鉤藤堿治療骶上脊髓損傷致逼尿肌反射亢進大鼠的實驗研究

劉仁杰，姜華茂，何春秀

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·論著·

鉤藤堿治療骶上脊髓損傷致逼尿肌反射亢進大鼠的實驗研究

劉仁杰，姜華茂，何春秀

目的 探討鉤藤堿對骶上脊髓損傷(SSCI)致神經(jīng)源性膀胱大鼠逼尿肌反射亢進的治療作用及其機制。方法 將10周齡健康雌性SD大鼠30只(SPF級)按照隨機數(shù)字表法分為對照組、模型組、治療組，每組10只。對照組不做任何手術(shù)處理，模型組和治療組采用脊髓橫斷法制備神經(jīng)源性膀胱模型。對照組和模型組腹腔注射0.9%氯化鈉溶液，治療組注射鉤藤堿(5 mg/kg)。對照組10只大鼠全部存活，模型組8只造模成功，治療組8只造模成功。4周后，大鼠膀胱行尿動力學檢測，離體逼尿肌條電生理學指標檢測，膀胱病理切片HE染色觀察，蛋白質(zhì)印跡法檢測c-kit蛋白的表達，激光共聚焦顯微鏡下觀察Cajal間質(zhì)細胞(ICC)數(shù)量變化，實時熒光PCR檢測ICC中T型鈣通道蛋白亞型α1G基因表達水平。結(jié)果 與模型組相比，治療組膀胱最大容量增大(q=8.251,P<0.05)，膀胱漏尿點壓(q=3.764,P<0.05)和膀胱充盈壓均減小(q=5.687,P<0.05)，逼尿肌收縮頻率降低(q=9.661,P<0.05)，最小張力增大(q=5.217,P<0.05)，c-kit蛋白表達降低(q=13.688,P<0.05)，ICC數(shù)量減少(q=7.060,P<0.05)，α1G基因表達量降低(q=8.762,P<0.05)，差異均有統(tǒng)計學意義。病理切片下觀察到治療組逼尿肌無斷裂，肌間隙增寬減少。結(jié)論 鉤藤堿通過減少神經(jīng)源性膀胱逼尿肌ICC數(shù)量，抑制ICC T型鈣通道蛋白亞型α1G基因的表達來抑制ICC起搏興奮活性，從而減輕逼尿肌的過度亢進，使逼尿肌興奮性趨于正常。

逼尿肌過度活動；膀胱, 神經(jīng)原性；鉤藤堿；Cajal間質(zhì)細胞；鈣通道, T型；α1G基因

神經(jīng)源性膀胱(NGB)是一類由神經(jīng)病變或損害引起的膀胱和/或尿道功能障礙性疾病，嚴重影響患者的生活質(zhì)量[1]。關(guān)于膀胱疾病的病因研究中，膀胱的肌源性研究越來越受到重視。近來研究表明，Cajal間質(zhì)細胞(ICC)具有特征性的非選擇性陽離子內(nèi)向電流，是逼尿肌興奮的重要起搏細胞[2]。其興奮功能的改變可能與逼尿肌反射亢進相關(guān)。

鉤藤堿主要來源于茜草科植物鉤藤，現(xiàn)代藥理學研究表明，鉤藤堿可濃度依賴性地開放大鼠動脈平滑肌細胞大電導鈣激活鉀離子通道使平滑肌舒張，發(fā)揮其心腦血管保護作用[3]。有學者在前期的研究中證實了在骶上脊髓損傷(SSCI)導致的NGB中，鉤藤堿能夠改善膀胱逼尿肌的過度活動[4]；后期研究發(fā)現(xiàn)，鉤藤堿對膀胱漏尿點壓、充盈壓以及膀胱的最大容量均有保護作用[5]，這可能與逼尿肌ICC有關(guān)。本研究進一步研究了鉤藤堿是否通過作用于ICC而治療NGB，探討其作用機制，以期為NGB的治療提供新思路。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 主要藥品與試劑 鉤藤堿(上海齊奧化工科技有限公司，純度99%)；兔抗鼠c-kit多克隆抗體，兔抗鼠β-actin多克隆抗體，辣根過氧化物酶標記羊抗兔二抗(武漢博士德生物公司)；DAPI細胞染色液(中國碧云天生物技術(shù)公司)；多聚甲醛(北京索萊寶科技有限公司)；PVDF膜(瑞士Roche公司)；實時熒光定量PCR試劑盒(美國ABI公司)；Krebs營養(yǎng)液參照規(guī)范配置。

