益氣養(yǎng)陰生精方對微波輻射大鼠精子凋亡的影響

羅少波，李昌成，劉洪源，孫 靜，徐少強，胡海翔

（1．中國中醫(yī)科學(xué)院廣安門醫(yī)院南區(qū)，北京 102638；2．內(nèi)蒙古自治區(qū)包頭市包鋼第三職工醫(yī)院泌尿外科，內(nèi)蒙古 包頭 014010；3．黑龍江省大慶市中西醫(yī)結(jié)合醫(yī)院內(nèi)二科，黑龍江 大慶 163515；4．中國人民解放軍空軍總醫(yī)院康復(fù)醫(yī)學(xué)科，北京 100142）

隨著科技的發(fā)展，雷達、通訊、電腦電視等電磁微波輻射污染越來越嚴(yán)重。生殖系統(tǒng)是對微波輻射比較敏感的系統(tǒng)，從精原干細(xì)胞到精子成熟的過程中，任一環(huán)節(jié)遭受過量的微波輻射均可導(dǎo)致精子的異常。國內(nèi)外的研究［1－3］表明，微波輻射對精子密度、畸形率和精子活動力均有一定的影響，但其對精子形態(tài)的影響研究較少。目前，電鏡是精子形態(tài)學(xué)檢測最客觀可信的依據(jù)［4］。本研究對接受大劑量微波輻射的大鼠精子進行透射電鏡觀察，了解精子超微結(jié)構(gòu)的變化，為研究微波輻射對精子形態(tài)、結(jié)構(gòu)和功能的影響提供病理形態(tài)學(xué)依據(jù)。

1 材料

1．1 實驗動物與分組 健康7周齡雄性Wistar大鼠72只，體質(zhì)量（250±20）g，由軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院實驗動物中心提供，生產(chǎn)許可證號為SCXK（京）2013－0038。按體質(zhì)量將其隨機分為空白對照組（對照組）、高劑量1次輻射組（輻射組）、高劑量1次輻射加中藥組（中藥組），每組各24只。

1．2 主要儀器與試劑 微波模擬源：軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院核輻射防護研究室提供；離心機：德國Hermle公司生產(chǎn)，HERMLE2360K 型；WL－9000精子分析儀：北京偉力科技有限公司；細(xì)胞凋亡試劑盒：武漢博士德生物工程公司產(chǎn)品，批號 MK1023；精子孵育液：含有10mmol／L HEPES、140mmol／L NaCl、2．5mmol／L CaCl2，pH 值＝7．4。

1．3 益氣養(yǎng)陰生精方［5］為本課題組治療少精子癥的常用有效方劑，主要由生黃芪、太子參、枸杞子等組成。取中藥720g用7倍水浸泡1．5h，煎煮30 min，藥渣用4倍水煎煮20min，最后二者混合濃縮成240mL。

2 方法

2．1 輻射及中藥干預(yù)方法 微波輻射方法參考文獻［6］的方案進行。

2．1．1 對照組 大鼠只置于輻射臺上15min，不予輻照，常規(guī)飼養(yǎng)，自由攝取食水。

2．1．2 輻射組 取12只大鼠置于反射系數(shù)近似零的微波暗室，接受全身均勻輻照1次。輻照強度100mW／cm2，輻照時間15min，輻照環(huán)境溫度穩(wěn)定于（18±2）℃，濕度50%～70%。將大鼠從輻射室取出，每組6只置于飼養(yǎng)籠中，常規(guī)飼養(yǎng)，自由攝取食水。待輻射箱溫度降至18℃后，對剩下的12只大鼠進行相同處理。

2．1．3 中藥組 輻射方法同輻射組。輻射后第1天開始，每日8：00—9：00，按30g／kg灌服益氣養(yǎng)陰生精方湯劑1次，持續(xù)7d。常規(guī)飼養(yǎng)，自由攝食攝水。

