藤黃中藤黃酸B的制備分離方法優(yōu)選及結(jié)構(gòu)確證

賈步云，彭代銀，李珊珊，胡雪瑞，朱光宇,2，陳衛(wèi)東

(1.安徽中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，安徽 合肥　230012; 2.安徽省馬鞍山市中心醫(yī)院，安徽 馬鞍山　243000)

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藤黃中藤黃酸B的制備分離方法優(yōu)選及結(jié)構(gòu)確證

賈步云1，彭代銀1，李珊珊1，胡雪瑞1，朱光宇1,2，陳衛(wèi)東1

(1.安徽中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，安徽 合肥230012; 2.安徽省馬鞍山市中心醫(yī)院，安徽 馬鞍山243000)

[摘要]目的建立一種高效且重現(xiàn)性好的藤黃酸B的制備分離方法，并對分離產(chǎn)物進行結(jié)構(gòu)確證。方法采用乙醇超聲提取方式對藤黃藥材進行初步提取，用中壓制備色譜和高壓制備色譜相結(jié)合的方式對藤黃乙醇提取物中藤黃酸B進行分離和純化，并采用正交設(shè)計對提取和分離工藝進行優(yōu)化。采用紅外光譜、質(zhì)譜、1H-核磁共振譜、13C-核磁共振譜對分離得到的樣品進行結(jié)構(gòu)鑒定。結(jié)果優(yōu)選的分離方法較其他方法簡便且高效可控，分離得到的樣品通過結(jié)構(gòu)鑒定，確定為藤黃酸B且純度可達(dá)到99%以上。結(jié)論所建立的藤黃酸B的提取分離方法具有高效、簡便且重現(xiàn)性好的特點。同時，本研究提供了藤黃酸B相對完整的譜圖信息，并確證了所分離藤黃酸B的結(jié)構(gòu)。

[關(guān)鍵詞]藤黃；藤黃酸；有效成分分離；結(jié)構(gòu)確證

中藥藤黃是藤黃科植物藤黃(GarciniahanburyiHook. f)的干燥樹脂，具有攻毒蝕瘡、破血散結(jié)、止血、殺蟲的功效[1]，臨床上用于治療癰疽腫毒、頑癬惡瘡、創(chuàng)傷出血及燙傷[2]?，F(xiàn)代研究發(fā)現(xiàn)藤黃中具有多種抗癌有效成分，而目前的研究熱點主要集中在藤黃酸(gambogic acid, GA)和新藤黃酸(gambogenic acid, GNA)這兩種化合物。通過查閱相關(guān)文獻(xiàn)，發(fā)現(xiàn)藤黃酸B(morellic acid，MA)也具有較強的抗癌活性，MA對于人白血病K5652及K562/s細(xì)胞株有很好的抑制作用[3]；同時，MA也具有一定的抗菌活性[4]。目前對于MA分離純化的相關(guān)研究較少，且步驟相對較為繁瑣[3-5]。本研究采用中壓制備液相色譜以及高壓制備色譜從藤黃的乙醇提取物中分離純化得到MA，優(yōu)選出一種簡便且重現(xiàn)性好的高純度MA的提取分離方法，并對分離得到的MA樣品進行結(jié)構(gòu)確證，為MA的進一步研究奠定基礎(chǔ)。

1儀器與材料

1.1儀器中壓制備液相色譜：包括TAUTOGrad200型中壓二元梯度泵TAUTOTBD2000型紫外檢測器：上海同田生物技術(shù)有限公司；中高壓玻璃制備色譜塔310 mm×100 mm，填料ODS C1830～50 μm：蘇州匯通色譜分離純化有限公司；N2000色譜工作站：浙江大學(xué)智達(dá)信息工程有限公司；Waters 2545高壓制備色譜系統(tǒng)：美國Waters公司； AB SCIEX QTRAP 4500系統(tǒng)：美國AB公司；超導(dǎo)傅立葉數(shù)字化核磁共振譜儀：瑞士布魯克公司；島津LC-15C高效液相色譜儀、紫外可見分光光度計、紅外光譜儀：日本島津公司；RE-2000B型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器：上海亞榮生化儀器廠；AB125-S型十萬分之一分析天平：德國梅特勒公司。