1.1.2 儀器 四通道多功能生理信號放大器，AV1271微量灌注泵(美國3M公司)；Sirius8000尿動力儀(德國WIEST公司)；拉力傳感器(北京航空航天研究所)；臺式高速冷凍離心機(德國Sigma公司)；TCS SP5型激光共聚焦顯微鏡(德國Leica公司)；ABI 7300 real-time PCR儀(美國ABI公司)。

1.1.3 實驗動物 10周齡健康雌性SD大鼠30只(SPF級)，購自遼寧醫(yī)學院實驗動物中心，動物合格證號：LY20131022，體質(zhì)量200～220 g。實驗期間正常光照，自由飲食、飲水。

1.2 方法

1.2.1 實驗分組及大鼠NGB模型制作 將30只大鼠按照隨機數(shù)字表法分為3組：對照組、模型組、治療組，每組10只。鉤藤堿根據(jù)人與大鼠臨床用藥劑量換算公式，用量每只每天為5 mg/kg，用pH 6.0～6.5的稀鹽酸藥物溶劑溶解配成所需濃度。對照組不做任何手術(shù)處理，模型組和治療組采用趙雪燕等[6]脊髓橫斷法制備SSCI導致的NGB模型。對照組和模型組腹腔注射0.9%氯化鈉溶液，治療組腹腔注射鉤藤堿溶液，均1次/d，共注射4周。

1.2.2 尿流動力學檢測 4周后大鼠進行尿流動力學檢測：10%水合氯醛3 ml/kg腹腔注射麻醉，仰臥位固定，經(jīng)恥骨弓上縱行切開皮膚找到膀胱，用針頭將剪有側(cè)孔的硬膜外導管導入膀胱，然后荷包縫合將導管固定，排空膀胱后硬膜外導管與測壓導管連接，然后經(jīng)三通管與尿動力儀及微量灌注泵分別相連，以0.2 ml/min的速度行膀胱灌注，記錄膀胱壓力變化和灌注量之間的關(guān)系，有尿液連續(xù)流出時終止灌注。所有操作完畢后腹腔內(nèi)注射慶大霉素2萬單位。

1.2.3 離體逼尿肌條機械牽拉實驗 在尿流動力學檢測后第2天，猛擊大鼠頭部致暈，仰臥固定剪開下腹，全切膀胱，取膀胱體部縱行切成10 mm×3 mm×3 mm的肌條，立即置入4 ℃ Krebs營養(yǎng)液中。肌條的兩端用絲線結(jié)扎，一端通過器官槽底部小掛鉤和微調(diào)螺旋相連，另一端和拉力傳感器感應頭相連。器官槽內(nèi)充滿37 ℃恒溫Krebs營養(yǎng)液，通以持續(xù)低流量的95%O2和5%CO2混合氣體。設(shè)置記錄軟件的參數(shù)進行以下實驗。

1.2.3.1 檢測在固定張力下逼尿肌的收縮頻率 調(diào)節(jié)微螺旋，牽拉肌條張力達到1.0g時將肌條固定，檢測逼尿肌收縮頻率(連續(xù)位相性收縮中舒張張力達到收縮張力最大值的三分之一以上時，計為1次單收縮，單位時間內(nèi)收縮數(shù)目的均值記為收縮頻率)。

1.2.3.2 檢測機械牽拉導致逼尿肌收縮時的最小張力 將肌條置于完全放松無張力狀態(tài)，調(diào)節(jié)微調(diào)螺旋，緩慢牽拉肌條直至其開始出現(xiàn)收縮，記錄逼尿肌剛收縮時的張力，記為最小張力。此時最小張力反映逼尿肌對興奮刺激的閾值。

