蛋白酶結(jié)合自溶酶提取南極磷蝦油工藝研究

于海寧，陶艷紅，馮瑩超，華允芬，沈生榮，單偉光

(1.浙江工業(yè)大學(xué) 藥學(xué)院，浙江 杭州 310014； 2.浙江大學(xué) 生物系統(tǒng)工程與食品科學(xué)學(xué)院，浙江 杭州 310058)

蛋白酶結(jié)合自溶酶提取南極磷蝦油工藝研究

于海寧1，陶艷紅1，馮瑩超1，華允芬1，沈生榮2，單偉光1

(1.浙江工業(yè)大學(xué) 藥學(xué)院，浙江 杭州 310014； 2.浙江大學(xué) 生物系統(tǒng)工程與食品科學(xué)學(xué)院，浙江 杭州 310058)

摘要：南極磷蝦油含有豐富的磷脂型ω-3不飽和脂肪酸，具有極大的開發(fā)價值.南極磷蝦含有豐富的自溶酶體系，其自溶作用是否有利于活性物質(zhì)的提取尚不清楚.采用木瓜蛋白酶對南極磷蝦油進行提取，探索自溶酶體系在南極磷蝦油提取過程中的作用.結(jié)果表明：南極磷蝦自溶作用有利于南極磷蝦油的提取，木瓜蛋白酶結(jié)合自溶酶體系共同作用可取得最佳提取效果.以EPA與DHA質(zhì)量分?jǐn)?shù)之和為檢測指標(biāo)，探討了不同酶解溫度、料液比、加酶質(zhì)量分?jǐn)?shù)、酶解時間和pH對南極磷蝦油提取效果的影響.先通過單因素實驗，再通過正交實驗，分析確定了最佳提取工藝條件：酶解溫度50 ℃，料液比1∶22 g/mL，加酶質(zhì)量分?jǐn)?shù)1.25%，酶解時間2 h，pH7.0.在此條件下提取的蝦油，EPA和DHA質(zhì)量分?jǐn)?shù)之和為75.77%。

關(guān)鍵詞：南極磷蝦；木瓜蛋白酶；自溶；提取

Study on extraction of Antarctic krill oil by protease combined with autolysis

YU Haining1, TAO Yanhong1, FENG Yingchao1, HUA Yunfen1,

SHEN Shengrong2, SHAN Weiguang1

(1.College of Pharmaceutical Science, Zhejiang University of Technology, Hangzhou 310014, China；

2.School of Biosystems Engineering and Food Science, Zhejiang University, Hangzhou 310058, China)

Abstract:Antarctic krill oil is rich in phospholipid type of ω-3 unsaturated fatty acids, and has a great value of development. There are many kinds of self-plasmin in antarctic krill, till now, whether the autolysis of Antarctic krill accelerated extracting of Antarctic krill oil is unclear. In this work, papain was used to extract Antarctic krill oil, while the role of self-lysosomal system in the Antarctic krill oil extraction process was evaluated. The results showed that krill autolysis was beneficial for Antarctic krill oil extraction, and lysosomal system combined with papain can work together to achieve the best extraction results. The content of eicosapentaenoic acid(EPA) and docosahexaenoic acid(DHA) in shrimp oil was investigated with respect to extraction parameters such as enzymatic hydrolysis temperature, solid-liquid ratio, enzyme dosage, hydrolysis time and pH. One-factor-at-a-time experiments followed by orthogonal test analysis were carried out to achieve the optimal extraction conditions as below: At a temperature of 50 ℃, solid-liquid ratio of 1∶22 g/mL, enzyme dosage of 1.25%, pH7.0 hydrolysis 2 hours. Under the optimal conditions, the total content of EPA and DHA in the shrimp oil is up to 75.77%。

