五藤膠囊的薄層色譜定性鑒別及其補骨脂素HPLC定量研究

李萬紅

海安縣中醫(yī)院，江蘇 海安 226600

五藤膠囊由雞血藤、青風藤、海風藤、石楠藤、絡石藤、補骨脂等藥物組成，具有祛風通絡、溫經(jīng)壯骨功效，對各類關(guān)節(jié)疾病有良好的治療效果。本文采用薄層色譜法對雞血藤［1-2］、青風藤［3］、補骨脂等進行定性鑒別［4］，并采用HPLC法對五藤膠囊內(nèi)容物中補骨脂素進行定量分析，為本品的質(zhì)量控制提供實驗依據(jù)。

1 薄層色譜定性鑒別

1.1 材料 雞血藤、海風藤、補骨脂、威靈仙等(購自南通三越中藥飲片有限公司，經(jīng)陳峰生主任中藥師鑒定)；五藤膠囊 (海安縣中醫(yī)院，批號：111228，120420，120711)；芒丙花素、青藤堿、補骨脂素(供定性鑒別用，購自中國藥品生物制品檢定所)。

1.2 儀器 PBQ-Ⅰ型自動鋪板器(重慶南岸動力儀器廠)，HH4數(shù)顯恒溫水浴鍋 (常州國華電器有限公司)，紫外透射反射儀(北京六一儀器廠)，數(shù)碼相機(英國)，KQ-500超聲波清洗器(上海超聲波儀器廠)等。

1.3 試劑 正己烷、石油醚(60～90℃)、無水乙醇、正丁醇、甲苯、苯、乙酸乙酯、甲醇、乙醚、三氯甲烷、碘化鉍鉀、亞硝酸鈉等，均為分析純。

1.4 薄層板的制備

1.4.1 硅膠G CMC-Na板的制備 取硅膠G75g，加0.5%CMC-Na溶液180mL，調(diào)成糊狀，用自動鋪板器鋪成4mm厚薄板，置水平桌面上通風陰干后，110℃活化30分鐘，備用。

1.4.2 氫氧化鈉-硅膠G板的制備 取硅膠G 60 g，加入含2%氫氧化鈉的0.5%CMC-Na溶液150mL，調(diào)成糊狀，用自動鋪板器鋪成4mm厚的薄層板，置水平桌面上通風晾干后，110℃活化30分鐘，備用。

1.5 薄層色譜鑒別［5］

1.5.1 雞血藤

1.5.1.1 對照品溶液的配制 取芒丙花素對照品，加甲醇制成每1mL含1mg的溶液，作為對照品溶液。

1.5.1.2 供試品溶液的制備 取本品粉末1 g，加入乙醇100mL，加熱回流1小時，濾過，濾液蒸干，殘渣加甲醇2mL使溶解，加入1 g硅膠拌勻，揮干溶劑，置硅膠柱中(2 g，內(nèi)徑 1.0 cm，100～200目，干法裝柱)，依次使用石油醚(60～90℃)30mL、甲醇-三氯甲烷(1∶9)40mL洗脫，收集甲醇-三氯甲烷(1∶9)洗脫液，蒸干，殘渣加0.5mL三氯甲烷使溶解，作為供試品溶液。

1.5.1.2 對照藥材溶液的制備 取雞血藤藥材1 g，同上述供試品溶液制備方法制成對照藥材溶液。

1.5.1.3 陰性供試品溶液的制備 據(jù)處方比例量，取除雞血藤外的其余藥味按工藝要求制成缺雞血藤的樣品，按供試品溶液制備方法，制備陰性供試品溶液。

1.5.1.4 點樣、展開 照薄層色譜法(附錄Ⅵ B)試驗，吸取上述供試品溶液10μL、對照品溶液5μL分別點于同一硅膠G薄層板上，以三氯甲烷-甲醇(20∶1)為展開劑，展開，取出，晾干。