1.2.4 膀胱逼尿肌結(jié)構(gòu)改變 留取部分膀胱組織用10%多聚甲醛固定后做成蠟塊，切片并行HE染色，觀察各組逼尿肌形態(tài)學變化。

1.2.5 蛋白質(zhì)印跡法檢測平滑肌c-kit蛋白的表達 取膀胱組織200 mg，超純水沖洗數(shù)次，去除殘余的血細胞和結(jié)締組織。用剪刀剪碎組織塊加入裂解液并且勻漿，放在冰上靜置10～20 min，離心機12 000 r/min，離心半徑8 cm，4 ℃離心10 min。取上清液2 μl，用BCA法進行蛋白定量。每孔上樣20 μl，然后SDS-PAGE電泳，轉(zhuǎn)膜，搖床上封閉15 min，加入兔抗鼠c-kit抗體(1∶400)，4 ℃下過夜，TBST清洗后加羊抗兔二抗，孵育1 h。ECL顯影，用Scion Image軟件進行條帶分析，c-kit蛋白相對表達量為目的蛋白密度值與內(nèi)參密度值的比值。

1.2.6 膀胱肌層撕片及細胞染色，激光共聚焦顯微鏡下對ICC計數(shù) 取部分膀胱組織，用5%多聚甲醛溶液浸泡固定8 h，取出后仔細撕掉漿膜層和黏膜層，保留逼尿肌層。然后在普通顯微鏡下，將逼尿肌層做成100～200 μm厚的組織撕片。用DAPI染色液對細胞核染色10 min，然后放在激光共聚焦顯微鏡下進行觀察，每個標本隨機選取3個視野進行ICC計數(shù)，取平均值。

1.2.7 采用實時熒光定量PCR檢測α1G mRNA在膀胱中的表達 取部分膀胱組織，按照Trizol試劑盒說明書提取總RNA，將RNA用反轉(zhuǎn)錄試劑盒反轉(zhuǎn)錄成cDNA,取cDNA產(chǎn)物1 μl，加入上下游引物以及SYBR Green qpcr Master Mix，然后加入去離子DEPC水使整個反應體系為20 μl，進行PCR擴增：94 ℃預變性5 min，94 ℃變性30 s，51 ℃退火30 s，72 ℃延長30 s，擴增30個循環(huán)。擴增完畢后，以GAPDH為內(nèi)參照基因，目的基因表達的相對定量值用如下公式計算：目的基因的相對量=2-ΔΔCt，ΔΔCt=ΔCt待測-ΔCt對照，ΔCt待測=〔Ct GI(待測樣品)-Ct GAPDH(待測樣品)〕，ΔCt對照=〔Ct GI(對照樣品)-Ct GAPDH(對照樣品)〕。Ct是熱循環(huán)儀檢測到反應體系中熒光信號的強度值，GI 是目的基因，對照樣品是任何被選做代表1倍目的基因表達量的樣品。引物由上海生工生物工程技術(shù)服務有限公司設(shè)計并合成，α1G引物：上游5′-TCAGGCGCCAGGCAGCAATAAG-3′，下游5′-CGACCCGCCCCAGAAGGATG-3′ 。GAPDH引物：上游5′-TGGGGTGATGCTGGTGCTGAGT-3′，下游5′-AGGTTTCTCCAGGCGGCATGTC-3′。

2 結(jié)果

2.1 實驗動物情況 對照組10只大鼠健康狀況良好，全部存活；模型組10只大鼠造模成功8只；治療組10只大鼠造模成功8只。大鼠死因為血尿、尿漏、尿路感染、腸梗阻。

2.2 尿動力學指標比較 與對照組比較，模型組和治療組膀胱最大容量減小，漏尿點壓、膀胱充盈壓均增大，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。與模型組比較，治療組膀胱最大容量增大，漏尿點壓、膀胱充盈壓均減小，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05，見表1)。

2.3 逼尿肌電生理指標比較 與對照組比較，模型組和治療組膀胱收縮頻率升高，最小張力減小，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。與模型組比較，治療組收縮頻率降低，最小張力增大，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05，見表1)。

