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    中國毛蝦自溶前后多肽和氨基酸的變化

    2023-10-24 02:38:44祝寶華李曉暉3楊志艷惠婷婷徐晨晨李
    食品與機械 2023年9期
    關鍵詞:自溶內(nèi)源分子量

    祝寶華李曉暉,2,3楊志艷惠婷婷徐晨晨李 燕,2,3

    (1. 上海海洋大學,上海 201306;2. 上海水產(chǎn)品加工及貯藏工程技術研究中心,上海 201306;3. 農(nóng)業(yè)部水產(chǎn)品貯藏保鮮質(zhì)量安全風險評估實驗室,上海 201306)

    中國毛蝦(Aceteschinensis)又稱毛蝦、蝦米等,是中國渤海、黃海以及東南沿岸淺海近海水域特有的一種蝦類品種。據(jù)統(tǒng)計[1],2020年中國毛蝦捕撈量達36.7萬t,占蝦類捕撈量的30.45%,位列第一。毛蝦的主要加工產(chǎn)品為蝦皮、蝦醬等,產(chǎn)品附加值低。蝦體發(fā)生肌肉軟化主要由自身存在的內(nèi)源酶(如胰蛋白酶、組織蛋白酶和鈣蛋白酶等)引起[2]。蝦頭中的內(nèi)源酶在一定條件下被激活,并與周圍組織發(fā)生反應或者導致蛋白質(zhì)降解,從而導致蝦的自溶[3]。陳詩妍等[4]研究發(fā)現(xiàn),貯藏過程中,蝦頭中富含的內(nèi)源酶對蝦體中的肌原纖維蛋白重鏈和肌動蛋白有較強的降解作用,其中胰蛋白酶對肌原纖維蛋白的降解作用最強,且隨著貯藏溫度和時間的增大,降解程度越大。

    中國毛蝦干基中粗蛋白含量為(75.85±0.19)%,必需氨基酸(EAA) 含量為39%[5],是制備生物活性肽和氨基酸的優(yōu)良來源。且毛蝦活性肽具有抗氧化性[6]、增強免疫[7]、降血壓[8]等活性。Cao等[9]利用Alcalase 2.4L酶酶解中國毛蝦蛋白,制備了具有自由基清除活性的低分子肽,且分子量為915~207 Da的小分子肽具有較強的DPPH自由基和羥自由基清除活性。許萍等[10]利用3942中性蛋白酶酶解中國毛蝦蛋白,篩選出的二肽(Ser-Pro)具有較高的血管緊張素轉移酶(ACE)抑制活性。利用外源酶酶解法以回收蛋白質(zhì)資源是當前較普遍的低值蝦類高值化利用方法[11],但存在成本較高的問題,且對毛蝦內(nèi)源酶特性和自溶降解產(chǎn)物的研究尚未見報道。有研究[12-13]顯示,蝦的自溶產(chǎn)物具有較好的抗氧化和抑菌活性,能夠制備生物活性肽。尹雪蓮等[14]采用50 ℃水浴對鷹爪蝦頭進行自溶反應,篩選得到了抗凍肽。

    研究擬探究中國毛蝦內(nèi)源蛋白酶的酶學特性,分析其自溶的最適條件,以及自溶過程中多肽含量、自溶前后游離氨基酸和自溶產(chǎn)物分子量的變化情況,以期為低值毛蝦小分子生物活性肽和氨基酸類產(chǎn)品開發(fā)提供依據(jù)。

    1 材料與方法

    1.1 材料與儀器

    1.1.1 材料與試劑

    中國毛蝦:新鮮毛蝦挑揀分裝后于-20 ℃貯藏,市售;

    抑肽酶、細胞色素C、桿菌肽、Gly-Gly-Gly、Gly-Gly-Tyr-Arg:上海索萊寶生物科技有限公司;

    乙腈、三氟乙酸:美國Sigma-Aldrich公司;

    大豆肽:蘭州沃特萊斯生物科技有限公司;

    酪氨酸:分析純,天津諾奧科技發(fā)展有限公司;

