融合蛋白CR2-GDH固定化及不對(duì)稱(chēng)還原制備(S)-4-氯-3-羥基丁酸乙酯

王爽，穆曉清，聶堯，張榮珍，徐巖

（江南大學(xué)生物工程學(xué)院工業(yè)生物技術(shù)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江蘇 無(wú)錫 214122）

融合蛋白CR2-GDH固定化及不對(duì)稱(chēng)還原制備(S)-4-氯-3-羥基丁酸乙酯

王爽，穆曉清，聶堯，張榮珍，徐巖

（江南大學(xué)生物工程學(xué)院工業(yè)生物技術(shù)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江蘇 無(wú)錫 214122）

比較介孔分子篩材料SBA-15、MCM-41、海藻酸鈣、改性二氧化硅4種載體固定化融合蛋白CR2-GDH其酶固載量和酶活回收率，選擇SBA-15為固定化載體。研究固定化條件對(duì)固定化融合酶量的影響以及固定化酶的穩(wěn)定性，固定化酶在雙相體系催化不對(duì)稱(chēng)還原反應(yīng)。結(jié)果表明，在pH值為5.5、酶濃度為1.4mg/mL、反應(yīng)1h條件下，固定化酶量為27.7mg/g。加入25mmol/L的Ca2+，固定化酶的酶活回收率由58.6%提高到78.1%。與游離酶相比，固定化酶的熱穩(wěn)定性顯著提高，40℃條件下酶活回收率提高19.1%。固定化酶水相中反復(fù)使用7批次后，剩余活性仍超過(guò)30%，具有較好的操作穩(wěn)定性。與游離酶相比，固定化酶更耐受烷烴類(lèi)有機(jī)溶劑。在水/有機(jī)溶劑雙相反應(yīng)體系中，Ca2+/SBA-15固定化酶和游離酶催化相比，產(chǎn)物得率提高23.8%。

融合蛋白；SBA-15；固定化；雙相體系；不對(duì)稱(chēng)還原

氧化還原酶不對(duì)稱(chēng)還原制備手性醇具有綠色高效和成本低廉等優(yōu)點(diǎn)，是近年來(lái)國(guó)內(nèi)外手性合成的研究熱點(diǎn)，但氧化還原酶對(duì)昂貴的輔酶等當(dāng)量需求限制了其工業(yè)化規(guī)模應(yīng)用[1]。利用多基因共表達(dá)和融合表達(dá)技術(shù)，構(gòu)建具有輔酶酶法耦聯(lián)再生的一鍋法反應(yīng)體系，是目前最為有效的解決途徑，而葡萄糖脫氫酶能夠通過(guò)氧化葡萄糖生成NAD(P)H從而實(shí)現(xiàn)輔酶再生，研究較為廣泛[2-3]。

利用融合表達(dá)技術(shù)得到的融合蛋白是一種具有輔酶再生能力的多功能蛋白，不僅可以克服利用多基因共表達(dá)構(gòu)建全細(xì)胞催化劑帶來(lái)的底產(chǎn)物傳質(zhì)阻力，也可以減少雙酶偶聯(lián)催化反應(yīng)中兩種催化劑的兩步純化成本[4]，具有重要的潛在工業(yè)應(yīng)用價(jià)值。利用固定化技術(shù)不僅能夠?qū)崿F(xiàn)融合蛋白的重復(fù)利用，同時(shí)也可以有效改善其穩(wěn)定性。與目前成功實(shí)現(xiàn)的氧化還原酶多酶共固定化[5]相比，融合蛋白固定化過(guò)程簡(jiǎn)單、成本低，是多酶復(fù)合反應(yīng)體系的研究熱點(diǎn)。由于氧化還原酶在固定化過(guò)程中酶活性容易受到固定化載體的修飾作用而失活，因此目前氧化還原酶主要采用對(duì)酶活力影響較小的吸附法[6]。具有高比表面積和規(guī)則有序孔道結(jié)構(gòu)的新型介孔分子篩材料，廣泛應(yīng)用于吸附法固定化[7]。Humphrey[8]和董穎超[9]等利用修飾后SBA-15實(shí)現(xiàn)了胰蛋白酶固定化，明顯提高了操作穩(wěn)定性和熱穩(wěn)定性，后者通過(guò)固定化酶催化，使反應(yīng)6批次后剩余活性仍超過(guò)40%。

