結(jié)直腸癌組織中K-ras基因突變情況及其臨床意義

劉珊，王丹，盧福昱，程波，石建玲，段戀，孫鎖柱(第二炮兵總醫(yī)院，北京00088;解放軍第30醫(yī)院)

結(jié)直腸癌組織中K-ras基因突變情況及其臨床意義

劉珊1，王丹1，盧福昱2，程波1，石建玲1，段戀1，孫鎖柱1(1第二炮兵總醫(yī)院，北京100088;2解放軍第302醫(yī)院)

摘要:目的觀察K-ras基因在結(jié)直腸癌組織中的突變情況，為臨床開展結(jié)直腸癌個(gè)體化治療提供依據(jù)。方法收集156份結(jié)直腸癌組織手術(shù)標(biāo)本作為觀察組，20份正常腸黏膜標(biāo)本作為對(duì)照組。提取組織DNA，采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR法檢測(cè)K-ras基因突變情況。分析K-ras基因突變率及第12、13位密碼子突變與結(jié)直腸癌患者臨床病理特征的關(guān)系。結(jié)果對(duì)照組未檢測(cè)出K-ras基因突變，觀察組K-ras基因突變率為40.4%(63/156)，兩組基因突變率比較，P＜0.05。K-ras基因突變率與結(jié)直腸癌患者性別、腫瘤部位、分化程度、病理分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移無關(guān)(P均＞0.05)，與年齡有關(guān)(P＜0.05)。觀察組K-ras基因第12、13位密碼子突變率分別為76.2%(48/ 63)和27.0%(17/63)，二者比較P＜0.05。觀察組K-ras基因第12、13位密碼子突變與結(jié)直腸癌患者腫瘤分化程度相關(guān)(P＜0.05)，與性別、年齡、腫瘤部位、病理分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移無關(guān)(P均＞0.05)。結(jié)論結(jié)直腸癌組織中K-ras基因突變率為40.4%，第12位密碼子(GGT～GAT)突變是最常見類型。檢測(cè)K-ras基因突變情況有助于指導(dǎo)臨床開展結(jié)直腸癌個(gè)體化治療。

關(guān)鍵詞:腸腫瘤;結(jié)直腸癌; K-ras基因;基因突變

K-ras genemutations in colorectal carcinoma and its clinical significance

LIU Shan1，WANGdan，LU Fu-yu，CHENG Bo，SHI Jian-ling，DUAN Lian，SUN Suo-zhu(1 General Hospital of the Second Artillery，Beijing 100088，China)

Abstract:Objective To observe the K-ras genemutations in the colorectal carcinoma tissues and to provide basis for the individualized treatment of colorectal cancer in clinical.Methods A total of 156 cases of colorectal carcinoma samples(observation group)and 20 cases of normal tissue samples(the control group)were collected.GenomicdNA was extracted and K-ras genemutations were analyzed by real-time fluorescence quantitative polymerase chain reaction.Then，we analyzed the K-ras genemutation rate.Meanwhile，the 12th and 13th codonmutations in colorectal cancer and the relationships with clinicopathologic features were analyzed.ResultsThe K-ras genemutations were not found in the control group，and K-ras genemutation rate in the observation group was 40.4%(63/156).Significantdifference was found in themutation rate between these two groups(P＜0.05).The K-ras genemutation rate was not related with sex，tumor location，tumor grade，pathological stage，lymph node and lymph nodemetastasis(all P＞0.05)，but was related with age(P ＜0.05).Themutation rate at codon 12 and codon 13 of K-ras gene was 76.2%(48/63)and 27.0%(17/63)，respectively in the observation group，and significantdifference was found(P＜0.05).Themutation at codon 12 and codon 13 of K-ras gene was related with tumordifferentiateddegree(P＜0.05)，but not related with sex，age，tumor location，pathological stage，lymph node and lymph nodemetastasis(all P＞0.05).Conclusions K-ras genemutation rate in the colorectal carcinoma tissues is 40.4%，and themost common type is the codon 12(GGT-GAT)mutation.Thedetection of K-ras genemutation helps to provide basis for the individualized treatment of colorectal cancer in clinical.

