑盒說明純化PCR產(chǎn)物。對(duì)于純化后PCR產(chǎn)物，進(jìn)行末端加poly(A)尾。反應(yīng)體系20 μL：2×TaqMix 10 μL，PCR產(chǎn)物10 μL。反應(yīng)條件如下：72 ℃延伸30 min。將加poly(A)尾后的產(chǎn)物與pMD19-T載體粘性連接，構(gòu)建pMD19T-Jiv質(zhì)粒，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化E.coliDH5α感受態(tài)細(xì)胞，挑取菌落PCR結(jié)果為陽(yáng)性的單克隆菌落進(jìn)行擴(kuò)大培養(yǎng)，并提取陽(yáng)性菌液質(zhì)粒，送北京華大基因公司測(cè)序。

以質(zhì)粒pMD19T-Jiv為模板，Jivf和Jivr為上、下游引物，利用Pfu高保真擴(kuò)增酶進(jìn)行PCR擴(kuò)增目的基因，反應(yīng)體系和程序同上，將PCR產(chǎn)物和pET-32a(+)分別用BglⅡ、Hind Ⅲ進(jìn)行雙酶切，酶切產(chǎn)物純化回收后利用T4 DNA連接酶于16 ℃連接過夜，構(gòu)建pET32a-Jiv載體。將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化Rosetta(DE3)感受態(tài)細(xì)胞。經(jīng)菌落PCR初步鑒定后，挑取陽(yáng)性單克隆菌落搖菌培養(yǎng)后提取質(zhì)粒，進(jìn)行BglⅡ/Hind Ⅲ雙酶切鑒定及序列測(cè)定(測(cè)序由北京華大基因公司完成)。

1.2.3 豬Jiv蛋白序列分析 應(yīng)用DNA Star軟件(lasergene7.0)對(duì)克隆獲得的豬Jiv基因序列進(jìn)行分析，預(yù)測(cè)分析其蛋白的疏水性、抗原指數(shù)和表面分布可能性。

1.2.4 豬Jiv融合蛋白的誘導(dǎo)表達(dá)及純化、復(fù)性 將原核表達(dá)載體pET32a-Jiv轉(zhuǎn)化Rosetta(DE3)感受態(tài)細(xì)胞進(jìn)行培養(yǎng)，待培養(yǎng)物OD600為0.4～0.6，加入IPTG至終濃度為1 mmol/L誘導(dǎo)表達(dá)4 h。取誘導(dǎo)表達(dá)產(chǎn)物，4 ℃超聲(10 s/10 s，10 min)破碎細(xì)胞后對(duì)表達(dá)產(chǎn)物進(jìn)行SDS-PAGE分析，并設(shè)立誘導(dǎo)的pET-32a(+)和未誘導(dǎo)的pET32a-Jiv為對(duì)照。待出現(xiàn)與預(yù)期分子質(zhì)量大小相符的蛋白條帶后，對(duì)融合蛋白最佳表達(dá)條件進(jìn)行摸索，包括最佳IPTG誘導(dǎo)濃度(0.1，0.3，0.5，0.8，1.0 mmol/L)和最佳誘導(dǎo)時(shí)間(2，4，6，8和10 h)，分別按照上述條件誘導(dǎo)融合蛋白的表達(dá)，取誘導(dǎo)表達(dá)產(chǎn)物，進(jìn)行SDS-PAGE分析，同時(shí)設(shè)立誘導(dǎo)的pET-32a(+)和未誘導(dǎo)的pET32a-Jiv為對(duì)照。