1.2材料甲醇(分析純)：安徽省安慶時聯(lián)特種溶劑股份有限公司；甲醇(色譜純)：上海星可高純?nèi)軇┯邢薰?；甲酸、無水乙醇、乙酸乙酯、丙酮、石油醚：均為分析純，江蘇強盛功能化學(xué)股份有限公司；藤黃：批號 201103-1，購自安徽亳州藥材市場，經(jīng)安徽中醫(yī)藥大學(xué)王效山教授鑒定，為藤黃科植物藤黃(GarciniahanburyiHook. f.)的干燥樹脂；MA對照品由安徽中醫(yī)藥大學(xué)科研實驗中心提供，純度≥98%。

2MA分析方法的建立

2.1色譜條件島津LC-15C高效液相色譜儀(包括LC-15C高壓輸液泵、SPD-15C紫外檢測器)；色譜柱：COSMOSIL C18柱(4.6 mm×250 mm，5 μm)；流動相：甲醇∶水(90∶10)；柱溫：30 ℃；進樣量20 μL；流速：1.0 mL/min；檢測波長：360 nm。MA色譜圖見圖1。

2.2對照品溶液的配制精密稱取MA對照品10.0 mg，置于50 mL容量瓶中，加甲醇定容至刻度線，即得200 μg/mL的對照品溶液，于4 ℃冰箱保存。

2.3供試品溶液的配制精密稱取MA樣品10.0 mg，置于50 mL容量瓶中，加甲醇定容至刻度線，即得200 μg/mL的對照品溶液，于4 ℃冰箱保存。

2.4線性關(guān)系考察精密移取0.025、0.25、0.5、1、1.5、2、4、8 mL的對照品溶液，置于50 mL容量瓶中，加甲醇定容至刻度，配制成0.1、1、2、4、6、8、16、32 μg/mL的標(biāo)準(zhǔn)系列濃度，搖勻及過濾后，進樣分析，以峰面積(y)對MA的質(zhì)量濃度(x)進行線性回歸，回歸方程：y=32 080x-589.34(r=0.999 8)，表明MA在0.1~32 μg/mL濃度范圍內(nèi)線性良好。

2.5穩(wěn)定性試驗取供試品溶液分別于0、0.5、1、2、3、4、5 h進樣分析，結(jié)果MA峰面積的RSD為1.22%，表明MA的供試品溶液在5 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.6精密度試驗取標(biāo)準(zhǔn)品溶液200 μg/mL，重復(fù)進樣5次，測定MA峰面積，計算MA峰面積的RSD值為0.71%。

2.7重復(fù)性試驗平行制備6份MA供試品溶液，進樣分析，計算MA峰面積RSD值為1.48%。

2.8加樣回收率試驗制備質(zhì)量濃度分別為20、50、100 μg/mL的供試品溶液各3份(共9份)，每組分別按供試品量的80%、100%、120%精密加入對照品溶液，用流動相配成合適濃度，進樣分析，計算得平均加樣回收率為99.74%，RSD為1.04%。

3分離與純化

3.1藤黃總酸的提取

3.1.1提取方法取藤黃100 g，粉碎后用乙醇超聲提取，提取后靜置30 min，待溶液分層后，取上層液進行抽濾。取濾液在50 ℃條件下減壓蒸餾至濃稠狀，取出黏稠的液體倒入蒸發(fā)皿內(nèi)，在55 ℃下真空干燥5～6 h，待完全膨脹疏松后，取出產(chǎn)物進行稱量，即得藤黃總酸。

3.1.2提取方法優(yōu)化采用正交設(shè)計對于MA的中壓制備色譜分離方法進行優(yōu)選，通過預(yù)實驗選取了乙醇濃度(A)、乙醇用量(B)、提取時間(C)、提取次數(shù)(D)為考察因素，以MA的得率為考察指標(biāo)，因素水平表如表1所示。

