CALR基因：慢性骨髓增殖性腫瘤(CMPN)新分子標(biāo)記物

CALR基因：慢性骨髓增殖性腫瘤(CMPN)新分子標(biāo)記物

[引著格式]周靖，黃知平.CALR基因：慢性骨髓增殖性腫瘤(CMPN)新分子標(biāo)記物[J].長(zhǎng)江大學(xué)學(xué)報(bào)(自科版)，2015，12(30)：83~86.

周靖，黃知平(長(zhǎng)江大學(xué)荊州臨床醫(yī)學(xué)院 荊州市中心醫(yī)院血液內(nèi)科，湖北 荊州 434020)

[摘要]慢性骨髓增殖性腫瘤(CMPN)是骨髓中一系或多系髓系細(xì)胞增殖的克隆性造血干細(xì)胞疾病。近年來(lái)，多個(gè)分子標(biāo)志物如JAK2、MPL基因突變等相繼被發(fā)現(xiàn)，但仍有30%～45%的攜有野生型JAK2/MPL的原發(fā)性血小板增多癥(ET)或原發(fā)性骨髓纖維化(PMF)患者缺乏特異性分子標(biāo)記物，診斷存在困難。近期新發(fā)現(xiàn)的鈣網(wǎng)蛋白基因(CALR)突變將能填補(bǔ)這一空白，有望成為診斷骨髓增殖性腫瘤又一種新的分子標(biāo)記物，對(duì)于理解CMPN的分子發(fā)病機(jī)制具有重要意義，對(duì)這類疾病進(jìn)行診斷和治療具有重要意義。

[關(guān)鍵詞]慢性骨髓增殖性腫瘤；鈣網(wǎng)蛋白基因(CALR)突變；分子標(biāo)記物

骨髓增殖性腫瘤(CMPN)，既往稱作骨髓增殖性疾病(MPD)，由于其具有腫瘤性特征，2008年WHO已用“慢性骨髓增殖性腫瘤(CMPN)”代替“骨髓增殖性疾病(MPD)”[1,2]。真性紅細(xì)胞增多癥(PV)、原發(fā)性血小板增多癥(ET)和原發(fā)性骨髓纖維化(PMF)劃為BCR-ABL融合基因陰性的骨髓增殖性腫瘤(CMPN)[1]。骨髓增殖性腫瘤是以分化相對(duì)成熟的一系或多系髓細(xì)胞過(guò)剩為特征的一類造血干細(xì)胞克隆性疾病，臨床表現(xiàn)為易出血、血栓、骨髓纖維化、不同程度的髓外造血和白血病轉(zhuǎn)化風(fēng)險(xiǎn)[2～4]。與骨髓增生異常綜合征不同，CMPN伴隨正常成熟和有效造血，脾臟腫大為其共同及常見(jiàn)癥狀。

2005年國(guó)外多個(gè)研究小組證實(shí)在97%的PV患者中發(fā)現(xiàn)了JAK2 V617F突變[5]，從而開(kāi)創(chuàng)了分子診斷的“JAK2時(shí)代”[4,6]。隨后，Pardanani等在ET及PMF患者中發(fā)現(xiàn)了MPL W515I突變，在PV患者中并未發(fā)現(xiàn)這一突變位點(diǎn)[7]。在這些分子標(biāo)志物發(fā)現(xiàn)之前，雖然基于血常規(guī)、骨髓細(xì)胞學(xué)、骨髓活檢等設(shè)計(jì)了一系列CMPN疾病診斷規(guī)則，但是在很多情況下，其血液、骨髓象等表現(xiàn)有明顯重疊，難以準(zhǔn)確診斷。隨著JAK2 V617F、MPL W515、JAK2 exon12等基因突變的發(fā)現(xiàn)，CMPN的診斷有了突破性的進(jìn)展[8]。研究證實(shí)約95%的PV和半數(shù)的ET/PMF存在JAK2 V617F突變，5%～10%的CMPN患者攜帶MPL或JAK2 exon12突變[4,7]。2008年WHO已經(jīng)將JAK2和MPL突變列入診斷PV、ET和PMF的指標(biāo)之一[9]。但仍有30%～40%的攜有野生型JAK2和MPL的ET或PMF患者中尚未鑒定出特征性的基因異常，因此確診仍有困難。2013年美國(guó)血液學(xué)會(huì)年會(huì)(ASH)上，英國(guó)劍橋Tefferi[10]和奧地利KLampfl等[11]同時(shí)報(bào)道在70%～80%的JAK2和MPL突變陰性的ET和PMF患者中存在鈣網(wǎng)蛋白基因(CALR基因)突變，并證實(shí)CALR基因突變主要見(jiàn)于CMPN，很少見(jiàn)于MDS患者，為CMPN的特征性突變。聯(lián)合檢測(cè)JAK2、MPL和CALR基因突變，陽(yáng)性率可達(dá)97%[10,11]。CALR基因的發(fā)現(xiàn)填補(bǔ)了JAK2/MPL突變陰性CMPN疾病分子生物學(xué)診斷的空白，作為有利的補(bǔ)充，CALR的發(fā)現(xiàn)對(duì)研究CMPN的分子發(fā)病機(jī)制、診斷及預(yù)后有著非常重要的意義，同時(shí)亦為治療帶來(lái)了新的靶位。