在最佳表達(dá)條件下對(duì)陽(yáng)性菌液進(jìn)行大體積誘導(dǎo)培養(yǎng)，取誘導(dǎo)后的菌液，室溫下5 000 r/min離心10 min，收集上清液，用PBS清洗重懸細(xì)菌沉淀，4 ℃超聲(10 s/10 s，30 min)破碎細(xì)胞后12 000 r/min離心10 min，棄上清液，收集包涵體沉淀。用Buffer B (100 mmol/L NaH2PO4，10 mmol/L Tris-HCl，8 mol/L 尿素)室溫下孵育溶解包涵體1 h，12 000 r/min 離心30 min，棄去沉淀，取上清液準(zhǔn)備過Ni-NTA His Resin柱。先用Buffer B對(duì)柱子進(jìn)行預(yù)平衡，加入2 mL上清液樣品于柱中，在室溫下?lián)u晃30 min，后用4倍柱體積的Buffer C(100 mmol/L NaH2PO4，10 mmol/L Tris-HCl，50 mmol/L 咪唑，8 mol/L 尿素 )洗去雜蛋白，再用2倍柱體積Buffer E(100 mmol/L NaH2PO4，10 mmol/L Tris-HCl，150 mmol/L 咪唑，8 mol/L 尿素)洗柱4次，收集目的蛋白，對(duì)純化后的目的蛋白進(jìn)行SDS-PAGE分析，同時(shí)設(shè)立誘導(dǎo)的pET-32a(+)、未誘導(dǎo)的pET32a-Jiv和純化前誘導(dǎo)的pET32a-Jiv作為對(duì)照。將收集的純化后融合蛋白轉(zhuǎn)入透析袋中，在4 ℃條件下將透析袋分別放入不同濃度尿素(6，4，2和1 mol/L)的透析液B (20 mmol/L Tris-HCl，pH 8.0)中進(jìn)行由高到低梯度透析復(fù)性，每個(gè)濃度透析12 h，并用磁力攪拌器攪拌。再分別用透析液C(20 mmol/L Tris-HCl，0.6 mmol/L L-精氨酸，100 g/L蔗糖，2 mmol/L EDTA，0.5 mol/L尿素)和透析液D(20 mmol/L Tris-HCl,25 mmol/L NaCl，0.2 mol/L 尿素)透析12 h，透析完成后用PEG8000濃縮蛋白，于-20 ℃分裝保存。

1.2.5 多克隆抗體的制備 用純化后的豬Jiv融合蛋白免疫新西蘭白兔，初次免疫蛋白量為400 μg/只，同時(shí)加入等體積的弗氏完全佐劑，完全乳化后分點(diǎn)注射于肩部皮下；后續(xù)4次加強(qiáng)免疫量為500 μg/只，并混入等體積的弗氏不完全佐劑，完全乳化后分點(diǎn)注射于背部皮下。每次免疫間隔2周。最后一次免疫后1周耳緣靜脈采集血樣，利用間接ELISA法測(cè)定血清效價(jià)，滿足試驗(yàn)需求后處死動(dòng)物，采集多抗血清，并在-20 ℃分裝保存。

1.2.6 抗體效價(jià)的間接ELISA法測(cè)定 以純化得到的豬Jiv融合蛋白樣品作為抗原包被ELISA板，每孔加入100 μL抗原(質(zhì)量濃度為0.1 μg/μL)，4 ℃過夜包被。次日棄去孔內(nèi)液體，用300 μL 洗滌液(0.01 mol/L、pH 7.4 PBS，0.05% Tween-20)洗滌5次，每次3 min。每孔加入封閉緩沖液(體積分?jǐn)?shù)1.5% 牛血清白蛋白)300 μL，37 ℃封閉1 h；棄去封閉緩沖液，用洗滌液洗滌5次，加入不同稀釋度的本試驗(yàn)制備的多克隆抗體血清(梯度稀釋1∶200，1∶400，1∶800，1∶1 600，1∶3 200，1∶6 400，1∶12 800，1∶25 600)，同時(shí)設(shè)立空白對(duì)照(用PBS代替多克隆抗體血清)和每個(gè)稀釋度的陰性血清對(duì)照(未進(jìn)行豬Jiv融合蛋白免疫的兔血清)，37 ℃孵育1 h；棄去孔內(nèi)液體，加入洗滌液反復(fù)洗滌5次，每次3 min；每孔加入100 μL HRP標(biāo)記的羊抗兔IgG二抗 (1∶5 000稀釋)，37 ℃孵育1 h；棄去液體，用洗滌液洗滌5次后，加入100 μL TMB底物溶液作用30 min，再加入100 μL終止液(2 mmol/L H2SO4)，用酶標(biāo)儀(用空白對(duì)照調(diào)零)測(cè)定各孔OD450，以免疫血清樣品OD450≥2倍陰性對(duì)照血清OD450時(shí)的最大稀釋度作為該抗體的效價(jià)檢測(cè)。