表1　正交試驗因素水平表

3.1.3優(yōu)化結(jié)果與分析在平行操作條件下，對按照L9(34)正交試驗提取的9份干浸膏處理后分別進樣，測定MA的含量。正交試驗結(jié)果及方差分析見表2、表3。根據(jù)表2直觀分析極差大小可知，影響MA提取因素的主次順序為：A>D>B>C；從方差分析可見，A因素的主效應(yīng)有統(tǒng)計學(xué)意義。綜合考慮二者，藤黃總酸提取的最佳工藝條件為：A1B2C3D3，即提取工藝為95%乙醇，6倍量，每次提取3 h，提取3次。

表2　正交試驗結(jié)果

表3　L9(34)正交試驗的方差分析結(jié)果

注:F0.05(2，2)=19.00。

3.1.4醇提優(yōu)化工藝驗證試驗按照優(yōu)化后的工藝進行試驗，測得3批干浸膏中MA的平均含量為0.99 g，RSD值為1.5%，表明該提取工藝穩(wěn)定可行。

3.2MA的中壓液相色譜分離

3.2.1樣品前處理稱取一定量藤黃總酸粉末，加入無水乙醇10 mL，在40 ℃條件下超聲20 min后呈黏稠狀，備用。

3.2.2分離方法取下中高壓玻璃制備色譜塔預(yù)柱的上蓋，將“2.2.1”項下所述試樣倒入預(yù)柱的填料中并攪拌均勻，在拌樣硅膠頂端撒上防沖硅膠后擰緊上蓋，打開中壓制備液相色譜。為防止流速過快將樣品沖散，應(yīng)逐漸提高流動相流速。按照色譜工作站上的色譜圖(圖2)接取保留時間125.4～185.7 min的色譜峰所對應(yīng)的洗脫液，55 ℃減壓蒸餾,待溶液剛剛飽和時取下，在室溫下放置2～3 d自然結(jié)晶，使用微孔濾膜進行抽濾，得MA粗品。

3.2.3分離工藝優(yōu)選采用正交設(shè)計對于MA的中壓制備色譜分離方法進行優(yōu)選，選取上樣量(A)、流動相比例(B)以及流速(C)為考察因素，以MA的得率為考察指標(biāo)，因素水平表見表4。

表4　正交試驗因素水平表

3.2.4優(yōu)選結(jié)果及分析在平行操作條件下，按照L9(34)正交試驗進行9次MA的中壓制備色譜分離，測定MA的得率。正交試驗結(jié)果及方差分析見表5、表6。由表2極差大小的直觀分析可知，影響MA提取因素的主次順序為：A>B>C；從方差分析可見，A因素的主效應(yīng)具有統(tǒng)計學(xué)意義。綜合考慮二者，藤黃總酸提取的最佳工藝條件為A2B2C2，即MA中壓制備色譜分離工藝為流動相甲醇和水的比例為80∶20，上樣量35 g，流速150 mL/min。

表5　L9(34)正交試驗結(jié)果

表6　L9(34)正交試驗的方差分析結(jié)果

注:F0.05(2,2)=19.00。

3.2.5中壓制備色譜分離優(yōu)化工藝驗證實驗按照優(yōu)化后的工藝進行實驗，測得3批分離所得MA粗品的平均得率為80.89%，RSD值為1.6%，表明該分離工藝穩(wěn)定可行。

3.3MA的高壓制備色譜純化

3.3.1樣品處理取MA粗品1 g逐漸加入甲醇溶解成飽和溶液后，用0.45 μm濾膜過濾，備用。

3.3.2分離純化取“2.3.1”項下樣品，通過Waters 2545高壓制備色譜系統(tǒng)進行純化，色譜條件為色譜柱：SunFire prep C18(32 mm×250 mm，5 μm)；流動相：甲醇∶水(V/V)90∶10；流速：15 mL/min；進樣量：1 mL；檢測波長：360 nm；洗脫液自動接收程序：按照最小接收峰面積150 000接收洗脫液；收集保留時間為33.00～34.00 min洗脫液，并蒸干溶劑，即得純化后的MA樣品。見圖3。