2．2 取材 于輻射后第14天頸椎脫臼法處死實驗大鼠，迅速分離睪丸、附睪，摘除脂肪組織，分析天平稱取質(zhì)量。左側(cè)睪丸、附睪橫切為大致相等的兩半，一半以蘇木素－伊紅染色，切片厚5μm，行組織學(xué)觀察；另一半以5%多聚甲醛固定備用。右側(cè)睪丸、附睪以一縱兩橫法剪為大致均勻6段，置于10mL精子孵育液中孵育30min，小心將上層液體（含精子）移至另一試管中備用。

2．3 精液常規(guī)檢查 將上述所得精液吸取約100 μL，用WEILI－9000電腦精液自動分析儀測量精子密度。

2．4 脫氧核糖核苷酸末端轉(zhuǎn)移酶介導(dǎo)的缺口末端標(biāo)記（terminal－deoxynucleotidyl transferase mediated nick end labeling，TUNEL）法檢測精子凋亡 睪丸置于10%中性甲醛中固定24h，常規(guī)石蠟包埋、切片（4 μm），將已固定的標(biāo)本轉(zhuǎn)入0．5%Triton X－100中，37℃透化胞膜1h；清洗液為加入0．3%小牛血清白蛋白的磷酸鹽緩沖溶液（phosphate buffer solution，PBS），清洗后，再將標(biāo)本放入末端脫氧核苷酸轉(zhuǎn)移酶和生物素標(biāo)記核苷酸的混合液中，37℃孵育1h；清洗后轉(zhuǎn)入異硫氰酸熒光素（fluorescein isothiocyanate，F(xiàn)ITC）標(biāo)記的鏈霉親合素中，37℃孵育20min，最后將標(biāo)本移入50μg／mL碘化丙啶中復(fù)染15min。熒光顯微鏡下觀察，細(xì)胞核中有棕黃顆粒者即為凋亡細(xì)胞。陰性對照組以PBS代替末端脫氧核苷酸轉(zhuǎn)移酶反應(yīng)液。精子凋亡率計算：每張切片取5個高倍視野，共計數(shù)500個細(xì)胞，求得陽性凋亡細(xì)胞率。

2．5 統(tǒng)計學(xué)方法 采用SPSS 11．0統(tǒng)計軟件進行統(tǒng)計學(xué)分析。連續(xù)型變量采用“均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）”進行統(tǒng)計學(xué)描述。多組間均數(shù)比較采用單因素方差分析，組間均數(shù)多重比較應(yīng)用SNK檢驗。P＜0．05表示差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。

3 結(jié)果

3．1 各組每毫升睪丸組織上層培養(yǎng)液中精子總數(shù)和活躍精子數(shù)比較 與對照組比較，輻射組每毫升上層培養(yǎng)液中精子總數(shù)和活躍精子數(shù)均顯著減少（P＜0．05）；與輻射組比較，中藥組每毫升上層培養(yǎng)液中精子總數(shù)和活躍精子數(shù)顯著升高（P＜0．05）。見表1。

3．2 各組精子凋亡率比較 與對照組比較，輻射組大鼠精子凋亡率顯著升高（P＜0．05）；與輻射組比較，中藥組大鼠精子凋亡率顯著降低（P＜0．05）。見表1、圖1。

表1 各組精子凋亡率和每毫升睪丸組織上層培養(yǎng)液中精子總數(shù)、活躍精子數(shù)比較（±s）

表1 各組精子凋亡率和每毫升睪丸組織上層培養(yǎng)液中精子總數(shù)、活躍精子數(shù)比較（±s）

注：同列含有相同右上標(biāo)符號的組別相比較，P＞0．05；同列不含相同右上標(biāo)符號的組別相比較，P＜0．05。

對照 24 16．7±5．1＊ 4．29±1．71＊ 15．6±2．3＊輻射 24 13．8±4．2＃ 2．57±1．16＃ 30．5±3．6＃中藥 24 25．6±7．5△ 6．74±1．42△ 18．7±4．5△

