HPLC 法測定5-(2-氟苯基)-1H-吡咯-3-甲醛有關(guān)物質(zhì)

蒙發(fā)明 李敏英

（中山奕安泰醫(yī)藥科技有限公司 廣東中山 528437）

TAK438 為日本武田與2014 年3 月3 日向日本勞動衛(wèi)生福利部（MHLW）提交了實驗性胃酸分泌抑制劑TAK-438（通用名：vonoprazan 富馬酸）的新藥申請（NDA），該藥屬于鉀離子（K+）競爭性酸阻滯劑（P-CAB）的新一類抑制劑[1]，具有強(qiáng)勁、持久的胃酸分泌抑制作用，同時，在胃壁細(xì)胞胃酸分泌的最后一步中，通過抑制K+對H+,K+—ATP 酶（質(zhì)子泵）的結(jié)合作用，對胃酸分泌也具有提前終止作用。TAK06（CAS 號：881674-56-2）是合成TAK-438(富馬酸沃諾拉贊)的關(guān)鍵中間體，其分子式為C11H8FNO，化學(xué)名為5-(2-氟苯基)-1H-吡咯-3-甲醛。TAK06 的質(zhì)量直接影響TAK-438 的合成，為指導(dǎo)日常生產(chǎn)、控制產(chǎn)品質(zhì)量，本文建立了測定TAK06 有關(guān)物質(zhì)的方法。

一、 實驗部分

1.儀器

安捷倫1200 高效液相色譜儀（配DAD 檢測器）、梅特勒XS204 電子天平、艾科Exceed-Cd -24 純化水機(jī)

2.試藥及試劑

TAK06 對照品（自制，批號為TAK06-WRS，含最99.3%)，TAK06 雜質(zhì)A（自制，批號為20150101），TAK06 雜 質(zhì)B（ 自 制， 批 號 為20150102），TAK06雜 質(zhì)C（ 自 制， 批 號 為20150103），TAK06 樣 品（ 自 制， 批 號 為TAK06R150101，TAK06R150102，TAK06R150103）；乙腈（色譜純）；甲酸（分析純）；實驗用水為純化水。

二、方法與結(jié)果

1.色譜條件

色譜柱： 苯基柱(4.6*250mm,5um) ；流動相：流動相A 為0.1%甲酸水溶液，流動相B 為乙腈，梯度洗脫（見下表1）；檢測波長：254nm ；柱溫：30℃；流速：1.0ml/min；進(jìn)樣量：20ul；理論板數(shù)按照TAK06 計不得低于3000，TAK06 主峰與相鄰雜質(zhì)峰的分離度應(yīng)符合要求。

表1：流動相梯度洗脫

2.有關(guān)物質(zhì)的測定

取TAK06 樣品適量，用乙腈制成約0.1mg/ml 溶液，作為供試品溶液；精密取供試品溶液1ml,用乙腈稀釋至100ml,作為對照溶液，取空白溶液、供試品溶液、對照溶液各20μl，分別注入液相色譜儀，記錄色譜圖，扣除空白，如果供試品溶液中有雜質(zhì)峰，與對照溶液主峰面積比較，計算最大單個雜質(zhì)及總雜質(zhì)，單個雜質(zhì)不得過0.5%，總雜質(zhì)不得過2.0%。

3.有關(guān)物質(zhì)方法的驗證

（1）系統(tǒng)適應(yīng)性：分別取TAK06 對照品、TAK06雜質(zhì)A、TAK06 雜質(zhì)B、TAK06 雜質(zhì)C 適量，置于同一容量瓶中，用乙腈溶解混合溶液，作為系統(tǒng)適應(yīng)性溶液。取空白溶液、系統(tǒng)適應(yīng)性溶液各20μl，分別注入液相色譜儀，記錄色譜圖（見下圖）。結(jié)果表明，空白無干擾，出峰順序為：雜質(zhì)A、雜質(zhì)C、雜質(zhì)B、TAK06；系統(tǒng)適應(yīng)性中4 種物質(zhì)分離度符合要求，理論板數(shù)符合要求。

（2）專屬性試驗：取TAK06樣品適量，分別用1.0mol/L 鹽酸、1.0mol/L 氫氧化鈉、5%雙氧水、105℃高溫及4500Lx 光照對其進(jìn)行破環(huán)試驗，試驗后按照2.1 色譜條件進(jìn)行檢測。結(jié)果表明：色譜圖中主峰與相鄰雜質(zhì)峰能完全分離；TAK06 主峰均能與酸、堿、氧化、高溫、光照降解產(chǎn)物較好分離，說明本法的專屬性良好。