Key words:intestinal neoplasms; colorectal carcinoma; K-ras gene; genemutation

在散發(fā)性結(jié)直腸癌的研究中，K-ras基因突變被認(rèn)為是腫瘤發(fā)生的早期事件，并在腫瘤發(fā)展、轉(zhuǎn)移、復(fù)發(fā)等階段起重要作用［1～3］。本研究觀察了結(jié)直腸癌根治術(shù)癌組織中K-ras基因突變狀況，并探討其與結(jié)直腸癌患者臨床病理特征的關(guān)系，旨在為結(jié)直腸癌的個(gè)體化治療提供依據(jù)。

1　資料與方法

1.1臨床資料收集2010年1月～2012年11月第二炮兵總醫(yī)院手術(shù)切除所得的結(jié)直腸癌根治病理標(biāo)本156份作為觀察組，患者男88例、女68例，年齡20～89歲、中位年齡68歲;腫瘤位于結(jié)腸76例，直腸80例;均經(jīng)手術(shù)、病理檢查證實(shí)診斷。按2008 年IARC出版的WHO消化系統(tǒng)腫瘤分類標(biāo)準(zhǔn)及病理分期標(biāo)準(zhǔn)，高度化14例、中度分化121例、低度分化20例;病理分期(pTNM分期)Ⅰ期29例，Ⅱ期47例，Ⅲ期69例，Ⅳ期11例;有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移72例、無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移84例。選擇同期20份正常人腸黏膜組織作為對(duì)照組。兩組性別、年齡具有可比性。

1.2 K-ras基因突變檢測(cè)采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR法。兩組標(biāo)本經(jīng)10%中性甲醛固定及石蠟包埋，10 μm厚切片，取10張，確保觀察組切片含有70%以上的腫瘤組織。DNA提取:使用德國Qiagen公司的DNA提取試劑盒提取石蠟標(biāo)本基因組DNA。實(shí)時(shí)熒光定量PCR:采用的PCR儀為Applied Biosystems公司的7500型實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀。參照武漢友芝友醫(yī)療科技有限公司的人類K-ras基因7種突變檢測(cè)試劑盒進(jìn)行。主要步驟:于0.2mL的離心管中依次加入PCR buffer 22.3 μL、酶混合物0.2 μL、參比染料0.4 μL、內(nèi)標(biāo)模板0.1 μL、待測(cè)腫瘤組織DNA 2 μL，總反應(yīng)體積為25 μL。反應(yīng)條件:預(yù)變性95℃、5min，然后95℃、15 s，60℃、60 s，共40個(gè)循環(huán)。陰性質(zhì)控標(biāo)準(zhǔn)品采用滅菌雙蒸水。

1.3統(tǒng)計(jì)學(xué)方法采用SPSS13.0統(tǒng)計(jì)軟件。計(jì)數(shù)資料以率表示，組間比較用χ2檢驗(yàn)。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2　結(jié)果

2.1 K-ras基因突變情況對(duì)照組未檢測(cè)出K-ras基因突變，均為野生型;觀察組K-ras基因突變率為40.4%(63/156);兩組基因突變率比較，P＜0.05。觀察組共檢測(cè)出突變型K-ras的5種類型，依次為第12位密碼子GGT→GAT，為39.7%(25/63)，第13位密碼子GGC→GAC，為27.0%(17/63)，第12位密碼子GGT→GTT，為22.2%(14/63)，第12位密碼子GGT→AGT，為7.9%(5/63)，第12位密碼子GGT→TGT，為6.3%(4/63)。觀察組K-ras基因第12、13位密碼子突變率分別為76.2%(48/63)和27.0%(17/63)，兩者比較P＜0.05。突變均為雜合性體細(xì)胞錯(cuò)義突變，未發(fā)現(xiàn)胚系(純合)基因突變。有2例出現(xiàn)第12、13位密碼子同時(shí)突變的復(fù)合突變，且均為GGT→GAT、GGC→GAC。

2.2 K-ras基因突變與結(jié)直腸癌患者臨床病理特征的關(guān)系K-ras基因突變與結(jié)直腸癌患者年齡有關(guān)(P＜0.05)，而與性別、腫瘤部位、分化程度、病理分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移無關(guān)(P均＞0.05)。詳見表1。