1CALR基因的功能結(jié)構(gòu)

CALR蛋白位于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)，是一種鈣通道結(jié)合分子伴侶，是進(jìn)化上高度保守的多功能蛋白，可協(xié)助蛋白質(zhì)折疊并維持細(xì)胞內(nèi)鈣離子穩(wěn)態(tài)，從而在體內(nèi)發(fā)揮多種功能，參與免疫反應(yīng)調(diào)節(jié)、細(xì)胞增殖調(diào)亡、細(xì)胞吞噬和纖維化過(guò)程[10]。CALR基因定位于染色體19p13.2，由3個(gè)蛋白結(jié)構(gòu)域：N-結(jié)構(gòu)域(殘基1～180)、P-結(jié)構(gòu)域(殘基181～290)、C-結(jié)構(gòu)域(殘基291～400)和9個(gè)外顯子組成。CALR基因突變是由于第9號(hào)外顯子插入或缺失，從而導(dǎo)致一個(gè)堿基對(duì)的讀碼框移位，繼而產(chǎn)生一種缺乏內(nèi)質(zhì)網(wǎng)保留序列(即KDEL氨基酸序列：Lys-Asp-Glu-Leu)的新型C-羧基末端的蛋白，CALR突變類型多樣，其突變后C端氨基酸結(jié)構(gòu)改變可能引起蛋白功能改變[10～12]。為了證實(shí)CALR基因突變確實(shí)導(dǎo)致了蛋白的改變，曾有研究運(yùn)用免疫印記的方法證實(shí)了在人類HEK293T細(xì)胞CALR基因代表性結(jié)構(gòu)中發(fā)現(xiàn)了CALR蛋白的異常表達(dá)。截至目前，已證實(shí)存在55種CALR基因突變體，其中最常見(jiàn)的兩種變異體為：由52個(gè)堿基缺失引起的1型變異體(p.L367fs*46)和由5個(gè)堿基TTGTC插入引起的2型變異體(p.K385fs*47)，約占所有突變類型的80%，缺失型(53%)多于插入型(32%)，缺失型中以del367fs46(37%)和del385fs47(71.4%)為主[10,11]。Vannucchi[13]等利用免疫組化技術(shù)檢測(cè)攜有CALR基因突變的骨髓活標(biāo)本，發(fā)現(xiàn)免疫染色主要定位于巨核細(xì)胞上，說(shuō)明巨核細(xì)胞在CALR陽(yáng)性的CMPN疾病發(fā)病機(jī)制中發(fā)揮了重要作用。此外在一項(xiàng)體外研究中發(fā)現(xiàn)CALR的過(guò)度表達(dá)可以促進(jìn)STAT5磷酸化作用并引起信號(hào)通道激活，這種激活作用可以被JAK抑制劑阻滯，說(shuō)明了CALR與JAK2突變可能存在某種類似的機(jī)制[10,11]。但是由于目前對(duì)CALR基因突變的研究尚未深入，CALR基因如何激活JAK-STAT信號(hào)通路及其在CMPN疾病中的發(fā)病機(jī)制仍不清楚，有待進(jìn)一步研究[14～16]。