本文基于陳星星[10]對(duì)羰基還原酶CR2和葡萄糖脫氫酶GDH雙酶偶聯(lián)不對(duì)稱(chēng)還原4-氯乙酰乙酸乙酯（COBE）為(S)-4-氯-3-羥基丁酸乙酯（S-CHBE）的研究，將前期表達(dá)的融合蛋白CR2-GDH通過(guò)固定化載體的選擇和固定化條件優(yōu)化，實(shí)現(xiàn)融合蛋白的固定化，并考察其熱穩(wěn)定性、操作穩(wěn)定性、有機(jī)溶劑耐受性，為其工業(yè)化應(yīng)用奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

介孔分子篩材料SBA-15、MCM-41，南京吉倉(cāng)納米科技有限公司；改性二氧化硅，四川大學(xué)功能高分子實(shí)驗(yàn)室提供；海藻酸鈣，自制。

COBE、(S)-CHBE，Sigma-Aldrich公司；正己烷、異丙醇（色譜純），damas beta公司；酵母膏、蛋白胨，英國(guó)Oxoid公司；其余試劑，中國(guó)醫(yī)藥集團(tuán)。

高速冷凍離心機(jī)，美國(guó)Sigma公司；XC92-11DN超聲破碎儀，南京新辰生物科技有限公司；pH 計(jì)、AB204-E分析天平，瑞士Mettler Toledo公司；AKTA purifier，美國(guó)GE公司；酶標(biāo)儀，美國(guó)Thermo Fisher Scientific公司；高效液相色譜儀（HPLC），6820A氣相色譜儀（GC），美國(guó)Agilent公司。

1.2 菌種及培養(yǎng)方法

實(shí)驗(yàn)菌種：E. coliBL21/pET-cr2-linter-gdh由作者自己構(gòu)建。

LB培養(yǎng)基：酵母提取物5g/L，蛋白胨10g/L，氯化鈉10g/L，使用前加入氨芐青霉素至終濃度100mg/L，卡那霉素至終濃度50mg/L。

挑取重組菌株性E. coliBL21/ pET-cr2-linter-gdh單菌落接種于5mL的LB液體培養(yǎng)基中（卡那抗性，200r/min，37℃振蕩培養(yǎng)12h，按2%的接種量轉(zhuǎn)接于50mL LB液體培養(yǎng)基中（卡那抗性），200r/min，37℃振蕩培養(yǎng)至OD600為0.6～0.8后，加入誘導(dǎo)物異丙基-D-硫代半乳糖苷（IPTG）1mmol/L，于17℃下誘導(dǎo)培養(yǎng)10h；10000r/min離心10min并收集菌體，用生理鹽水洗滌兩次。

1.3 融合蛋白的純化

將誘導(dǎo)表達(dá)后離心獲得的E.coliBL21(DE3)/ pET-cr2-linter-gdh濕菌體用緩沖液A（100mmol/L磷酸鉀，150mmol/L NaCl，5mmol/L 咪唑）懸浮，超聲破碎，離心取上清液待上樣進(jìn)行純化。用緩沖液A平衡鎳柱10min 后上樣，先用緩沖液A將未結(jié)合的蛋白洗脫下來(lái)，再用 0～500mmol/L的咪唑緩沖液進(jìn)行梯度洗脫，收集洗脫液測(cè)定酶活，并用SDS-PAGE 檢驗(yàn)蛋白純度。

1.4 融合蛋白的酶活和蛋白質(zhì)含量測(cè)定

羰基還原酶CR2的酶活測(cè)定條件：總反應(yīng)體系0.1mL，包括0.1mol/L乙酸緩沖液（pH值5.5），1.2mmol/L NADPH，20mmol/L COBE以及適量酶液。

葡萄糖脫氫酶GDH的酶活測(cè)定條件：總反應(yīng)體系0.1mL，包括0.1mol/L乙酸緩沖液（pH 值5.5），1.2mmol/L NADP+，10mmol/L 葡萄糖以及適量酶液。

上述皆在340nm處測(cè)定吸光度的變化。

酶活力單位（U）定義為：在上述條件下，每分鐘催化1μmol NADP+還原所需的酶量或每分鐘催化1μmol NADPH氧化所需的酶量。

蛋白質(zhì)含量測(cè)定采用Bradford法。

1.5 固定化融合蛋白CR2-GDH的制備

取一定量的介孔分子篩材料SBA-15加入到一定濃度的融合蛋白溶液中，將裝置置于搖床中，200r/min 振蕩一定時(shí)間后，將溶液以12000r/min速度離心5min，保留上清液，沉淀用緩沖液洗滌多次，直到檢測(cè)不到蛋白為止，制得固定化酶，由式（1）、式（2）計(jì)算固載率和固載量。