表1　K-ras基因突變與結(jié)直腸癌患者臨床病理特征的關(guān)系

2.3觀察組K-ras基因突變位點(diǎn)與患者臨床病理特征的關(guān)系觀察組K-ras基因第12位與第13位密碼子突變?cè)谀[瘤分化程度上比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)，而在性別、年齡、腫瘤部位、腫瘤分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移等因素上比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P均＞0.05)。詳見表2。

3　討論

國外研究報(bào)道，結(jié)直腸癌K-ras基因突變率為30%～60%，東方人種略低于西方國家(25%～43%)，但無明顯統(tǒng)計(jì)學(xué)差異［4，5］。結(jié)直腸癌中K-ras基因突變主要集中在1號(hào)外顯子的12、13密碼子上，少數(shù)存在2號(hào)外顯子61、63密碼子的突變［6］。數(shù)據(jù)顯示12密碼子發(fā)生突變頻率最高，達(dá)70%以上，西方國家以GGT→GTT最常見，而亞洲以GTT→GAT最常見。本研究對(duì)照組未檢測(cè)出K-ras基因突變，觀察組K-ras基因突變率為40.4%，以第12位密碼子GTT→GAT突變比例最高，均與以往研究報(bào)道一致。提示K-ras基因突變可作為診斷結(jié)直腸癌的分子指標(biāo)。本研究2例同時(shí)存在第12、13位密碼子復(fù)合突變，經(jīng)過重復(fù)試驗(yàn)結(jié)果相同，表明K-ras基因突變?cè)诮Y(jié)直腸癌發(fā)生、發(fā)展的整個(gè)過程中可能存在多個(gè)階段，發(fā)生多次不同突變的動(dòng)態(tài)現(xiàn)象。

表2　觀察組K-ras基因突變位點(diǎn)與患者臨床病理特征的關(guān)系

以往研究對(duì)K-ras基因突變與患者臨床病理特征間的相關(guān)性研究結(jié)果不盡相同［7～10］。本研究結(jié)果顯示，K-ras基因突變與患者性別、腫瘤部位、分化程度、病理分期及有無淋巴結(jié)及遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移無明顯相關(guān)性，尤其是在腫瘤轉(zhuǎn)移趨勢(shì)上沒有明顯相關(guān)性，與國內(nèi)外的相關(guān)報(bào)道存在一定差異，我們認(rèn)為可能與樣本量、檢測(cè)方法、人種差異性等原因有關(guān)。本研究結(jié)果顯示，K-ras基因突變與患者年齡相關(guān)，存在K-ras基因突變發(fā)生率隨患者年齡增加而逐步升高的趨勢(shì)(＜40歲年齡段突變率18.2%，＞60歲年齡段突變率48.4%)。多數(shù)學(xué)者認(rèn)為，K-ras基因突變與結(jié)直腸癌預(yù)后不良密切相關(guān)，患者無法從靶向藥物中獲益，我國人口老齡化趨勢(shì)的逐年顯著使得結(jié)直腸癌的預(yù)后不良性更加明顯。

有研究認(rèn)為，K-ras基因的第12、13位點(diǎn)突變提示預(yù)后不良，存在13位點(diǎn)突變的患者更容易復(fù)發(fā)［11～13］。本研究中，K-ras基因的第12與13位密碼子突變?cè)谀[瘤分化程度上比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，腫瘤在高分化狀態(tài)下幾乎全部出現(xiàn)第12位密碼子突變，而第13位密碼子突變?cè)诘头只瘯r(shí)發(fā)生頻率較高，提示結(jié)直腸腺癌在分化程度逐步降低時(shí)可能出現(xiàn)了K-ras基因從12密碼子向13密碼子突變轉(zhuǎn)化的過程。由于腫瘤分化程度被普遍認(rèn)為與分期、復(fù)發(fā)、轉(zhuǎn)移等預(yù)后因素密切相關(guān)，但能否認(rèn)為K-ras基因第13位密碼子突變狀態(tài)的存在是預(yù)后不良的相關(guān)因素之一，仍需擴(kuò)大樣本量進(jìn)一步研究。

綜上所述，K-ras基因是EGFR信號(hào)通路中最易發(fā)生突變的基因，并且在結(jié)直腸癌的發(fā)生、發(fā)展、轉(zhuǎn)移等各個(gè)階段起重要作用。深入研究K-ras基因的結(jié)構(gòu)、功能及突變規(guī)律對(duì)結(jié)直腸癌的防治具有重要意義。

參考文獻(xiàn):

［1］Shigenori K，Miho K，Shuhei T，et al.Prognostic value of KRAS and BRAFmutations in curatively resected colorectal cancer［J］.World Gastroenterology，2015，9(4): 1275-1283.