1.2.7 抗體特異性的Western blot分析 將豬脾臟組織裂解上清液、純化的豬Jiv融合蛋白用于SDS-PAGE電泳，同時(shí)以牛血清白蛋白作為陰性對(duì)照。電泳后，將蛋白電轉(zhuǎn)到硝酸纖維膜上，多克隆抗體以1∶500稀釋，進(jìn)行Western blot檢測(cè)。

2 結(jié)果與分析

2.1 豬Jiv基因的克隆及原核表達(dá)載體的構(gòu)建

從豬脾臟組織中提取總RNA后反轉(zhuǎn)錄合成cDNA，以cDNA為模板PCR擴(kuò)增到1條2 000 bp左右的片段(圖1)。將Jiv基因連接到pMD19-T載體，轉(zhuǎn)化E.coliDH5α，對(duì)菌落PCR鑒定結(jié)果陽(yáng)性的單菌落擴(kuò)大培養(yǎng)，提取陽(yáng)性菌液質(zhì)粒，測(cè)序后發(fā)現(xiàn)，本試驗(yàn)克隆的Jiv與NCBI中已有豬源Jiv序列(登錄號(hào)：NM_001185066.1)一致，長(zhǎng)度為2 112 bp。pET32a-Jiv原核表達(dá)載體經(jīng)雙酶切鑒定，獲得了5 900和2 112 bp的片段(圖2)；測(cè)序分析發(fā)現(xiàn)，本試驗(yàn)克隆的Jiv核苷酸序列與已報(bào)道的豬Jiv序列100%相符，說明原核表達(dá)載體pET32a-Jiv構(gòu)建成功。

2.2 豬Jiv蛋白序列分析

利用DNA Star軟件對(duì)獲得的豬Jiv蛋白進(jìn)行序列分析，發(fā)現(xiàn)在241～386段具有較高的疏水性，同時(shí)此段也具有較低的抗原指數(shù)，可能預(yù)示此處為一段跨膜區(qū)域。Jiv蛋白的N端和C端有較高的親水性、抗原指數(shù)和表面分布可能性(圖3)。綜合分析預(yù)測(cè)結(jié)果，Jiv蛋白的N端和C端都有可能是B細(xì)胞識(shí)別位點(diǎn)，因此Jiv蛋白可以作為潛在抗原引起免疫動(dòng)物產(chǎn)生免疫反應(yīng)。

2.3 豬Jiv融合蛋白的誘導(dǎo)表達(dá)及其可溶性分析

結(jié)果顯示，經(jīng)IPTG誘導(dǎo)后，菌體表達(dá)出現(xiàn)大量分子質(zhì)量為95 ku的產(chǎn)物，主要以包涵體的形式存在(圖4)。

2.4 豬Jiv融合蛋白誘導(dǎo)表達(dá)條件的優(yōu)化

利用不同濃度IPTG誘導(dǎo)融合蛋白的表達(dá)，結(jié)果顯示,當(dāng)IPTG終濃度超過0.5 mmol/L時(shí)，重組蛋白表達(dá)增長(zhǎng)緩慢，考慮到IPTG存在一定的細(xì)胞毒性，所以選取0.5 mmol/L為最佳誘導(dǎo)劑終濃度(圖5)；對(duì)含有pET32a-Jiv的Rosetta(DE3)菌株進(jìn)行不同時(shí)間的誘導(dǎo)表達(dá)，結(jié)果顯示，當(dāng)連續(xù)誘導(dǎo)后6 h后，重組蛋白表達(dá)量基本穩(wěn)定(圖6)，因此確定最佳誘導(dǎo)時(shí)間為6 h。

圖3 豬Jiv蛋白序列的親水性、抗原指數(shù)和表面分布可能性分析
Fig.3 Analysis of hydrophilicity,antigenic index and surface probability of swine Jiv protein

2.5 豬Jiv融合蛋白的純化

使用Ni-NTA His Resin柱純化目的蛋白，在95 ku處出現(xiàn)一條帶，其大小與理論值相符(Jiv蛋白分子質(zhì)量為78 ku，His標(biāo)簽蛋白分子質(zhì)量為17 ku)，同時(shí)樣品蛋白所含雜帶較少，說明最終純化到的目的蛋白純度較高(圖7)，可以作為抗原免疫動(dòng)物。