2CALR基因突變的最新研究進(jìn)展

2013年12月KLampfl等[11]和Tefferi等[10]兩個(gè)研究團(tuán)隊(duì)同時(shí)報(bào)道了在JAK2/MPL陰性的ET和PMF中發(fā)現(xiàn)了鈣網(wǎng)蛋白基因(CALR基因)突變，并證實(shí)CALR基因突變不發(fā)生于PV，僅見(jiàn)于JAK2/MPL陰性的ET和PMF。Klampfl等[11]采用全外顯子測(cè)序的方法檢測(cè)了1107例CMPN患者，JAK2/MPL陰性的ET和PMF的CALR基因檢出率分別為67%和88%，并擴(kuò)大研究了460例其他類型的血液腫瘤患者，包括254例AML、45例CML、73例MDS、64CMML、24例RARS-T，僅在RARS-T患者中檢測(cè)到3例發(fā)生了CALR突變。Tefferi等采用同樣方法檢測(cè)了1356例樣本，其中包括896例CMPN(382例PV、311例ET、203例PMF)和460例其他類型的血液腫瘤，同樣證實(shí)CALR突變未見(jiàn)于PV，在CMPN陰性的ET/PMF中突變率為70%～84%，僅在MM患者中檢測(cè)到8%的突變率，其余標(biāo)本均未檢測(cè)到CALR突變。此外，一項(xiàng)針對(duì)于258例PV、Post-PV MF和253例JAK2/MPL(+)的ET、PMF、Post-PV MF的研究[11]中均未發(fā)現(xiàn)CALR基因突變。近期，日本[17]和中國(guó)[18]的兩個(gè)研究小組先后報(bào)道了在3例ET患者同時(shí)發(fā)生了CALR和JAK2基因的突變，CALR和JAK2的同時(shí)存在可能說(shuō)明二者之間存在某種聯(lián)系，比如患者本身的遺傳傾向或一個(gè)基因突變后引起基因組不穩(wěn)定從而導(dǎo)致另一突變的發(fā)生。但目前這種報(bào)道僅為個(gè)案，缺乏大宗病例，其發(fā)生機(jī)制有待研究。

2014年國(guó)外最新文獻(xiàn)也對(duì)CALR突變最新研究進(jìn)展進(jìn)行了報(bào)道，Tefferi等[19]檢測(cè)了1107例CMPN患者，PV中未檢測(cè)到CALR突變，ET和PMF突變率分別為25%、35%；Rumi等[20]檢測(cè)了1235例ET/PV患者，PV中未檢測(cè)到CALR突變，ET突變率為13.6%；Rotunno等[21]檢測(cè)了576例MPN患者，CALR突變檢出率為15.5%。國(guó)外大宗病例報(bào)道CALR突變率基本一致，但目前為止亞洲地區(qū)仍尚缺大宗病例報(bào)道。Shirane等[17]檢測(cè)了日本133名CMPN患者，ET和PMF的CALR基因檢出率分別為19.6%和30.4%，與國(guó)外報(bào)道一致。付榮鳳等[18]首次對(duì)中國(guó)的436例ET患者的研究發(fā)現(xiàn)，CALR基因突變率為22.7%。

3CALR基因突變的臨床意義

研究表明，在JAK2/MPL陰性的ET和PMF患者中，CALR突變與其臨床表現(xiàn)及預(yù)后有重要意義[13]。存在CALR突變的ET及PMF患者與JAK2/MPL陽(yáng)性的患者相比較具有如下的臨床表現(xiàn)特點(diǎn)：男性略多見(jiàn)、中位發(fā)病年齡較低、高血小板計(jì)數(shù)、低白細(xì)胞計(jì)數(shù)、低血紅蛋白水平、低LDH水平、低DIPSS-PLUS風(fēng)險(xiǎn)積分、血栓事件發(fā)生率較低、心血管事件發(fā)生率較低、較少轉(zhuǎn)化為骨纖及白血病、低輸血依賴和擁有較高的生存率及預(yù)后。有文獻(xiàn)報(bào)道，發(fā)生JAK2和CALR突變的心血管事件累計(jì)發(fā)生率分別為30.1%和13.5%，10年血栓累計(jì)發(fā)生率分別為14.5%和5.1%。并且國(guó)內(nèi)外研究[17,18]指出，在ET患者中發(fā)生CALR基因2型突變的較之1型的血栓發(fā)生概率更低，在PMF患者中，發(fā)生1型突變的預(yù)后比2型預(yù)后好。發(fā)生CALR基因突變的PMF患者輸血依賴為13%，與JAK2突變37%相比較明顯偏低。此外，與JAK2突變的PMF患者相比較，發(fā)生CALR基因突變的PMF患者其剪接體突變發(fā)生率明顯較低(8% vs 42%)[10～13]。為了論證CMPN其他相關(guān)基因突變與CALR突變的關(guān)系，Tefferi[26]等在254例CMPN標(biāo)本中篩查了一些相關(guān)基因包括：EZH2、ASXL1、IDH、SF3B1、SRSF2和U2AF1等，并未發(fā)現(xiàn)它們與CALR突變存在任何顯著的分子或遺傳學(xué)關(guān)系。此項(xiàng)研究同時(shí)發(fā)現(xiàn)，JAK2/MPL/CALR三者均陰的CMPN患者預(yù)后較差，此外PMF患者預(yù)后還受ASXL1的影響，“CALR-ASXL1+”類型預(yù)后欠佳[12,15,17]。