Table1Comparisonofurodynamicanddetrusorelectrophysiologicalindictorsamongthethreegroups

組別例數(shù)膀胱最大容量(ml)漏尿點壓(cmH2O)膀胱充盈壓(cmH2O)收縮頻率(次/min)最小張力(g)對照組10212±0181726±1164855±434217±030069±004模型組8052±009a3368±690a8980±751a461±040a028±009a治療組8105±010ab2580±286ab7324±557ab307±024ab047±008abF值3617513442211471013225675253P值<0001<0001<0001<0001<0001

注：與對照組比較，aP<0.05；與模型組比較，bP<0.05

2.4 膀胱病理切片HE染色結(jié)果 光鏡下觀察，對照組黏膜、黏膜下層及平滑肌層均正常，細胞呈梭形或橢圓形，細胞之間平行排列，分布均勻。模型組逼尿肌出現(xiàn)斷裂，細胞排列紊亂，分布不均勻，細胞間隙增寬，黏膜層及黏膜下層有中性粒細胞浸潤，平滑肌細胞肥大，彈性纖維減少，膠原纖維增生。治療組膀胱肌細胞排列方向大體一致，少有逼尿肌斷裂，膠原纖維增生較少，細胞間炎性細胞浸潤減輕，尚有肌間隙增寬(見圖1)。

注：A=對照組，B=模型組，C=治療組

圖1 3組大鼠膀胱組織病理檢查(HE染色，×400)

Figure 1 Optional micrographs of rat bladder tissues

2.5 c-kit蛋白的表達 對照組c-kit蛋白相對表達量為(0.27±0.08)，模型組為(1.12±0.15)，治療組為(0.58±0.13)，3組間差異有統(tǒng)計學意義(F=262.915,P<0.05)；其中，模型組較對照組c-kit蛋白相對表達量增高(q=22.849,P<0.05)；治療組較模型組c-kit蛋白相對表達量降低(q=13.688,P<0.05,見圖2)。

注：A=對照組，B=模型組，C=治療組

圖2 3組大鼠c-kit蛋白表達

Figure 2 c-kit protein expression of the rats in three groups

2.6 膀胱ICC數(shù)量 ICC呈梭形，核大，有多個突起，細胞核染成藍色。對照組膀胱ICC數(shù)量為(4.3±0.9)個，模型組為(8.0±1.2)個，治療組為(6.0±1.2)個，3組間差異有統(tǒng)計學意義(F=24.925,P<0.05)；其中模型組較對照組增多(q=3.659,P<0.05)，治療組較模型組減少(q=7.060,P<0.05，見圖3)。

注：A=對照組，B=模型組，C=治療組

圖3 3組大鼠激光共聚焦顯微鏡下的ICC

Figure 3 ICC cells under confocal laser scanning microscope of the rats in three groups

2.7 實時熒光定量PCR檢測α1G mRNA相對表達量 對照組α1G mRNA相對表達量為(0.28±0.03)，模型組為(0.51±0.02)，治療組為(0.39±0.03)，3組間差異有統(tǒng)計學意義(F=185.676,P<0.05)；其中模型組較對照組增高(q=16.805,P<0.05)，治療組較模型組降低(q=8.762,P<0.05，見圖4)。

3 討論

NGB是指中樞或周圍神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)生病變引起的排尿功能障礙。有研究顯示，脊髓損傷的發(fā)病率為(20～>60)/100萬，而NGB是其最嚴重的并發(fā)癥之一，嚴重影響患者的生活質(zhì)量，甚至危及生命[7]。在脊髓損傷2～3周內(nèi)，無論是SSCI還是骶神經(jīng)損傷，均為脊髓休克期，這一時期的逼尿肌均不會發(fā)生反射，因此本研究將相關(guān)指標的檢測選在脊髓休克期之后。