式中，A0為固定化前的融合蛋白量；A1為固定化后上清融合蛋白量，m給酶量為總的給酶量；m載體為載體的質(zhì)量。

1.6 金屬離子對(duì)固定化融合蛋白其酶活回收率的影響

用游離酶、相同量游離酶制得的固定化酶、添加25mmol/L Ca2+固定化酶進(jìn)行催化反應(yīng)，以游離酶表現(xiàn)出的活性為100%，測(cè)得固定化酶的酶活回收率和Ca2+對(duì)酶活回收率的影響。

1.7 固定化融合蛋白熱穩(wěn)定性的測(cè)定

在不加底物的條件下，將游離酶和固定化酶在不同溫度下溫育1h，然后進(jìn)行催化反應(yīng)，以比較酶固定化前后酶活性的變化。以放在4℃下游離酶和固定化酶為對(duì)照100%。

1.8 固定化融合蛋白水相中操作穩(wěn)定性的測(cè)定

第一次反應(yīng)體系：62.5mmol/L底物COBE，表現(xiàn)出4U的固定化酶。反應(yīng)產(chǎn)率為100%時(shí)，反應(yīng)時(shí)間為2h。對(duì)固定化酶已完成催化反應(yīng)的體系離心分離，用緩沖液清洗固定化酶2～3次，重新進(jìn)行催化反應(yīng)，反應(yīng)時(shí)間和第一次完成催化反應(yīng)的時(shí)間一致（2h），定為反應(yīng)一次。重復(fù)上述操作，比較固定化酶表現(xiàn)出酶活隨使用次數(shù)的變化情況。

1.9 固定化融合蛋白有機(jī)溶劑耐受性的測(cè)定

取一定濃度的游離酶和相同濃度游離酶固定化后的固定化酶，按照1∶1的體積比（游離酶∶有機(jī)溶劑）分別添加不同有機(jī)溶劑（正己烷、正辛烷、壬烷、仲辛醇、異丙醇、苯甲醇、異丁醇、丙酮、乳酸乙酯、乙酸乙酯、鄰苯二甲酸二丁酯），固定化酶加入與游離酶中相同體積的有機(jī)溶劑，于25℃、200r/min 的搖床中震蕩1h，將溶液離心分離，棄除有機(jī)溶劑，將游離酶和固定化酶進(jìn)行催化反應(yīng)，從而測(cè)定不同有機(jī)溶劑對(duì)融合蛋白的影響。以不進(jìn)行任何處理的游離酶和固定化酶為對(duì)照，活性均為100%。

1.10 固定化融合蛋白雙相反應(yīng)體系催化COBE

模式1：起始雙相反應(yīng)體系2mL，COBE濃度125mmol/L，4U游離融合蛋白，反應(yīng)10h。

模式2：起始雙相反應(yīng)體系2mL，COBE濃度125mmol/L，表現(xiàn)出4U的固定化酶，反應(yīng)10h。

模式3：起始雙相反應(yīng)體系2mL，COBE濃度125mmol/L，表現(xiàn)出4U的固定化酶，25mmol/L的Ca2+，反應(yīng)10h。

1.11 固定化融合蛋白在雙相反應(yīng)體系中重復(fù)使用性

反應(yīng)體系：雙相反應(yīng)體系2mL，底物COBE為62.5mmol/L，表現(xiàn)出4U的固定化酶，第一次反應(yīng)8h，反應(yīng)完全。按照1.8節(jié)中的方法，對(duì)其重復(fù)使用。

1.12 產(chǎn)物得率及光學(xué)純度檢測(cè)