Keywords:Antarctic krill; papain; autolyzed; extraction

南極磷蝦漁業(yè)始于20世紀(jì)60年代，80年代達到鼎盛期，1982年上岸量達到歷史最高的52.8 萬噸.據(jù)估計，南極磷蝦的生物量為6.5~10.5 億噸[1-2]，是整個南大洋生態(tài)系統(tǒng)能量和物質(zhì)流動的關(guān)鍵環(huán)節(jié)[3-4]，具有巨大的開發(fā)和利用潛力.南極磷蝦營養(yǎng)比例適中，必需氨基酸占總氨基酸的一半以上，蛋白質(zhì)含量豐富，被視為人類食品中最有希望，也是最后一個動物蛋白庫[5].同時，南極磷蝦中含有大量以磷脂形式存在的ω-3長鏈多不飽和脂肪酸[6]和豐富的蝦青素，以ω-3長鏈多不飽和脂肪酸為主要功能成分的南極磷蝦油成為新興產(chǎn)品.目前，市場上的南極磷蝦油以進口產(chǎn)品為主，價格昂貴.近幾年，我國對南極磷蝦油的提取技術(shù)研究也逐漸成為熱點領(lǐng)域[7-9]。

南極磷蝦油提取方法包括堿解法、有機溶劑浸提法[10]、超臨界流體萃取法及酶解法等.在酶解技術(shù)制備南極磷蝦油的報道中，均采用添加蛋白酶的方法對南極磷蝦粉進行酶解，并結(jié)合溶劑進行提取.自溶是南極磷蝦的重要特點，其體內(nèi)含有豐富的自溶酶體系，而自溶酶體系是否在南極磷蝦油提取過程中發(fā)揮了作用仍不清楚[11-12].在前人研究的基礎(chǔ)上，筆者首次對自溶酶體系在南極磷蝦油提取中的作用進行探索，并對木瓜蛋白酶、自溶酶及兩者復(fù)合體系酶解效果進行比較，通過工藝優(yōu)化，以期獲得高效、低耗的南極磷蝦油最優(yōu)提取方法。

1材料與方法

1.1材料和試劑

南極磷蝦由上海水產(chǎn)集團總公司提供；色譜純正己烷購自天津市四友精細(xì)化學(xué)品有限公司；活性為≥3 units/mg的木瓜蛋白酶購自阿拉?。畸}酸、甲醇、無水乙醇、丙酮、正己烷、石油醚和乙酸乙酯均為分析純，購自國藥集團。

1.2儀器和設(shè)備

EL204電子天平購自梅特勒-托利多儀器公司；ST16R臺式離心機購自賽默飛世爾科技(中國)有限公司；7890A氣相色譜儀購自美國安捷倫公司；R-210旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀購自瑞士Buchi公司；SH2-D(Ⅲ)真空泵購自鞏義市予華儀器有限公司；DK-S24水浴鍋購自上海精宏實驗設(shè)備有限公司。

1.3方法

1.3.1提取溶劑的選擇

根據(jù)油脂的極性大小，分別選用油脂提取過程中常用的正己烷、石油醚、乙酸乙酯、丙酮和無水乙醇等5種提取劑進行提取[13-15].取10 g南極磷蝦粉末，酶解，離心，加入100 mL提取劑提取2 h，離心，取上清.下層再加入100 mL提取劑，相同條件提取，上清合并，旋干，得蝦油。

1.3.2不同處理提取效果比較

1) 自溶酶體系實驗：取100 g鮮蝦，經(jīng)勻漿后加100 mL水，在50 ℃下酶解2 h，取出后離心，取下層固體，用乙醇提取兩次，每次加100 mL，50 ℃條件下提取2 h，合并提取液，旋干，獲得樣品。

2) 木瓜蛋白酶酶解實驗：取100 g鮮蝦，先于80 ℃烘箱中滅活，然后取出，經(jīng)勻漿后，加100 mL蒸餾水和適量木瓜蛋白酶，在50 ℃下酶解2 h，取出后離心，取下層固體，用乙醇提取兩次，每次加100 mL，50 ℃條件下提取2 h，合并提取液，旋干，獲得樣品。

3) 木瓜蛋白酶結(jié)合自溶酶體系酶解實驗：取100 g鮮蝦，經(jīng)勻漿后加100 mL水和適量的木瓜蛋白酶，在50 ℃下酶解2 h，取出后離心，取下層固體，用乙醇提取兩次，每次加100 mL，50 ℃條件下提取2 h，合并提取液，旋干，獲得樣品。