    三氯乙酸(TCA)、氫氧化鈉、硫酸銅、乙醇等:分析純,國藥集團化學試劑有限公司。

    1.1.2 主要儀器設備

    多頭磁力攪拌器:HJ-4A型,金壇市科析儀器有限公司;

    臺式高速離心機:TG16-WS型,湖南湘儀實驗室儀器開發(fā)有限公司;

    分光光度計:UV-1800PC型,上海美譜達有限公司;

    凝膠色譜柱:TSKgelG2000 SWXL型,北京金歐亞科技發(fā)展有限公司;

    液相色譜儀,E2695型,譜質(zhì)分析檢測技術(上海)有限公司。

    1.2 方法

    1.2.1 內(nèi)源蛋白酶的分離純化

    (1) 硫酸銨法分級沉淀:根據(jù)陳康玉等[15]的方法并修改。將粉碎后的中國毛蝦蝦糜按m蝦糜∶V緩沖液為1∶4 (g/mL)加入磷酸緩沖溶液(pH 6.8),4 ℃靜置過夜(約8 h),4 000 r/min離心8 min,收集上清液并加入硫酸銨至20%飽和度,4 ℃靜置4 h;8 000 r/min離心10 min,收集上清液加入硫酸銨至80%飽和度,4 ℃靜置4 h;8 000 r/min離心10 min,收集沉淀。將沉淀按m沉淀∶V緩沖液為1∶1 (g/mL)加入磷酸緩沖液,4 ℃下,于8 000 Da透析袋中透析4 h,重復3次,即得粗酶。

    (2) Sephadex G-50凝膠層析:采用去離子水平衡柱子(1.6 cm×50 cm),粗酶液用0.45 μm濾膜過濾后,用去離子水洗脫,流速0.5 mL/min,紫外檢測波長280 nm,收集出峰組分。冷凍干燥后進行酶學性質(zhì)研究。

    1.2.2 酶活力測定 采用福林酚法[16]。

    1.2.3 最適pH和最適溫度的選擇 30 ℃下于不同pH(2.0,3.0,4.0,5.0,6.0,7.0,8.0,9.0,10.0,11.0)下稀釋酶液,測定蛋白酶活力;最適pH下,考察溫度(30,35,40,45,50 ℃)對蛋白酶活力的影響。

    1.2.4 毛蝦蛋白自溶制備多肽單因素試驗

    (1) 自溶溫度:固定pH 7.0,反應時間3 h,考察自溶溫度(20,30,40,50,60 ℃)對多肽質(zhì)量濃度的影響。

    (2) 自溶pH:固定反應時間3 h,最佳自溶溫度,考察自溶pH(5,6,7,8,9,10)對多肽質(zhì)量濃度的影響。

    (3) 自溶時間:固定最佳自溶溫度,最適pH,考察自溶時間(1,2,3,4,5,6 h)對多肽質(zhì)量濃度的影響。

    1.2.5 正交試驗 在單因素試驗基礎上,選擇自溶pH、自溶溫度和自溶時間進行三因素三水平的正交試驗,優(yōu)化毛蝦蛋白自溶的最佳工藝條件。

    1.2.6 多肽含量測定 參照魯偉等[17]的方法,利用大豆肽(含量>99%)制作標準曲線方程為y=0.053 7x,R2=0.986 9。

    1.2.7 游離氨基酸含量測定 參照程亞美等[18]的方法。

    1.2.8 分子量測定 采用凝膠色譜法(GPC)[19]。以抑肽酶、細胞色素C、桿菌肽、Gly-Gly-Gly、Gly-Gly-Tyr-Arg為標準品,通過制備洗脫體積—分子量標準曲線和比較樣品的洗脫量來計算分子量分布。色譜條件:色譜柱TSK-GELG2000SWxl(7.8 mm × 300 mm),流動相為乙腈—水—三氟乙酸(V乙腈∶V水∶V三氟乙酸為45∶55∶0.1),檢測波長220 nm,溫度30 ℃。樣品經(jīng)0.22 μm濾膜處理,進樣量10 μL,流速0.5 mL/min。