1.5.1.4 顯色與結(jié)果 置紫外光燈 (254 nm)下檢視，供試品色譜中，在與對照品色譜相應的位置上，顯相同顏色的熒光斑點。結(jié)果見圖1。

圖1 雞血藤TLC鑒別圖譜

1.5.2 青風藤

1.5.2.1 對照品溶液的制備 取青藤堿對照品，加乙醇制成每1mL含1mg的溶液，作為對照品溶液。

1.5.2.2 供試品溶液的制備 取本品粉末2 g，加乙醇25mL，加熱回流1小時，濾過，濾液蒸干，殘渣加乙醇1mL使溶解，作為供試品溶液。

1.5.2.3 對照藥材溶液的制備 取青風藤藥材粉末約1 g，依上述供試品溶液制備方法制備藥材對照液。

1.5.2.4 陰性供試品溶液的制備 據(jù)處方比例量，取除青風藤外的其余藥味按工藝要求制成缺青風藤的樣品，按供試品溶液制備方法，制備陰性供試品溶液。

1.5.2.5 點樣、展開 照薄層色譜法(附錄Ⅵ B)試驗，吸取上述溶液各5μL，分別點于同一用2%氫氧化鈉溶液制備的硅膠G薄層板上，以甲苯-乙酸乙酯 -甲醇 -水(2∶4∶2∶1)10℃以下放置的上層溶液為展開劑，置濃氨試液預飽和20分鐘的展開缸內(nèi)，展開，取出，晾干。

1.5.2.6 顯色與結(jié)果 依次噴以碘化鉍鉀試液和亞硝酸鈉乙醇試液，供試品色譜中，在與對照品色譜相應的位置上，顯相同顏色的斑點。結(jié)果見圖2。

圖2 青風藤TLC鑒別圖譜

1.5.3 補骨脂

1.5.3.1 對照品溶液的制備 取補骨脂素對照品，加乙酸乙酯制成每1mL含1mg的溶液，作為對照品溶液。

1.5.3.2 供試品溶液的制備 取本品藥粉5 g，加石油醚(60～90℃)50mL，回流 30分鐘，濾過，取藥渣揮去石油醚，加乙酸乙酯50mL，回流30分鐘，濾過，濾液揮干，殘渣加乙酸乙酯1 mL使溶解，作為供試品溶液。

1.5.3.3 對照藥材溶液的制備 取補骨脂藥材粉末約0.5 g，加乙酸乙酯20mL，超聲處理15分鐘，濾過，濾液蒸干，殘渣加乙酸乙酯1mL使溶解，作為對照藥材溶液。

1.5.3.4 陰性供試品溶液的制備 據(jù)處方比例量，取除補骨脂外的其余藥味按工藝要求制成缺補骨脂的樣品，按供試品溶液制備方法，制備陰性供試品溶液。

1.5.3.5 點樣、展開 照薄層色譜法(附錄Ⅵ B)試驗，吸取上述溶液各4μL，分別點于同一硅膠G薄層板上，以正己烷-乙酸乙酯(4∶1)為展開劑，展開，取出，晾干。

1.5.3.6 顯色與結(jié)果 噴以10%氫氧化鉀甲醇溶液，置紫外光燈(365 nm)下檢視。供試品色譜中，在與對照品色譜相應的位置上，顯相同的藍白色熒光斑點。結(jié)果見圖3。

圖3 補骨脂TLC鑒別圖譜

2 補骨脂素的含量測定

2.1 實驗材料與實驗儀器 五藤膠囊(海安縣中醫(yī)院，批號：111228，120420，120711)；補骨脂素對照品 (中國藥品生物制品檢定所，批號：110766-200414)；甲醇、乙腈(色譜純)，超純水(自制)，其余試劑均為分析純。Agi lent 1100高效液相色譜儀；VWD紫外檢測器；AET-40SM型1/10萬電子天平(日本Shimad公司)；UV-2401型紫外分光光度計(日本島津公司)。

2.2 色譜條件 色譜柱：Kromasi l C18柱 (250×4.6 mm)；流動相的選擇；經(jīng)預試驗，以甲醇-乙腈-1%乙酸(15∶25∶60)作為流動相，測定波長為246 nm，補骨脂素峰與雜質(zhì)峰分離度較好。流速：1.0 mL/min；柱溫：30℃；靈敏度：AUFS=1.0。系統(tǒng)試驗適應性研究：在上述條件下測定樣品中補骨脂素的含量，以補骨脂素峰計算理論板數(shù)應不低于3 000。

2.3 對照品溶液、供試品溶液、陰性供試品溶液的制備

2.3.1 對照品溶液的制備 精密稱定補骨脂素對照品0.294mg，置10mL容量瓶中，加甲醇稀釋至刻度，即得濃度為29.40μg/mL的對照品溶液。

2.3.2 供試品溶液的制備 取五藤膠囊內(nèi)容物適量，精密稱定約0.5 g，置索氏提取器中，加甲醇適量，加熱回流提取2小時，放冷，轉(zhuǎn)移至100mL容量瓶中，加甲醇稀釋至刻度，搖勻，用微孔濾膜(0.45μm)濾過，作為供試品溶液。

2.3.3 陰性供試品溶液的制備 據(jù)處方比例量，取除補骨脂外的其余藥味按工藝要求制成缺補骨脂的陰性供試品，再按供試品溶液制備方法，制備陰性供試品溶液。

2.4 空白試驗 精密吸取對照品溶液、陰性供試品溶液、供試品溶液各10μL注入液相色譜儀。結(jié)果表明處方中其它藥材對補骨脂素測定無干擾。結(jié)果見圖4—6。