注：A=對照組，B=模型組，C=治療組；與對照組比較，aP<0.05；與模型組比較，bP<0.05

圖4 3組大鼠α1G mRNA相對表達值

Figure 4 Relative expression values of α1G mRNA of the rats in three groups

3.1 尿動力學及逼尿肌電生理指標 SSCI大鼠4周后開始表現(xiàn)為逼尿肌亢進，緊張性增高，膀胱始終處于一種“收縮”的狀態(tài)，表現(xiàn)為膀胱內(nèi)壓的增高、膀胱最大容量減小。切取膀胱逼尿肌做成離體肌條，仍然可表現(xiàn)出亢進性，如在相同張力下，模型組逼尿肌條仍然能夠表現(xiàn)出高于對照組肌條的收縮頻率；產(chǎn)生興奮收縮所需要的最小張力較對照組低，以上結(jié)果均表明膀胱平滑肌有一定的“肌源性”，即不受神經(jīng)的支配仍然可以自主產(chǎn)生興奮收縮。尿動力學反映了膀胱逼尿肌的功能，電生理學指標反映了逼尿肌的穩(wěn)定性，本研究對大鼠應用鉤藤堿以后，逼尿肌功能得到改善，穩(wěn)定性增強，逼尿肌的過度亢進得到了明顯減輕，證明鉤藤堿對NGB的治療作用明顯。

3.2 膀胱病理切片HE染色 本研究病理切片下觀察到對照組膀胱逼尿肌排列規(guī)整有序，大小一致，分布均勻，肌細胞之間排列緊密幾乎沒有間隙。模型組逼尿肌排列紊亂，肌細胞間隙增寬，部分肌纖維有損傷甚至斷裂。而治療組膀胱肌細胞排列方向大體一致，少有斷裂，肌間隙不明顯。說明鉤藤堿作用于逼尿肌，能夠減輕其向病理狀態(tài)發(fā)展的程度或減緩其病變發(fā)展的速度。對于病變之后的逼尿肌，鉤藤堿是否能夠可逆性地使之恢復正常，本實驗沒有涉及，今后可以行進一步的實驗研究。

3.3 ICC數(shù)量、相關(guān)蛋白表達及基因表達 有研究表明，ICC具有自律性，缺少ICC的輸尿管平滑肌細胞不能形成慢波，單獨縱行肌或環(huán)形肌在離體狀態(tài)下也不能形成慢波[8]；另有研究顯示，用亞甲藍損傷ICC后，組織中檢測不到自發(fā)性的慢波[9]。近年來大量研究也證實了ICC是逼尿肌興奮的起搏細胞。而膀胱中的酪氨酸激酶受體c-kit，除了極其少量的肥大細胞外，只在ICC表達，c-kit已成為ICC的特異標志分子[10]。c-kit受體與ICC興奮密切相關(guān)，有研究表明ICC上的膽堿能受體M3能與c-kit結(jié)合，可興奮T型鈣通道電流[11]。c-kit抑制劑Imatinib同樣能抑制T型鈣通道電流，這表明ICC上的T型鈣通道電流很可能依賴c-kit的活化，因此c-kit的表達變化可以作為ICC興奮起搏活躍度的指標[12]。本研究顯示，治療組大鼠c-kit表達降低，ICC起搏興奮被抑制。近年來多項研究揭示了ICC與鈣通道之間有密切關(guān)系。有研究者在膀胱ICC上成功鑒定出T型鈣通道，其在細胞啟動興奮時發(fā)揮重要作用[13-14]。T型鈣通道蛋白α1G可用來作為T型鈣通道表達的良好檢測指標。本研究結(jié)果也驗證了這一點，治療組大鼠的α1G mRNA表達降低，提示T型鈣通道中蛋白α1G活性被抑制。

3.4 鉤藤堿在NGB治療方面的應用價值及作用機制 鉤藤堿不僅能對心肌產(chǎn)生作用，對于其他類型的平滑肌也有一定影響。已經(jīng)有文獻指出，鉤藤堿能改善膀胱的過度活動[15]。如果鉤藤堿能作用于亢進的膀胱逼尿肌使之收縮興奮性減弱，則能夠達到治療NGB的目的。本研究通過對3組大鼠的膀胱最大容量、漏尿點壓、膀胱充盈壓3項尿動力學指標及離體逼尿肌條的收縮頻率、最小張力2項電生理學指標進行比較，證明鉤藤堿對逼尿肌的過度活動有一定治療作用。并且通過檢測ICC特異性受體c-kit蛋白的表達及逼尿肌ICC數(shù)量，證明鉤藤堿的作用機制是通過阻斷或抑制ICC上T型鈣通道亞型α1G來減少ICC數(shù)量，從而減少了逼尿肌興奮的啟動來源，降低逼尿肌的過度興奮，減輕膀胱的過度活動。關(guān)于鉤藤堿是如何抑制ICC的數(shù)量，通過哪種方式抑制T型鈣通道亞型α1G基因表達，是否也抑制T型鈣通道上其他亞型的表達，還需進一步的實驗研究。