3.4理化性質(zhì)及鑒別分離得到的MA為橙黃色粉末，熔點溫度為108～109 ℃。分別采用氯仿-甲醇、石油醚-乙酸乙酯及石油醚-丙酮3種不同的展開劑體系進行薄層鑒別，均為單一斑點。本研究采用高效液相色譜法面積歸一化法計算分離得到產(chǎn)物的純度，結(jié)果表明純度大于99%，符合結(jié)構(gòu)鑒定的要求。

3.5工藝流程圖見圖4。

4MA的結(jié)構(gòu)確證

4.1質(zhì)譜取5 μg/mL的MA樣品，于質(zhì)譜中分析，樣品的電噴霧質(zhì)譜圖給出其準(zhǔn)分子離子峰m/z為561.1(M+)，其分子量約為561。同時，圖譜也給出了其主要碎片峰，分別為：505.0(C29H29O8)，477.1(C28H29O7)，459.0(C28H27O6)，441.0(C28H25O5)，418.9(C26H27O5)，378.8(C23H23O5)，337.8(C19H14O6)，229.1(C13H9O4)。將上述質(zhì)譜數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)[6]中MA的電噴霧質(zhì)譜數(shù)據(jù)進行比對，數(shù)據(jù)一致。

4.2紅外光譜MA樣品的紅外光譜圖中3 080 cm-1處強吸收峰為酚羥基伸縮振動。2 976、2 928 cm-1處強吸收峰分別為甲基和亞甲基結(jié)構(gòu)的伸縮振動，1 435 cm-1處的強吸收峰為甲基和亞甲基結(jié)構(gòu)的不對稱面內(nèi)彎曲振動，1 364 cm-1處的強吸收峰為甲基的對稱面內(nèi)彎曲振動，1 384 cm-1處近似等高雙峰為偕二甲基的特征吸收。3 360 cm-1處強吸收峰為羧酸上羥基的伸縮振動，1 738 cm-1處強吸收峰為羧酸上羰基的伸縮振動。1 690 cm-1處強吸收峰為酮羰基的伸縮振動。1 651、1 593、1 435 cm-1處的強吸收峰為芳環(huán)骨架的伸縮振動。1 302 cm-1處的強吸收峰以及1 166 cm-1處的弱吸收峰為酚羥基碳氧鍵的伸縮振動。1 247 cm-1處的強吸收峰為芳香醚碳氧鍵的伸縮振動。上述結(jié)果表明：MA樣品化學(xué)結(jié)構(gòu)中存在各官能團紅外光譜特征與MA的化學(xué)結(jié)構(gòu)紅外吸收理論值基本一致。

4.3核磁共振光譜用氘代甲醇溶解試樣，采用四甲基硅烷作為內(nèi)標(biāo)，測定MA的核磁共振氫譜為：1H-NMR(MeOD, 400 MH)δ12.75(1H，s), 7.56(1H, d,J=6.8 Hz), 6.52(1H, d,J=10.0 Hz), 6.07(1H, t,J=7.0 Hz), 5.44(1H, d,J=10.0 Hz), 5.02(1H, d,J=6.0 Hz), 3.45(1H, dd,J=6.4 Hz, 4.8 Hz), 3.32(2H, m), 3.07(2H, m), 3.01(2H, m), 2.47(1H, d,J=9.6 Hz), 2.31(1H, dd,J=13.6 Hz,J=4.5 Hz), 1.71(3H, s), 1.69(3H, s), 1.67(3H, s), 1.61(3H, s), 1.38(3H, s), 1.37(3H, s), 1.26(3H, s)。

用氘代甲醇溶解試樣，采用四甲基硅烷作為內(nèi)標(biāo)，測得MA的核磁共振碳譜如下：

13C-NMR(MeOD, 100 MHz)δ204.59，180.14，170.66，162.64，157.47，157.05，137.54，135.14，132.66，130.86，127.73，126.05，122.23，116.87，109.75，104.57，101.28，90.82，83.16，79.23，50.74，47.10，30.91，29.56，28.37，28.22，28.18，26.48，26.43，21.87，19.04，18.91，12.40。