    1.2.9 數(shù)據(jù)處理 所有試驗至少重復3次,采用SPSS 20、Origin 8.5等軟件進行統(tǒng)計分析和繪圖,結果表示為平均值±標準差。

    2 結果與分析

    2.1 內(nèi)源酶的分離純化

    由圖1可知,毛蝦蝦糜液經(jīng)純化后,僅得到單一峰,表明提取物質(zhì)單一,含量高,提取效果好。

    圖1 Sephadex G-50凝膠層析純化內(nèi)源酶

    2.2 酶的最適pH和最適溫度

    由圖2(a)可知,內(nèi)源蛋白酶在堿性條件下活性較高。當pH值為2.0~8.0時,隨著pH值的升高,蛋白酶活力增大,在pH 8.0時達最大值4 818 U/g。當pH值>8.0時,蛋白酶活力隨pH值的增加逐漸降低。王賀等[20]研究表明,凡納濱對蝦蝦頭中堿性蛋白酶的酶活性峰為pH 8~10。

    字母不同表示差異顯著(P<0.05)

    由圖2(b)可知,內(nèi)源蛋白酶的最適溫度為45 ℃。當溫度為30~45 ℃時,隨著溫度的上升酶活力增強。當溫度<40 ℃時,酶活力值上升平穩(wěn),說明在此溫度范圍內(nèi)的蛋白酶較為穩(wěn)定。當溫度由40 ℃升至45 ℃時,酶活力迅速增長并達最大(6 916 U/g)。當溫度為50 ℃時,酶活力顯著下降,表明毛蝦內(nèi)源蛋白酶不耐高溫。潘濱等[21]

    研究發(fā)現(xiàn),凡納濱對蝦體內(nèi)堿性蛋白酶的最適溫度為40~60 ℃。

    2.3 單因素試驗

    2.3.1 自溶溫度 由圖3可知,當自溶溫度<40 ℃時,隨著自溶溫度的升高,多肽質(zhì)量濃度不斷上升。當自溶溫度為40 ℃時,多肽質(zhì)量濃度達到最大(8.2 mg/mL),此后自溶溫度繼續(xù)上升,多肽質(zhì)量濃度迅速下降,說明溫度過高,內(nèi)源酶失活,導致自溶水解效果減弱。故選擇40 ℃為最適自溶溫度。

    字母不同表示差異顯著(P<0.05)

    2.3.2 自溶pH 由圖4可知,隨著起始pH值的增大,多肽質(zhì)量濃度呈先升高后降低趨勢。環(huán)境為偏酸性時,多肽質(zhì)量濃度較低,且隨著酸性的減弱,多肽質(zhì)量濃度緩慢升高。當pH值<8.0時,多肽質(zhì)量濃度急劇升高,在pH 8.0時達最大,之后開始下降。這表明毛蝦內(nèi)源蛋白酶屬于一種堿性蛋白酶。陳志峰[22]研究發(fā)現(xiàn),生曬毛蝦內(nèi)源酶的自溶適宜pH為7.5~8.0,此時氨基態(tài)氮含量達到最高。故選擇pH 8.0為最佳自溶pH。

    字母不同表示差異顯著(P<0.05)

    2.3.3 自溶時間 由圖5可知,毛蝦酶解液中多肽質(zhì)量濃度隨自溶時間的延長而逐漸增加。當自溶時間<3 h時,多肽質(zhì)量濃度顯著增加(P<0.05);當自溶時間>3 h時,隨著自溶時間的增加,多肽質(zhì)量濃度的變化趨于平穩(wěn)。其原因可能是反應初始階段,蛋白酶的底物豐富,酶活性較高,但隨著自溶時間的增加,底物減少,酶活力逐漸下降[23]。故選擇3 h為最佳自溶時間。

    字母不同表示差異顯著(P<0.05)

    2.3.4 正交試驗 根據(jù)單因素試驗結果,選擇自溶pH、自溶溫度和自溶時間為因素,以多肽質(zhì)量濃度為響應值,進行三因素三水平正交試驗。試驗因素水平見表1,試驗設計及結果見表2。