［2］Lea IA，JacksonmA，Li X，et al.Genetic pathways andmutation profiles of human cancers: site and exposure specific patterns［J］.Carcinogenesis，2007，28(9): 1851-1858.

［3］Ju Y，Yan L，Yun Q，et al.KRAS and BRAF genemutations anddNAmismatch repair status in Chinese colorectal carcinoma patients［J］.World Gastroenterology，2015，21(5): 1595-1605.

［4］Soeda H，Shimodaira H，Gamohm，et al.PhaseⅡTrial of Cetuximab plus Irinotecan for Oxaliplatin- and Irinotecan-Based Chemotherapy-Refractory Patients with Advanced and/ormetastatic Colorectal Cancer: Evaluation of Efficacy and Safety Based on KRASmutation Status(T-CORE0801)［J］.Oncology，2014，1:7-8.

［5］徐向明，張國良，李敏偉，等.結(jié)直腸癌組織中K-ras基因的檢測(cè)及其意義［J］.中華醫(yī)學(xué)雜志，2010，90(18): 1268-1271.

［6］Frattinim，Saletti P，Romagnani E，et al.PTEN loss of expression predicts cetuximab efficacy inmetastatic colorectal cancer patients ［J］.Brit J Cancer，2007，97(8): 1139-1145.

［7］Chun L，Jen L，Tzu L，et al.The prognostic role ofmicrosatellite instability，codon-specific KRAS，and BRAFmutations in colon cancer［J］.Surgical Oncology，2014，110(4): 451-457.

［8］Calistrid，Rengueci C，Seymour I，et al.Mutation analysis of p53，K-ras，and BRAF genes in colorectal cancer progression［J］.J Cell Physiol，2005，204(2): 484-488.

［9］Nur S，Yu F，Daniel L，et al.Non-invasive sensitivedetection of KRAS and BRAFmutation in circulating tumor cells of colorectal cancer patients［J］.Molecular Oncology，2015，9(4): 850-860.

［10］吳偉，胡錦林，鞠海星，等.散發(fā)性大腸癌K-ras基因點(diǎn)突變研究及其臨床病理意義［J］.醫(yī)學(xué)研究雜志，2010，39(12): 53-57.

［11］吳文輝，肖隆斌，湯友珍，等.K-ras基因突變與結(jié)直腸癌生物學(xué)行為的關(guān)系［J］.中國病理生理雜志，2009，25(11): 2159-2162.

［12］Conlin A，Smith G，Carey FA，et al.The prognostic significance of K-ras，p53，and APCmutations in colorectal carcinoma［J］.Gut，2005，54(9): 1283-1286.

［13］Pierre P，Deniz P，Corinne N，et al.Clinical Relevance of KRASMutated Subclonesdetected with Picodropletdigital PCR in Advanced Colorectal Cancer Treated with Anti-EGFR Therapy［J］.Clinical cancer research，2015，21(5): 1087-1097.

收稿日期:( 2015-07-04)

通信作者簡介:孫鎖柱(1968-)，男，主任醫(yī)師，研究方向?yàn)樵\斷病理學(xué)。E-mail:mingzhu0368@ sina.com

作者簡介:第一劉珊(1980-)，女，博士研究生，主治醫(yī)師，研究方向?yàn)榉肿硬±韺W(xué)。E-mail: iceicequeen@ sina.com

基金項(xiàng)目:國家自然科學(xué)基金青年基金資助項(xiàng)目(8301662)。

文章編號(hào):1002-266X(2015)36-0001-03

文獻(xiàn)標(biāo)志碼:A

中圖分類號(hào):R735.3

doi:10.3969/j.issn.1002-266X.2015.36.001