本文創(chuàng)新點：

(1)目前國內(nèi)外關(guān)于鉤藤堿在NGB治療方面的研究較少，本研究通過實驗證明了鉤藤堿對NGB的治療作用，為臨床NGB用藥提供了新思路。(2)發(fā)現(xiàn)鉤藤堿能夠從減少NGB逼尿肌ICC數(shù)量和降低ICC起搏興奮性兩方面來降低膀胱逼尿肌的亢進，提示ICC參與了膀胱生理和病理狀態(tài)下的功能調(diào)節(jié)，對膀胱興奮性的作用機制研究、NGB的治療以及作為多種泌尿系疾病的有效治療靶點，均有重要意義。

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(本文編輯：趙躍翠)

Experimental Study of the Effect of Phynchophylline on Detrusor Overactivity Induced by Sacral Spinal Cord Injury in Rats

LIURen-jie,JIANGHua-mao，HEChun-xiu.

TheFirstAffiliatedHospitalofLiaoningMedicalUniversity,Jinzhou121000,China

Objective To investigate the effects of phynchophylline on detrusor overactivity induced by sacral spinal cord injury(SSCI) in rats and the underlying mechanism.Methods Using random number table method, we divided 30 10-week female healthy SD rats into control group, model group and treatment group, with 10 rats in each group.No surgical intervention was made in control group, neurogenic bladder models were made in model group and treatment group by spinal cord transaction.Control group and model group were administrated with 0.9% sodium chloride solution by intraperitoneal infection.Treatment group was administrated with phynchophylline (5 mg/kg).10 rats in control group were all alive,successful model building was made in 8 rats in model group and 8 rats in treatment group.Four weeks later, urine dynamics testing was undertaken with the bladder of rats, in vitro test of the electrophysiological indicators of detrusor was conducted, the pathological sections of bladder were observed by HE staining method, c-kit protein expression was tested by western blotting method, the change in the number of ICC was observed under laser scanning confocal microscope, and the expression level of α1G gene of subunit of T-type calcium channels in ICC was detected by real-time PCR.Results Compared with the model group, the treatment group had larger maximum capacity of bladder(q=8.251,P<0.05), lower bladder leak point pressure(q=3.764,P<0.05), lower bladder filling pressure(q=5.687,P<0.05), lower detrusor contraction frequency(q=9.661,P<0.05), higher minimum tension(q=5.217,P<0.05), lower expression level of c-kit protein(q=13.688,P<0.05), lower number of ICC(q=7.060,P<0.05) and lower α1G gene expression(q=8.762,P<0.05).Conclusion Rhynchophylline can reduce the number of ICC cells in neurogenic detrusor and inhibit the pacemaker activity of ICC cells by inhibiting the expression of α1G gene of subunit of T-type calcium channels in ICC , thereby reducing excessive detrusor hyperactivity and make the excitability of detrusor become normal.

Overactive detrusor；Urinary bladder,neurogenic；Phynchophylline；ICC；Calcium channels, T-type；α1G gene

遼寧省科技廳計劃項目(2013225305)

121000遼寧省錦州市，遼寧醫(yī)學院附屬第一醫(yī)院(劉仁杰，姜華茂)；遼寧醫(yī)學院(何春秀)

姜華茂，121000遼寧省錦州市，遼寧醫(yī)學院附屬第一醫(yī)院；E-mail：lyyyjhm@163.com

R 694.5

A

10.3969/j.issn.1007-9572.2015.23.017

2015-04-10；

2015-06-25)

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