圖4 補骨脂素對照品HPLC色譜圖

圖5 補骨脂陰性供試品HPLC色譜圖

圖6 五藤膠囊中補骨脂素的HPLC色譜圖

2.5 補骨脂素線性關(guān)系考察 精密稱取補骨脂素對照品7.35 mg，置25 mL棕色容量瓶中，加甲醇溶解并稀釋至刻度，搖勻，即得補骨脂素對照品儲備液（濃度為294μg/mL）。再依次分別精密吸取對照品儲備液 0.4、1、1.6、2.2、2.8mL置 10mL容量瓶中，分別加甲醇稀釋至刻度，即得濃度為11.76、29.40、47.04、64.68、82.32μg/mL的對照品溶液。依次吸取上述對照品溶液各20μL進樣，測定峰面積。以進樣補骨脂素質(zhì)量為橫坐標，以峰面積的積分值為縱坐標，繪制標注曲線，回歸方程為 y=42.194x+0.408，r=0.999 9，線性范圍：11.76～82.32μg/mL。結(jié)果見表1與圖7。

表1 補骨脂素標準曲線的測定數(shù)據(jù)

圖7 補骨脂素標準曲線

2.6 精密度實驗 精密吸取的補骨脂素對照品溶液（濃度為 47.04μg/mL）20μL，重復進樣 6次，測得峰面積，計算RSD值為1.03%。結(jié)果見表2。

表2 補骨脂素精密度實驗結(jié)果

2.7 穩(wěn)定性試驗 取同一供試品溶液每隔一段時間進樣1次，每次20μL，測定峰面積，結(jié)果表明樣品溶液在8小時內(nèi)穩(wěn)定，結(jié)果見表3。

表3 補骨脂素穩(wěn)定性試驗結(jié)果

2.8 重復性實驗 取批號為120420的膠囊，按供試品溶液的制備方法制備供試品溶液，平行試驗6份，進樣20μL，測定峰面積，結(jié)果見表4。

表4 補骨脂素重復性試驗結(jié)果(n=6)

2.9 回收率實驗 精密稱取已知補骨脂素含量為3.62 mg/g的五藤膠囊(批號：120420)粉末5份，每份約80mg，分別加入濃度為29.4μg/mL的補骨脂素標準溶液 8、8、10、10、15mL，按供試品溶液的制備方法制備供試品溶液，進樣，測定峰面積。平均回收率為99.75%，RSD值為1.09%。結(jié)果見表5。

2.10 樣品含量測定 分別精密稱取3個批號五藤膠囊的內(nèi)容物，每份約0.5 g，按供試品溶液的制備方法制備，進樣20μL，依法測定，結(jié)果見表6。

根據(jù)測定結(jié)果，暫定五藤膠囊內(nèi)容物中補骨脂素含量不得低于3mg/g。

表5 補骨脂素回收率試驗結(jié)果

表6 樣品中補骨脂素含量測定結(jié)果

3 討論

五藤膠囊以雞血藤、青風藤、海風藤、石楠藤、絡石藤等5味莖(藤)木類中藥為主藥，共奏祛風濕、通經(jīng)絡、蠲痹痛之功，具抗炎、鎮(zhèn)痛、免疫抑制作用；制川烏、制草烏、干姜、細辛祛風通絡，溫經(jīng)止痛，亦具抗炎、免疫作用；豨薟草、威靈仙祛風化濕；全蝎、僵蠶、烏梢蛇熄風止痙，祛風活血，能輔助主藥增強祛風通絡作用；生地黃性味甘寒，可抑制諸藥燥熱之性，生地黃本身也具有抗炎和促進免疫作用；鹿角霜、補骨脂溫腎助陽兼治因風濕性疾病引起的骨代謝紊亂。諸藥合用具有祛風通絡、溫經(jīng)壯骨的功效，可用于治療類風濕性關(guān)節(jié)炎、風濕性關(guān)節(jié)炎、增生性關(guān)節(jié)炎等，尤其用于治療強直性脊柱炎取得令人滿意的效果［6］。

對五藤膠囊的主要成份用薄層色譜定性鑒別和采用HPLC法對膠囊內(nèi)容物主要指標成份進行定量分析。方法先進，重現(xiàn)性、可行性好［7-8］，為五藤膠囊的質(zhì)量控制提供依據(jù)。本方經(jīng)本院臨床使用，療效確切，深受患者歡迎。本品其他組份的定性定量分析方法有待進一探討。

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