檢測(cè)產(chǎn)物得率及光學(xué)純度的方法參考樂(lè)庸堂等[11]報(bào)道的方法。

2 結(jié)果與討論

2.1 固定化載體的選擇

氧化還原酶固定化方法主要有吸附法、包埋法、包埋和交聯(lián)法共用等[12-14]。在這幾種固定化方法中，吸附法因其對(duì)酶活力損失影響最小且不會(huì)對(duì)酶產(chǎn)生化學(xué)修飾廣泛研究[6]。本研究主要選用4種載體SBA-15、MCM-41、改性二氧化硅、海藻酸鈣包埋對(duì)融合蛋白進(jìn)行固定化研究，考察吸附法和常用的海藻酸鈣包埋法對(duì)融合蛋白固定化的影響。其中3種載體SBA-15、MCM-41、改性二氧化硅加入20mg，酶量為0.6mg。制備海藻酸鈣1.05g，加入融合酶量34.6mg。

介孔分子篩材料作為酶固定化載體方面表現(xiàn)出優(yōu)越性，源于孔徑均一、孔道內(nèi)富含弱酸性羥基。表1中蛋白固載量和酶活回收率表明不同的固定化材料對(duì)氧化還原酶固定化效果具有較大的影響，介孔分子篩材料SBA-15和MCM-41的固定化效果好于其他兩種載體固定化，不僅蛋白固載量超過(guò)23mg/g，其最終酶活回收率分別達(dá)到49.5%和42.4%。SBA-15與MCM-41相比，孔徑更大、孔壁更厚，而且具有機(jī)械強(qiáng)度高、無(wú)毒、耐酸堿、水熱穩(wěn)定性好、成本低等特性[15]，因此選擇SBA-15作為固定化材料進(jìn)行研究。

表1 不同載體固定化融合蛋白

2.2 介孔分子篩材料SBA-15固定化融合蛋白

2.2.1 pH值對(duì)固定化酶量的影響

緩沖液pH值的變化可以改變處在緩沖液中的酶分子和固定化載體的離子化狀態(tài)，影響酶和固定化載體的結(jié)合。因此緩沖液pH值是影響融合酶固定化關(guān)鍵因素之一。

由圖1可以看出，在中性偏堿性條件下，固定化融合蛋白固載量受到較大影響，隨著pH值的上升顯著下降。在酸性條件下（pH值 5.0～6.0），固定化酶量最大，為25.5mg/g。在不同pH值條件下，固定化酶催化活力也隨著pH值的變化而變化。用pH值為6.0的磷酸鉀緩沖液制備的固定化酶活力最大，為9.3U/g（g為載體的質(zhì)量），pH值為5.5緩沖液中制備的固定化酶活力9.1U/g。同時(shí)研究表明，固定化酶活力與固定化前所處水溶液的pH值有關(guān)。前期研究表明融合蛋白的最適作用pH值為5.5，因此確定固定化最佳條件為pH值為5.5。

圖1 pH值對(duì)固定化酶量和酶活力的影響

2.2.2 酶濃度對(duì)固定化酶量的影響

融合蛋白濃度與固定化載體上的結(jié)合點(diǎn)具有飽和性。在一定范圍內(nèi)，載體固載量隨著融合蛋白濃度的增加而增加；當(dāng)融合蛋白濃度超過(guò)固定化載體上的結(jié)合點(diǎn)時(shí)，酶分子之間的活性位點(diǎn)相互作用，降低固載率和固定化酶活力。

從圖2中得出，當(dāng)酶濃度低于1.4mg/mL時(shí)，隨著酶濃度的增加，材料的吸附量呈線性增加，固載率維持在96%以上；當(dāng)酶濃度超過(guò)1.4mg/mL時(shí)，融合蛋白固定量飽和，固載率線性下降。綜合考慮固載量和固載率，當(dāng)酶濃度為1.4mg/mL時(shí)固定化效果較佳，此時(shí)酶的固定量為27.7mg/g。

圖2 酶濃度對(duì)固定化酶量的影響

2.2.3 時(shí)間對(duì)固定化酶量的影響

在吸附開(kāi)始階段，由于一部分融合酶分子與介孔分子篩材料孔口及靠近孔口孔道內(nèi)的羥基作用，融合酶分子停留在載體的孔口處，另一部分酶分子需克服擴(kuò)散阻力才能進(jìn)入到介孔分子篩的孔道內(nèi)部，所以研究時(shí)間對(duì)載體吸附酶量的影響至關(guān)重要。以SBA-15為載體，在酶濃度為1.4mg/mL時(shí)考察不同固定化時(shí)間載體對(duì)固定化酶的吸附量影響，結(jié)果見(jiàn)圖3。