1.3.3蝦油提取工藝優(yōu)化

基于南極磷蝦自溶的特性，考慮到生產(chǎn)實際，本實驗首先對南極磷蝦進行凍干，既可保持南極磷蝦體內(nèi)自溶酶活性，又易于工業(yè)化貯藏.在優(yōu)化提取工藝條件時，采用南極磷蝦冷凍干燥粉進行實驗.具體工藝如下：

鮮南極磷蝦→冷凍干燥→粉碎→酶解→離心得下層沉淀→浸提→離心→上清→旋干→蝦油

1.3.4南極磷蝦油甲酯化

取0.5 mL蝦油于離心管中，快速加入體積分?jǐn)?shù)為5%鹽酸甲醇2 mL，立即密封放入100 ℃恒溫箱中反應(yīng)3 h，冷卻至室溫，加入等體積的高純水，用3 mL正己烷分三次萃取，回收正己烷相，用無水硫酸鈉除水并經(jīng)0.22 μm濾膜過濾，氮氣吹干.用正己烷定容至1 mL，進樣。

1.3.5氣相色譜分析

1) 氣相色譜條件

色譜柱：DB-23(0.25 mm，60 m)；程序升溫條件：130 ℃保留1 min，6.5 ℃/min升至180 ℃，然后2.5 ℃/min升至225 ℃并保持10 min；分流比：1∶50；進樣量10 μL；以N2為載氣流速1.0 mL/min。

2) EPA與DHA總質(zhì)量分?jǐn)?shù)計算

式中：c1為EPA質(zhì)量濃度，ng/μL；c2為DHA質(zhì)量濃度，ng/μL；c3為總脂肪酸質(zhì)量濃度，ng/μL。

2結(jié)果與分析

2.1不同溶劑對提取效果的影響

根據(jù)圖1可知：乙酸乙酯的提取效果最好，無水乙醇的提取效果次之.基于生產(chǎn)安全及產(chǎn)品質(zhì)量考慮，選擇無水乙醇作為提取溶劑。

圖1　不同溶劑對南極磷蝦油提取的影響Fig.1　Effect of different solvents on the extraction to Antarctic krill oil

2.2不同處理提取效果比較

在其它條件相同的情況下，分別采用木瓜蛋白酶、自溶酶體系及兩者復(fù)合體系對南極磷蝦進行酶解，不同處理所得磷蝦油中EPA與DHA總質(zhì)量分?jǐn)?shù)，如圖2所示。

圖2　自溶酶、木瓜蛋白酶及兩者復(fù)合體系對南極磷蝦油中EPA與DHA總質(zhì)量分?jǐn)?shù)的影響Fig.2　Comparison of enzymatic hydrolysis, autolysis and a combination of both

由圖2可知：木瓜蛋白酶與自溶酶復(fù)合體系制備的南極磷蝦油中EPA與DHA總質(zhì)量分?jǐn)?shù)比自溶酶或木瓜蛋白酶單獨作用高，說明兩種酶體系在南極磷蝦油提取過程中均發(fā)揮了作用，故在后續(xù)研究中，采用木瓜蛋白酶與自溶酶復(fù)合作用方法進行南極磷蝦油提取工藝優(yōu)化。

2.3復(fù)合酶制備南極磷蝦油工藝優(yōu)化

2.3.1酶解溫度對提取效果的影響

取南極磷蝦粉末10.0 g，控制料液比1∶10 g/mL，加酶質(zhì)量分?jǐn)?shù)1%，酶解時間2 h，pH7.0，分別在30，40，50，60，70 ℃溫度下進行酶解.酶解后進行溶劑提取，不同處理所得磷蝦油中EPA與DHA總質(zhì)量分?jǐn)?shù)，如圖3所示。

圖3　酶解溫度對南極磷蝦油提取的影響Fig.3　Effect of different enzymatic hydrolysis temperature on the extraction to Antarctic krill oil