4CALR基因突變的檢測(cè)

CALR是CMPN中第2個(gè)最易發(fā)生突變的基因，因此有學(xué)者建議將其列為常規(guī)檢測(cè)指標(biāo)。CALR基因突變較為復(fù)雜多樣，目前已證實(shí)有55種突變類型[17,18]，少見(jiàn)的突變類型增加了檢測(cè)難度，CALR基因突變率可能被低估，因此對(duì)其檢測(cè)要求高靈敏性及特異性。目前學(xué)者們較多采用基因測(cè)序方法進(jìn)行檢測(cè)，但測(cè)序方法價(jià)格昂貴，過(guò)程復(fù)雜，耗時(shí)較長(zhǎng)，不利于臨床快速診斷?；贑ALR基因的臨床重要意義，迫切需要更簡(jiǎn)單、快速、廉價(jià)的檢測(cè)技術(shù)及方法。Vannucchi等[13]針對(duì)CALR突變體研制了一種多克隆抗體，將其用來(lái)免疫染色骨髓活檢標(biāo)本，此種方法快速簡(jiǎn)單，能有效區(qū)分發(fā)生CALR突變的ET和PMF患者，因此免疫組化可作為一個(gè)診斷工具。Chi Jianxiang等[23]研制出了一套PCR-HRM體系用于檢測(cè)CALR突變，該體系完成檢測(cè)僅需3h，操作簡(jiǎn)單易行，目前PCR技術(shù)已經(jīng)較為成熟，臨床實(shí)驗(yàn)室普及率高，此項(xiàng)體系可大大提高臨床檢測(cè)及診斷效率。

5CALR基因突變與CMPN診斷

CALR基因作為CMPN疾病較為特異的分子指標(biāo)，作為對(duì)野生型JAK2/MPL的ET和PMF診斷的有力補(bǔ)充，對(duì)CMPN疾病診斷具有重要的意義[10,11,24]。目前已有較多學(xué)者建議將CALR基因檢測(cè)納入WHO診斷標(biāo)準(zhǔn)[12,15]。在CMPN臨床診斷中，為避免不必要的檢查和漏洞，可遵循以下診斷流程：①PV患者無(wú)需篩查CALR基因；②CALR與JAK2/MPL突變互為排斥，JAK2/MPL為陽(yáng)性，無(wú)需篩查CALR基因；③對(duì)ET/MPL疑似患者，首先篩查JAK2基因突變，若為陰性，再行CALR基因突變篩查，若CALR基因突變?nèi)詾殛幮?，再篩查MPL突變；④仍有10% CMPN患者缺乏特殊分子標(biāo)記，因此骨髓活檢必不可少；⑤應(yīng)將“CALR-ASXL1+”及“JAK2/MPL/CALR均陰”視為預(yù)后高危因素。

6展望

CALR突變的發(fā)現(xiàn)對(duì)進(jìn)一步解釋JAK2/MPL陰性的CMPN發(fā)病機(jī)制有著里程碑式的意義，因此我們有理由相信，CALR和JAK2/MPL一樣將被WHO修訂為CMPN的診斷指標(biāo)，更期待這些基因突變作為靶向治療的靶點(diǎn)，開(kāi)啟CMPN分子靶向治療的新時(shí)代。

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[編輯]一凡

[中圖分類號(hào)]R551.3

[文獻(xiàn)標(biāo)志碼]A

[文章編號(hào)]1673-1409(2015)30-0083-04

通信作者：

[作者簡(jiǎn)介]周靖(1990-)，女，碩士生，主要從事血液腫瘤方向的研究工作；黃知平，15090727839@163.com。

[基金項(xiàng)目]湖北省科技廳科技計(jì)劃項(xiàng)目(2009AA301C52)。

[收稿日期]2015-05-28