圖3 固定化時(shí)間對(duì)固定化酶量的影響

由圖3可知，介孔分子篩材料吸附的酶量隨時(shí)間延長(zhǎng)逐漸增加，當(dāng)吸附時(shí)間為1h時(shí)，固定化酶量達(dá)到最大值27.7mg/g。再延長(zhǎng)時(shí)間，載體吸附的酶量不變，載體已達(dá)到吸附飽和。

2.2.4 金屬離子Ca2+對(duì)固定化融合蛋白活性的影響

在對(duì)影響固定化的條件優(yōu)化后，其固定化酶量達(dá)到最大值。固定化酶表現(xiàn)的活性也是另一主要研究目標(biāo)。在催化氧化還原反應(yīng)時(shí)，許多氧化還原酶需要金屬離子的參與，有些金屬離子可以激活或抑制氧化還原酶的活性[16]。

25mmol/L的Ca2+可以提高游離融合酶的活性，所以在固定化酶水相催化反應(yīng)中添加金屬離子，研究其對(duì)固定化酶活性的影響。本研究以相同條件下，游離酶催化反應(yīng)的活性為100%，結(jié)果如表2。從表2中得到，固定化后酶的活性為游離酶的58.6%，加入25mmol/L Ca2+后活性為游離酶的78.1%，提高近20%。金屬離子對(duì)固定化酶存在一定的激活作用。

表2 Ca2+對(duì)固定化酶的酶活回收率影響

2.3 固定化酶的穩(wěn)定性

2.3.1 熱穩(wěn)定性

許多研究表明，固定化操作能夠有效提高酶蛋白的剛性結(jié)構(gòu)，從而有效提高固定化酶的熱穩(wěn)定性。研究比較了30～60℃下固定化融合蛋白和游離蛋白的催化活力。

由表3可知，游離酶經(jīng)熱處理后，酶活性顯著下降，30℃酶活只有89.3%，但是固定化酶保持97.3%的活性。在高溫條件下（大于50℃）固定化酶和游離酶都幾乎失去活性。整體看固定化酶的熱穩(wěn)定性有所提高。這可能是由于一方面介孔分子篩孔道結(jié)構(gòu)提供給酶分子不易受外部環(huán)境影響的微環(huán)境，另一方面孔道表面的弱酸性羥基能夠保護(hù)酶分子的構(gòu)象不易被高溫破壞[9]。

表3 固定化酶及游離酶熱穩(wěn)定性影響

2.3.2 水相中操作穩(wěn)定性

固定化酶可從反應(yīng)系統(tǒng)中分離，從而實(shí)現(xiàn)其重復(fù)利用，固定化酶的操作穩(wěn)定性是評(píng)價(jià)固定化酶的重要參數(shù)。

由圖4可知，固定化酶在使用5次后，依舊保持50%以上的相對(duì)活性，連續(xù)反應(yīng)7批次后酶剩余活性仍保持在30% 以上，說(shuō)明采用介孔分子篩材料為載體制備的固定化酶具有較好的操作穩(wěn)定性。

圖4 固定化酶的操作穩(wěn)定性

2.3.3 有機(jī)溶劑耐受性

采用融合蛋白CR2-GDH催化COBE為S-CHBE模式反應(yīng)。高濃度的底物和產(chǎn)物對(duì)酶有毒害和抑制作用，且底、產(chǎn)物在單一水相中溶解度低，一般構(gòu)建水/有機(jī)溶劑雙相反應(yīng)體系以克服上述問(wèn)題。探討固定化酶對(duì)有機(jī)溶劑的耐受性至關(guān)重要。

有機(jī)溶劑的lgP值（疏水常數(shù)）是溶劑在正丁醇/水體系中分配常數(shù)的對(duì)數(shù)值，是評(píng)價(jià)有機(jī)溶劑對(duì)酶催化劑影響的一個(gè)重要參數(shù)[10]。

實(shí)驗(yàn)中，將游離酶和固定化酶分別放在有機(jī)溶劑中，有機(jī)溶劑分為烷烴類(lèi)、醇類(lèi)、酯類(lèi)、丙酮等。從表4中可以看出，固定化酶在有機(jī)溶劑耐受性方面較游離酶有一定優(yōu)勢(shì)，對(duì)于烷烴類(lèi)有機(jī)溶劑，固定化酶在正己烷、正辛烷、壬烷中放置后，其相對(duì)活性仍然保持76.6%、70.4%、72.5%，游離酶則是維持29.7%、38.1%、36.5%的活性。在所選的醇類(lèi)物質(zhì)中固定化酶和游離酶活性受到抑制，但是在仲辛醇中游離酶和固定化酶表現(xiàn)出90%以上的活性，源于仲辛醇的lgP值大于其他幾種醇。酯類(lèi)有機(jī)溶劑中，對(duì)于高lgP的鄰苯二甲酸二丁酯，固定化酶可以保持91.1%的活性，固定化酶和游離酶在其余兩種較低lgP的酯類(lèi)中完全失去活性。