（3）線性范圍：取TAK06 對照品適量，用乙腈制成 濃 度 分 別 為10ug/ml、20ug/ml、50ug/ml、80ug/ml、100ug/ml、 120ug/ml 的溶液，各取20μl，連同空白溶劑分別注入液相色譜儀，記錄色譜圖。以濃度C 對TAK06主峰面積A 進(jìn)行線性回歸（見下圖），得回歸方程為：Y=131.64X-29.978，R=0.9997 結(jié)果表明，TAK06 濃度在10 ～120ug/mL 范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

（4）精密度試驗：分別精密稱取TAK06 樣品適量，用乙腈溶解并制成含TAK06 為0.1mg/mL 的溶液，獨立配制6 份，依法測定，分別考察TAK06 保留時間、主峰面積、最大單個雜質(zhì)、總雜質(zhì)的相對標(biāo)準(zhǔn)偏差（數(shù)據(jù)見下表2）。結(jié)果顯示，TAK 主峰保留時間RSD%為0.50%，主峰面積RSD%為0.55%，最大單雜RSD%為4.05%，檢測結(jié)果雜質(zhì)總量RSD%為1.38%；本方法精密度符合要求。

表2：精密度試驗數(shù)據(jù)

（5）檢測限及定量限的確定：取TAK06 對照品適量，用乙腈制成濃度為0.1mg/mL，以乙腈為溶劑，按照逐步稀釋法依次稀釋，進(jìn)樣測定，確定TAK06 的檢測限（S/N ＝3）為0.1ug/mL，確定TAK06 的定量限（S/N＝10）為0.3ug/mL。

（6）溶液穩(wěn)定性試驗：取2.3.4 精密度試驗項下的一份溶液，分別于0,1,2,4,8h 依法測定，分別考察TAK06 主峰面積、最大單個雜質(zhì)、總雜質(zhì)的相對標(biāo)準(zhǔn)偏差（數(shù)據(jù)見下表3）。數(shù)據(jù)顯示，主峰面積的RSD為0.25%，最大單雜RSD%為1.69%，總雜質(zhì)的RSD%為1.53%。結(jié)果表明，供試品溶液在8h 內(nèi)穩(wěn)定。

表3 ：溶液穩(wěn)定性試驗數(shù)據(jù)

（7）供試品測定：取三批樣品分別重復(fù)測定三次，分別考察最大單個雜質(zhì)、總雜質(zhì)的相對標(biāo)準(zhǔn)偏差（數(shù)據(jù)見下表4）。檢測結(jié)果見下表.

表4 ：三批樣品測試數(shù)據(jù)

本實驗對HPLC法測定5-(2-氟苯基)-1H-吡咯-3-甲醛（TAK06）的有關(guān)物質(zhì)進(jìn)行了方法學(xué)研究，并經(jīng)上述方法學(xué)驗證，本實驗標(biāo)準(zhǔn)中最后確定依折麥布有關(guān)物質(zhì)檢測的色譜條件為辛基硅烷鍵合相硅膠為填充劑的色譜柱，流動相A 為0.1%的甲酸水溶液；流動相B 為乙腈，并進(jìn)行梯度洗脫。檢測波長254 nm，流速1.0 mL/min。該方法可以把工藝副反應(yīng)產(chǎn)物、降解雜質(zhì)均實現(xiàn)較好分離，主峰及已知雜質(zhì)出峰順序為：雜質(zhì)A、雜質(zhì)C、雜質(zhì)B、TAK06；相對保留時間分別約為0.45、0.77、0.94和1.00；其分離度大于2.0。系統(tǒng)適用性、專屬性、線性和范圍、定量限與檢測限、準(zhǔn)確度、精密度、溶液穩(wěn)定性均符合檢測要求，可以有效控制產(chǎn)品質(zhì)量。

[1] Yasuyoshi Arikawa, Haruyuki Nishida, Osamu Kurasawa, Atsushi Hasuoka, Keizo Hirase, Nobuhiro Inatomi, Yasunobu Hori, Jun Matsukawa, Akio Imanishi, Mitsuyo Kondo, Naoki Tarui, Teruki Hamada, Terufumi Takagi, Toshiyuki Takeuchi, and Masahiro Kajino.Discovery of a Novel Pyrrole Derivative 1-[5-(2-Fluorophenyl)-1-(pyridin-3-ylsulfonyl)-1H-pyrrol-3-yl]-N-methylmethanamine Fumarate (TAK-438) as a Potassium-Competitive Acid Blocker (P-CAB). J. Med. Chem., 2012, 55 (9), pp 4446菂4456