圖6 誘導(dǎo)時(shí)間對(duì)豬Jiv融合蛋白誘導(dǎo)表達(dá)的影響
M.蛋白質(zhì)分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn);1.誘導(dǎo)的pET-32a(+);2.未誘導(dǎo)的pET32a-Jiv;3～7.分別誘導(dǎo)2,4,6,8,10 h的pET32a-Jiv
Fig.6 Effects of induction time on expression of Jiv fusion protein
M.Protein Marker;1.Induced cells containing pET-32a(+);2.Uninduced cells containing pET32a-Jiv;3-7.Cells containing pET32a-Jiv induced for 2,4,6,8 and 10 h,respectively

圖7 純化豬Jiv融合蛋白的SDS-PAGE電泳結(jié)果
M.蛋白質(zhì)分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn);1.誘導(dǎo)的pET-32a(+); 2.未誘導(dǎo)的pET32a-Jiv;3.純化前誘導(dǎo)的pET32a-Jiv; 4.純化的豬Jiv融合蛋白
Fig.7 Analysis of purified swine Jiv fusion protein by SDS-PAGE
M.Protein Marker;1.Induced cells containing pET-32a(+); 2.Uninduced cells containing pET32a-Jiv;3.Induced cells containing pET32a-Jiv;4.Purified His-Jiv fusion protein

2.6 抗豬Jiv蛋白多克隆抗體血清的效價(jià)

用間接ELISA法測(cè)定抗體效價(jià)，結(jié)果顯示，抗豬Jiv蛋白多克隆抗體血清的效價(jià)較高，達(dá)1∶6 400(圖8)。

圖8 抗豬Jiv蛋白多克隆抗體血清的效價(jià)
Fig.8 Titers of polyclonal antibody against swine Jiv protein

2.7 抗豬Jiv蛋白抗體特異性的檢測(cè)

用Western blot檢驗(yàn)抗豬Jiv蛋白多克隆抗體的特異性，結(jié)果顯示，自制的多克隆抗體與Jiv融合蛋白和組織中的豬Jiv蛋白發(fā)生反應(yīng)均產(chǎn)生分子質(zhì)量正確的蛋白條帶，與非特異性蛋白未發(fā)生反應(yīng)(圖9)，說明抗體有良好特異性。

3 討 論

Jiv蛋白作為宿主細(xì)胞分子伴侶蛋白HSP40家族的一個(gè)成員，其與病毒的相互作用不斷被人們所關(guān)注。Jiv蛋白可以促進(jìn)瘟病毒屬(Pestivirus)成員BVDV非結(jié)構(gòu)蛋白NS2-3前體蛋白的切割，進(jìn)而促進(jìn)病毒復(fù)制，最終影響B(tài)VDV的表型[3]，其也參與黃病毒屬(Flavivirus)成員黃熱病病毒(Yellow fever virus,YFV)的病毒復(fù)制復(fù)合體的形成[8]，大量表達(dá)Jiv蛋白后可減少由YFV引起的細(xì)胞死亡[9]。而這些病毒都與人類生命健康和動(dòng)物健康息息相關(guān)[10-11]。

目前研究發(fā)現(xiàn)，在Jiv蛋白與CSFV相互作用過程中，已經(jīng)可以確定Jiv90區(qū)段與CSFV NS2蛋白發(fā)生結(jié)合，促使NS2發(fā)揮蛋白酶作用切割NS2-3蛋白前體[4]，釋放出的NS3蛋白進(jìn)一步發(fā)揮其蛋白酶作用并產(chǎn)生放大效應(yīng)，引起與病毒復(fù)制相關(guān)非結(jié)構(gòu)蛋白NS4A、NS5A、NS5B在病毒感染細(xì)胞初期大量累積[12-13]，為病毒的快速?gòu)?fù)制創(chuàng)造條件[14]，類似的機(jī)制在Jiv蛋白與BVDV相互作用過程中也有報(bào)道[3,15]。在CSFV基因組中插入Jiv90后構(gòu)建的嵌合Alfort-Jiv毒株并未引起被感染宿主的大量死亡，反而引起機(jī)體產(chǎn)生中和CSFV的高滴度抗體，有效地保護(hù)了宿主，其對(duì)應(yīng)的NCP型CSFV Alfort-p447株感染宿主后則產(chǎn)生了典型豬瘟臨床癥狀[4]。CP型CSFV vA187-1毒株也可引起被感染細(xì)胞產(chǎn)生CPE效應(yīng)，其基因序列中沒有Jiv序列的插入，其病毒RNA復(fù)制、非結(jié)構(gòu)蛋白NS3的表達(dá)動(dòng)力學(xué)以及引起的豬瘟臨床癥狀并未與相對(duì)應(yīng)的NCP型CSFV vA187-1株有明顯差異[16-17]。說明CSFV Alfort-Jiv毒株與宿主相互作用過程中存在其特殊性，提示這種特殊性可能是由于Jiv序列的插入引起的，因此筆者推斷，Jiv插入引起的CP型CSFV與宿主之間存在更為復(fù)雜的作用網(wǎng)絡(luò)，可能參與了宿主的免疫調(diào)節(jié)反應(yīng)。