由圖3可知：隨著溫度的升高，EPA和DHA在總脂肪酸的質(zhì)量分?jǐn)?shù)先減少，后增加，最后略微下降，趨于平衡.出現(xiàn)這種現(xiàn)象的原因，可能與南極磷蝦自溶酶系統(tǒng)與木瓜蛋白酶在不同溫度下水解能力差異性有關(guān).溫度為50 ℃時，含量最高，是因為在pH為7.0的條件下，南極磷蝦自溶酶的活性最高[13]，且50～65 ℃是木瓜蛋白酶的最適溫度.因此，選擇45，50，55，60 ℃作為正交實驗的4個水平。

2.3.2料液比對提取效果的影響

取南極磷蝦粉末10.0 g，控制溫度50 ℃，加酶質(zhì)量分?jǐn)?shù)1%，酶解時間2 h，pH7.0，料液比分別為1∶6，1∶10，1∶14，1∶18，1∶22 g/mL，進行單因素實驗，不同處理所得磷蝦油中EPA與DHA總質(zhì)量分?jǐn)?shù)，如圖4所示。

圖4　料液比對南極磷蝦油提取的影響Fig.4　Effect of different material-to-liquid ratio on the extraction to Antarctic krill oil

由圖4可知：隨著料液比的增加，EPA和DHA在總脂肪酸中的質(zhì)量分?jǐn)?shù)逐漸增加，這可能與酶活性位點與底物是否完全接觸有關(guān).由于料液比為1∶22 g/mL時EPA與DHA總質(zhì)量分?jǐn)?shù)處于最高點，故在后續(xù)正交實驗中，增加1∶26，1∶30 g/mL作為考察水平.因此，選擇料液比為1∶18，1∶22，1∶26，1∶30 g/mL作為正交實驗的4個水平。

2.3.3加酶質(zhì)量分?jǐn)?shù)對提取效果的影響

取南極磷蝦冷凍粉末10.0 g，控制溫度50 ℃，料液比1∶22 g/mL，酶解時間2 h，pH7.0，加酶質(zhì)量分?jǐn)?shù)分別為0.5%，1.0%，1.5%，2.0%，2.5%，進行單因素實驗，各處理所得磷蝦油中EPA與DHA總質(zhì)量分?jǐn)?shù)，如圖5所示。

圖5　加酶質(zhì)量分?jǐn)?shù)對南極磷蝦油提取的影響Fig.5　Effect of different enzyme dosage on the extraction to Antarctic krill oil

由圖5可知：隨著木瓜蛋白酶量的增加，EPA和DHA在總脂肪酸中的質(zhì)量分?jǐn)?shù)變化不明顯.基于生產(chǎn)實際考慮，最佳加酶質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1.0%～1.5%，故選擇0.75%，1.0%，1.25%，1.5%作為正交試驗的4個水平。

2.3.4酶解時間對提取效果的影響

取南極磷蝦粉末10.0 g，控制溫度50 ℃，料液比1∶22 g/mL，加酶質(zhì)量分?jǐn)?shù)1.0%，pH7.0，酶解時間分別為1.0，1.5，2.0，2.5，3.0 h，進行單因素實驗，各處理所得磷蝦油中EPA與DHA總質(zhì)量分?jǐn)?shù)，如圖6所示。

圖6　酶解時間對南極磷蝦油提取的影響Fig.6　Effect of different enzymatic hydrolysis time on the extraction to Antarctic krill oil

由圖6可知：隨著酶解時間的增加，EPA和DHA在總脂肪酸中的質(zhì)量分?jǐn)?shù)，先增加，后續(xù)逐漸趨于平穩(wěn).究其原因，可能開始時酶的底物較為豐富，酶的活性較高，但是隨著酶解時間的增加，底物逐漸減少，蛋白酶之間相互發(fā)生水解加劇，蛋白酶的活力逐漸下降.因此，最佳水解時間為2 h，故選擇1.6，2.0，2.4，2.8 h作為正交試驗的4個水平。

2.3.5pH對提取效果的影響

取南極磷蝦粉末10.0 g，控制溫度50 ℃，料液比1∶22 g/mL，加酶質(zhì)量分?jǐn)?shù)1.0%，酶解時間2.0 h，pH分別為4.0，5.0，6.0，7.0，8.0，進行單因素實驗.各處理所得磷蝦油中EPA與DHA總質(zhì)量分?jǐn)?shù)，如圖7所示。