將上述核磁共振光譜數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)[7]中MA的數(shù)據(jù)進行比對，數(shù)據(jù)一致。

5結(jié)果

本研究將中壓制備色譜與高壓制備色譜技術(shù)相結(jié)合，建立了一種高純度MA的提取分離純化方法，優(yōu)選出的最佳工藝為：6倍量95%乙醇超聲提取3次，每次提取3 h得到藤黃總酸；采用中壓制備液相，在流動相甲醇∶水(80∶20)，上樣量35 g，流速為150 mL/min條件下從藤黃總酸中分離得到MA粗品，最后采用高壓液相色譜進行純化。分離得到的樣品用紫外光譜、紅外光譜、質(zhì)譜、1H-核磁共振譜、13C-核磁共振譜進行結(jié)構(gòu)鑒定，并與相關(guān)文獻(xiàn)數(shù)據(jù)進行比對，結(jié)果表明，樣品確定為MA(見圖5)，經(jīng)高效液相色譜法面積歸一化法計算純度可達(dá)99%以上。

6討論

中藥藤黃中的化合物絕大部分都具有橋環(huán)結(jié)構(gòu)，化學(xué)結(jié)構(gòu)相似，因此對于這些化合物的分離存在一定難度。以往對于藤黃中化合物分離方法的研究往往是多種成分同時分離，需要反復(fù)過柱純化，步驟相對繁瑣，且重現(xiàn)性不好，不利于這些活性成分的深入研究。本研究所建立的提取分離方法針對MA這一單體化合物，采用現(xiàn)代的制備分離儀器，不僅提高分離效率，且具有良好的重現(xiàn)性和可操作性，為MA的進一步研究打下基礎(chǔ)。由于本實驗采用的分離純化實驗的規(guī)模較大，因此在MA的工業(yè)化生產(chǎn)方面也有一定的應(yīng)用前景。同時，本研究還提供了MA相對完整的光譜譜圖數(shù)據(jù)，完善了MA的結(jié)構(gòu)信息，對MA及同類化合物的結(jié)構(gòu)鑒定以及質(zhì)量控制有一定的價值。

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Optimization of Extraction and Isolation of Morellic Acid inGarciniahanburyiand Its Structure Confirmation

JIABu-yun1,PENGDai-yin1,LIShan-shan1,HUXue-rui1,ZHUGuang-yu1,2,CHENWei-dong1

(1.SchoolofPharmacy,AnhuiUniversityofChineseMedicine,AnhuiHefei230012,China;2.Ma’anshanCentralHospital,AnhuiMa’anshan243000,China)

[Abstract]ObjectiveTo establish an efficient and repeatable method for isolation of morellic acid and to confirm the structure of isolated product. MethodsGarcinia hanburyi was subjected to ethanol ultrasonic extraction, and the ethanol extract was treated by a combination of medium-pressure preparative chromatography and high-pressure preparative chromatography to isolate and purify morellic acid. An orthogonal design was used to optimize the extraction and isolation process. Also, infrared spectrometry, mass spectrometry,1H-nuclear magnetic resonance (NMR), and13C-NMR were used for the structural identification of isolated sample. ResultsThe optimized isolation method was simple and controllable. The isolated sample was structurally identified as morellic acid with a purity over 99%. ConclusionThe established extraction and isolation method for morellic acid is efficient, simple, and repeatable. This study also provides relatively full spectral information on morellic acid and confirms the structure of isolated morellic acid.

[Key words]Garcinia hanburyi; morellic acid; isolation; structure confirmation

收稿日期：(2014-08-01；編輯：張倩)

通信作者：陳衛(wèi)東，anzhongdong@126.com

作者簡介：賈步云(1989-)，男，碩士研究生

基金項目：國家科技部重大新藥創(chuàng)制專項(2009ZX09103-399)

[中圖分類號]R284[DOI]10.3969/j.issn.2095-7246.2015.01.024