譚學(xué)超等[18]發(fā)現(xiàn)，Jiv基因在豬體不同組織臟器中存在不同表達(dá)分布，在豬瘟病毒靶組織(如脾臟)中，Jiv基因表達(dá)量顯著高于非靶組織。因此，本研究在提取JivRNA時(shí)，選取其表達(dá)量高的豬脾臟組織作為材料，經(jīng)過RT-PCR后獲得濃度較高的JivDNA。為了深入研究Jiv蛋白與CSFV的相互作用，以及可能參與到的宿主免疫調(diào)節(jié)功能，本試驗(yàn)構(gòu)建了pET32a-Jiv原核表達(dá)載體，純化了豬Jiv融合蛋白并制備相應(yīng)的特異性抗體，為后續(xù)蛋白功能研究提供了基礎(chǔ)材料。

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Cloning and expression of swineJivgene and preparation of its polyclonal antibody

LIU Wei,GUO Kang-kang,LIN Zhi,SHENG Jie,ZHAO Di,ZHAO Zi-yin,ZHANG Yan-ming

(CollegeofVeterinaryMedicine,NorthwestA&FUniversity,Yangling,Shaanxi712100,China)

【Objective】 This study aimed to clone the 2 112 bpJivgene from core area of swine Jiv protein,construct the prokaryotic expression vector for the expression and purification of fusion protein,and prepare polyclonal antibody against swine Jiv protein.【Method】 TheJivgene was amplified by RT-PCR from swine spleen tissues and cloned into pMD19-T vector to sequence.It also acted as template to construct prokaryotic expression vector pET32a-Jiv and the recombinant vector was transformed intoE.coliRosetta (DE3).Swine Jiv fusion proteins with the inclusion form were obtained inducing by IPTG and were purified by Ni2+charged column.After purification,inclusion body was refolded through dialysis renaturation.400 μg protein was injected into each New Zealand white rabbit as the first immunization and 500 μg protein as strengthening immunization was used for a total of five times.When titers of antibodies detected by indirect ELISA reached a certain level,the antibodies were collected and identified by Western blot.【Result】 The fragment of swineJivgene with the length of 2 112 bp was successfully obtained.The constructed pET32a-Jiv was highly expressed inE.coliRosetta (DE3) after induction by IPTG.SDS-PAGE showed that the purified fusion protein was about 95 ku.The titer of antibodies was 1∶6 400 and Western blot showed that the obtained antibodies could be used to detect swine Jiv protein effectively.【Conclusion】 SwineJivgene was cloned and the polyclonal antibodies against swine Jiv protein were prepared.

swine Jiv protein;prokaryotic expression;polyclonal antibody;classical swine fever virus

2013-10-18

西北農(nóng)林科技大學(xué)基本科研業(yè)務(wù)費(fèi)項(xiàng)目(QN2011109)； 國(guó)家自然科學(xué)基金項(xiàng)目(31172339)

劉 偉(1987-)，男，陜西戶縣人，在讀碩士，主要從事分子病原學(xué)研究。E-mail：liuwei2001@126.com

張彥明(1956-)，男，陜西南鄭人，教授，博士生導(dǎo)師，主要從事分子病原學(xué)與病毒致病機(jī)理研究。 E-mail：zhangym@nwsuaf.edu.cn

時(shí)間:2015-01-05 08:59

10.13207/j.cnki.jnwafu.2015.02.027

S852.65+1；Q785

A

1671-9387(2015)02-0007-07

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