圖7　pH對南極磷蝦油提取的影響Fig.7　Effect of different pH on the extraction to Antarctic krill oil

由圖7可知：隨著pH的增大，EPA和DHA在總脂肪酸中的總質(zhì)量分?jǐn)?shù)先減小，后增大，最后趨于水平.出現(xiàn)這種現(xiàn)象的原因是南極磷蝦自溶酶系統(tǒng)中有兩種酸性蛋白酶，最適pH為3.0[16]；有一種類胰蛋白酶，最適pH為8.0[17]；有兩種羧肽酶，最適pH為5.5～6.5[18].然而，木瓜蛋白酶的最適pH為6.0～7.0.所以在pH為4.0時，主要是自溶酶系統(tǒng)中的酸性蛋白酶在發(fā)揮水解作用；在pH為6.0～8.0時，是木瓜蛋白酶與自溶酶共同發(fā)揮水解作用.因此，選擇pH為6.0，6.5，7.0，7.5作為正交實驗的4個水平。

2.4正交試驗結(jié)果

在單因素實驗的基礎(chǔ)上，以pH、酶解溫度、酶解時間、料液比和加酶質(zhì)量分?jǐn)?shù)為參考因素，每個因素設(shè)4個水平，正交表設(shè)計及結(jié)果如表1，2所示。

表1　酶解結(jié)合自溶法提取工藝因素水平表

表2　酶解結(jié)合自溶法法提取工藝L16(45)正交試驗結(jié)果

由表2可知：RB>RD>RE>RC>RA，即酶解溫度對提取效果影響最大，料液比次之，加酶質(zhì)量分?jǐn)?shù)第三，酶解時間第四，pH值影響最小.在pH的影響中，K3最大；在酶解溫度的影響中，K1最大；在酶解時間的影響中，K2最大；在料液比的影響中，K4最大，考慮到K2與K4接近，料液比的增大顯著增加成本，故選擇K2最優(yōu)；在加酶質(zhì)量分?jǐn)?shù)的影響中，K3最大.綜上，正交試驗的最優(yōu)組合為A3B1C2D2E3。

2.5驗證試驗

取南極磷蝦粉末10.0 g，控制溫度45 ℃，料液比1∶22 g/mL，加酶質(zhì)量分?jǐn)?shù)1.25%，酶解時間2.0 h，pH為7.0，進行3組實驗.測得的EPA和DHA在總脂肪酸中的質(zhì)量分?jǐn)?shù)分別為75.99%，75.42%，75.91%，平均值為75.77%.顯著大于正交實驗中的EPA和DHA在總脂肪酸中的質(zhì)量分?jǐn)?shù)，證明該結(jié)果合理可靠。

3結(jié)論

南極磷蝦中存在的自溶酶體系參與了南極磷蝦油的提取過程，木瓜蛋白酶與自溶酶體系共同作用提取南極磷蝦油，不僅充分利用了南極磷蝦自身含有的自溶酶體系，而且效果優(yōu)于兩者單獨作用.所得到的蝦油，活性成分EPA與DHA質(zhì)量分?jǐn)?shù)總和明顯高于兩者單獨使用，質(zhì)量更優(yōu)；以南極磷蝦中EPA和DHA總質(zhì)量分?jǐn)?shù)作為指標(biāo)，獲得的南極磷蝦油最佳提取工藝：在溫度為45 ℃及pH為7.0時，控制料液比為1∶22 g/mL，加酶質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1.25%，水浴酶解2.0 h.該條件下所得南極磷蝦油EPA和DHA在總脂肪酸中的質(zhì)量分?jǐn)?shù)為75.77%。

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(責(zé)任編輯：陳石平)

中圖分類號：R774.1

文獻標(biāo)志碼：A

文章編號：1006-4303(2015)02-0143-05

作者簡介：于海寧，(1977—)女，山東濰坊人，副教授，研究方向為天然藥物，E-mail: yuhaining@zjut.edu.cn。

基金項目：浙江省自然科學(xué)基金資助項目(LQ12C02003)