    表1 正交實驗因素水平表

    表2 正交試驗設計方案及結果

    由表2可知,各因素對中國毛蝦自溶生產(chǎn)多肽的影響程度依次為自溶時間>自溶pH>自溶溫度,最佳方案為A2B2C3,即自溶pH 8.0,自溶溫度40 ℃,自溶時間4 h,進行3次平行驗證實驗,測得多肽質(zhì)量濃度平均值為10.36 mg/mL。

    2.4 毛蝦自溶水解液中游離氨基酸和分子量變化

    2.4.1 游離氨基酸含量變化 由表3可知,毛蝦自溶水解液中共檢出17種游離氨基酸(色氨酸未測)。毛蝦自溶后游離氨基酸總含量提高了(26.16±0.02)%,必需氨基酸總占比由(40.22±0.42)%增長至(43.64±0.52)%,必需氨基酸與非必需氨基酸的比值由0.67提高至0.77,二者均超過了世界衛(wèi)生組織(WHO)和糧食及農(nóng)業(yè)組織(FAO)建議的參考值(40%和0.6)[24],表明毛蝦內(nèi)源蛋白酶解液具有較高的營養(yǎng)價值。水解產(chǎn)物中的疏水性游離氨基酸含量增加了(25.59±0.08)%。有研究[25-26]表明,疏水性氨基酸能有效清除DPPH自由基和超氧自由基,說明毛蝦自溶產(chǎn)物具有良好的抗氧化潛力。鮮味氨基酸比例由(25.49±0.13)%下降至(22.03±0.21)%,甜味氨基酸比例由(13.32±0.34)%下降至(11.54±0.18)%,苦味氨基酸比例由(46.50±0.42)%提升至(51.04±0.32)%,與胡玲萍等[27]的結果相似。因此,利用中國毛蝦自溶液制備調(diào)味品時,應慎重選擇自溶條件。

    2.4.2 多肽分子量分布變化 由圖6可知,毛蝦蛋白經(jīng)內(nèi)源酶自溶作用后,能夠降解成不同分子量的小分子多肽。其中,分子量>5 000 Da的多肽占比由自溶前的18.75%顯著下降至6.22%(P<0.05),分子量為3 000~5 000 Da的多肽占比由自溶前的1.62%顯著增加至7.00%(P<0.05);分子量為1 000~3 000 Da的多肽自溶前占比為9.48%,自溶后該分子量范圍的多肽未測出;而分子量<1 000 Da的小分子肽占比由自溶前的70.15%顯著增加至86.77%(P<0.05)。綜上,毛蝦自溶產(chǎn)物中分子量<1 000 Da的小分子多肽比例明顯提升,表明中國毛蝦內(nèi)源蛋白酶對大分子蛋白具有降解作用,自溶法具有制備生物活性肽的潛力。

    圖6 自溶前后產(chǎn)物的分子量分布

    3 結論

    對中國毛蝦內(nèi)源蛋白酶進行了分離純化。結果表明,毛蝦內(nèi)源蛋白酶的最適溫度為45 ℃,最適pH為8.0,具有堿性蛋白酶的特性,不耐高溫。毛蝦內(nèi)源蛋白酶的最適自溶工藝條件為自溶pH 8.0、自溶溫度40 ℃、自溶時間4 h,該條件下的多肽質(zhì)量濃度為10.36 mg/mL。自溶后,總游離氨基酸和必需氨基酸占比分別提升了(26.16±0.02)%和(8.50±0.03)%,疏水性氨基酸占比增加了(25.59±0.08)%,鮮味氨基酸和甜味氨基酸占比分別降低了(3.46±0.02)%和(1.78±0.01)%,而苦味氨基酸占比增加了(4.54±0.02)%;內(nèi)源蛋白酶降解產(chǎn)物分子量分布<1 000 Da的占比由70%提升至87%。后續(xù)將進一步研究自溶技術生產(chǎn)的小分子肽功能活性(如抗氧化、抗菌、降血壓等)。

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