4 討論

眾多的研究表明，睪丸是微波輻射最敏感的靶器官之一［7］，精子是雄性遺傳信息的傳遞者，微波輻射可引起睪丸和附睪中精子形態(tài)異常的數(shù)量顯著增多，附睪精子活力下降、畸形率增加、超微結(jié)構(gòu)、遺傳物質(zhì)損傷［8］，造成生殖能力下降，而且可能將畸變遺傳給子代。

在機體內(nèi)部隨時都在發(fā)生著細(xì)胞的死亡，傳統(tǒng)上用顯微鏡來觀察細(xì)胞的死亡，其特征為核染色質(zhì)的濃縮及碎片形成，但這種現(xiàn)象出現(xiàn)很晚，時間也很短暫。凋亡的特征是內(nèi)源性核酸內(nèi)切酶被激活，細(xì)胞自身的染色質(zhì)或DNA被切割，出現(xiàn)單鏈或雙鏈缺口，并產(chǎn)生與DNA斷點數(shù)目相同的3′－OH末端，末端脫氧核糖核苷酸轉(zhuǎn)移酶可將地高辛標(biāo)記的dUTP（DIG－dUTP）標(biāo)記至3′－OH末端，DIG－dUTP結(jié)合在DNA斷點部位，可以通過生物標(biāo)記的抗地高辛抗體反應(yīng)后，再結(jié)合鏈霉親和素－FITC。FITC在490～495nm激化，在520～530nm發(fā)射熒光，呈黃綠色，凋亡的細(xì)胞核呈黃綠色，從而可以在顯微鏡下觀察到著色的凋亡細(xì)胞，稱為TUNEL法。TUNEL法實際上是分子生物學(xué)與形態(tài)學(xué)相結(jié)合的研究方法，對完整的單個凋亡細(xì)胞核或凋亡小體進行原位染色，能準(zhǔn)確地反映細(xì)胞凋亡典型的生物化學(xué)和形態(tài)特征，可用于石蠟包埋組織切片、冰凍組織切片、培養(yǎng)的細(xì)胞和從組織中分離的細(xì)胞形態(tài)測定，并可檢測出極少量的凋亡細(xì)胞，因而在細(xì)胞凋亡的研究中被廣泛采用［9－11］。

本課題組經(jīng)常去中國人民解放軍空軍及雷達基地進行調(diào)研，對經(jīng)常接受雷達微波輻射的基層官兵相關(guān)體檢資料進行分析后認(rèn)為，微波輻射屬火熱之邪，微波輻射作用于人體后首先耗傷人體之氣，衛(wèi)氣受損，火熱內(nèi)傳，消灼體內(nèi)之津液，導(dǎo)致陰液不足，微波輻射損傷的致病機制在于氣損及陰、氣陰兩傷，最終造成腎之真陰及元氣的損傷，直接影響人類的生殖系統(tǒng)。針對其發(fā)病機制，治療應(yīng)以益氣養(yǎng)陰生精為基本法則，通過補益氣血陰液而使精氣得到改善，并以益氣養(yǎng)陰生精方為基礎(chǔ)方進行辨證論治，在臨床中得到較好的治療效果。本實驗結(jié)果證實，益氣養(yǎng)陰生精方可以增加微波輻射損傷的精子總數(shù)和活躍精子數(shù)，降低微波輻射增加的精子凋亡率，從而改善微波輻射后大鼠的精子質(zhì)量，達到提高微波輻射后大鼠的生殖能力的效果。

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［2］薛蕾，陳浩宇，王水明．亞急性微波輻射對大鼠精子運動參數(shù)及畸形率的影響［J］．環(huán)境與健康雜志，2012，29（7）：583－586．

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［11］方健，裴少保，吳健，等．兔脊髓沖擊傷后神經(jīng)細(xì)胞Bcl－2及Bax基因表達與原位末端標(biāo)記法檢測凋亡的比較［J］．中國骨與關(guān)節(jié)損傷雜志，2011，26（11）：995－997．