表4 固定化酶的有機(jī)溶劑耐受性

2.4 固定化酶雙相反應(yīng)和雙相體系中重復(fù)使用性

2.4.1 固定化酶雙相反應(yīng)

由研究報(bào)道，采用吸附法固定的固定化酶適于在有機(jī)相中催化反應(yīng)，可以解決水相中酶脫落導(dǎo)致下游產(chǎn)物分離的難題[6，17]。根據(jù)1.9節(jié)中固定化酶的有機(jī)溶劑耐受性實(shí)驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)固定化酶在鄰苯二甲酸二丁酯中的酶活性依舊保持91.1%。而且文獻(xiàn)報(bào)道底物COBE、產(chǎn)物S-CHBE在鄰苯二甲酸二丁酯中的分配系數(shù)為6.2、4.2[18]。所以本研究選擇鄰苯二甲酸二丁酯為有機(jī)相，進(jìn)行后續(xù)研究。鑒于Ca2+在固定化酶水相中可以提高固定化酶的活力回收率，所以在有機(jī)相中也添加25mmol/L的Ca2+來(lái)研究其影響。結(jié)果見(jiàn)圖5。

圖5 雙相中不同反應(yīng)體系催化還原COBE的時(shí)間過(guò)程曲線

研究結(jié)果表明，在相同反應(yīng)條件下，3種反應(yīng)體系的產(chǎn)物得率有不同程度的提高（44.9%～68.7%）。圖5 所示為3種反應(yīng)體系催化還原COBE的時(shí)間過(guò)程曲線?？梢钥闯?，在反應(yīng)前2h，3種反應(yīng)體系反應(yīng)都十分迅速，之后酶在反應(yīng)體系中會(huì)失去部分活性，得率變化不明顯。游離酶在4h 后產(chǎn)物得率逐漸趨于平緩，固定化酶的產(chǎn)率仍有一定的提高，可見(jiàn)固定化酶和游離酶相比，有機(jī)溶劑耐受性更強(qiáng)。對(duì)于添加25mmol/L的Ca2+的反應(yīng)體系，在反應(yīng)前2h內(nèi)，得率遠(yuǎn)高于其他兩種體系，最終的產(chǎn)物得率達(dá)到68.7%。反應(yīng)產(chǎn)物的光學(xué)純度都>99.9%。

2.4.2 固定化酶在雙相體系重復(fù)使用性

結(jié)合2.3.2節(jié)中固定化酶在水相中操作穩(wěn)定性和2.4.1節(jié)中固定化酶在水/有機(jī)雙相中的催化研究，固定化酶在雙相體系中的重復(fù)使用性研究至關(guān)重要。

圖6 雙相中固定化酶重復(fù)使用性

由圖6可知，固定化酶可以實(shí)現(xiàn)雙相中重復(fù)使用。隨著固定化酶使用次數(shù)的增加，相對(duì)剩余活力為下降趨勢(shì)。固定化酶在雙相體系中連續(xù)催化反應(yīng)7次，相對(duì)酶活力依舊保持70.3%。相比于在水相中的穩(wěn)定性，固定化酶在有有機(jī)介質(zhì)中酶穩(wěn)定性顯著增加，源于底物在固定化酶和有機(jī)介質(zhì)中分配，疏水性底物在載體周?chē)鷿舛容^低。

3 結(jié) 論

介孔分子篩材料SBA-15可作為固定化融合蛋白CR2-GDH的較佳載體。材料為10mg，控制酶蛋白濃度為1.4mg/mL，pH值為5.5，固定化時(shí)間為1h，此時(shí)固載量為27.7mg/g。加入25mmol/L的Ca2+，可以提高固定化酶的酶活回收。

和游離酶相比，固定化酶的熱穩(wěn)定性、有機(jī)溶劑耐受性有所提高。固定化酶連續(xù)反應(yīng)7批次后酶剩余活性仍保持在30% 以上，而游離酶不能達(dá)到多批次利用的效果。

選擇鄰苯二甲酸二丁酯為有機(jī)相，進(jìn)行固定化酶催化雙相反應(yīng)。添加25mmol/L的Ca2+的固定化酶反應(yīng)體系，產(chǎn)物得率比游離酶體系提高23.8%。固定化酶在雙相中可以實(shí)現(xiàn)多批次使用，重復(fù)使用7次后，相對(duì)活性依舊保持70.3%。

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化學(xué)工業(yè)出版社好書(shū)推薦

《表面活性劑應(yīng)用原理》（第二版）

肖進(jìn)新、趙振國(guó) 編著

本書(shū)主要介紹表面活性劑的結(jié)構(gòu)、基本性質(zhì)和應(yīng)用功能。介紹了表面活性劑應(yīng)用原則，針對(duì)表面活性劑科學(xué)的最新發(fā)展，介紹了表面活性劑在眾多工業(yè)領(lǐng)域及高新技術(shù)領(lǐng)域的廣泛應(yīng)用，包括具有特殊結(jié)構(gòu)和功能的新型表面活性劑、功能性表面活性劑和特種表面活性劑等。最后介紹了表面活性劑的綠色化學(xué)，包括表面活性劑的生物降解、安全性和溫和性等。本次版本對(duì)表面活性劑最新理論進(jìn)展和應(yīng)用進(jìn)行了必要的修訂和補(bǔ)充。

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《耦合技術(shù)與萃取過(guò)程強(qiáng)化》（第二版）

戴猷元、秦?zé)?、張?編著

本書(shū)主要介紹了“場(chǎng)”、“流”分析的基本概念，有機(jī)物稀溶液絡(luò)合萃取過(guò)程，外場(chǎng)強(qiáng)化萃取過(guò)程，萃取反萃取交替過(guò)程，膜萃取過(guò)程，同級(jí)萃取反萃膜過(guò)程，萃取與發(fā)酵耦合過(guò)程，酶膜反應(yīng)過(guò)程及親和膜過(guò)程及其他萃取強(qiáng)化過(guò)程。系統(tǒng)闡述了耦合技術(shù)及新型萃取過(guò)程的基本原理、過(guò)程特征、各類(lèi)體系的分離工藝和應(yīng)用實(shí)例。本次修訂對(duì)近幾年“耦合技術(shù)”、“過(guò)程強(qiáng)化”的新應(yīng)用進(jìn)行了補(bǔ)充。

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Immobilization of fusion enzyme CR2-GDH and bioreduction of ethyl (S)-4-chloro-3-hydroxybutyrate

WANG Shuang，MU Xiaoqing，NIE Yao，ZHANG Rongzhen，XU Yan
（The Key Laboratory of Industrial Biotechnology，Ministry of Education，School of Biotechnology，Jiangnan University，Wuxi 214122，Jiangsu，China）

Mesoporous molecular sieves SBA-15 was the best one among 4 kinds of carriers in terms of both carrier content and recovery of enzyme activity. The remaining carriers were MCM-41，modified silica，and calcium alginate. Immobilization of fusion enzyme CR2-GDH on SBA-15 was realized，and effect of immobilization conditions on immobilization content and activity，stabilization of immobilized enzyme，asymmetric reduction in biphasic system was investigated. The results showed that adsorption capacity was 27.7mg/g carrier under the condition of pH5.5，enzyme concentration 1.4mg/mL，reaction time of one hour. The recovery of immobilized enzyme activity was increased by near 20% adding metal ion Ca2+of 25mmol/L. It was also found that the thermal and operational stabilities of the immobilized enzyme were higher than those of free enzyme. The recovery was increased by 19.1% at the temperature of 40℃. Immobilized enzyme was not more sensitive to organic solvents especially alkanes than free enzyme. In biphasic system，the production yield obtained by Ca2+/SBA-15 immobilized enzyme was increased by 23.8%.

fusion enzyme ; SBA-15; immobilization; biphasic system; bioreduction

Q 814.2

：A

：1000-6613（2015）11-4047-07

10.16085/j.issn.1000-6613.2015.11.036

2015-03-06；修改稿日期：2015-04-08。

王爽（1989—），女，碩士研究生。聯(lián)系人：聶堯，教授，主要研究方向?yàn)樯锎呋?。E-mail nieybird@hotmail.com。