反向激動劑的特性和研究進展

曹永孝，于瑞紅

（西安交通大學醫(yī)學部，陜西西安 710061）

反向激動劑（inverse agonist）又名負性激動劑（negative agonist），是一種新的作用于受體的藥物類型。其概念的提出可追溯到20世紀80年代，由于其特別的作用方式和臨床價值，已成為近年來的熱門研究課題。反向激動劑單獨使用時，能產(chǎn)生效應，而拮抗劑單獨使用不產(chǎn)生效應，因而不同于拮抗劑；反向激動劑單獨使用雖然能產(chǎn)生效應，但沒有內(nèi)在活性，又不同于激動劑。因而其與經(jīng)典的受體激動劑和拮抗劑既相似、又不同，機制比較復雜。本文從反向激動劑的研究歷程、相關理論以及臨床應用等方面進行綜述，以期更好地認識反向激動劑。

1 反向激動劑的研究歷程

1．3 反向激動劑概念的提出 1982年，鑒于在γ-氨基丁酸-苯二氮受體復合物中，β-卡波啉乙酯能降低GABA對受體的親和力、減弱GABA能神經(jīng)傳導，與苯二氮類激動劑的作用恰好相反，POLC提出了反向激動劑（inverse agonist）的概念［7］。盡管這種提法僅涉及表觀藥理效應，未涉及到作用本質(zhì)，也缺乏理論基礎，但其反映了這類配體特殊的藥理作用。需要指出的是，國內(nèi)文獻多認為此概念系1986年由EHLERT首次提出［9］，也有人認為是1985年由CODDING提出［10］，事實上在此之前，“inverse agonist”這一術語已經(jīng)廣泛應用于國際文獻中，用于表述以β-卡波啉乙酯為代表的這一新的配體類別。

1．4 二態(tài)模型解釋反向激動劑的作用 1982年NUTT在對β-卡波啉乙酯和苯二氮受體特異性拮抗劑Ro15-1788的作用差異性進行分析時，提出了二態(tài)模型的假設［8］。1986年EHLERT根據(jù)前人的實驗結果進行了假設性推論，運用受體二態(tài)模型，借助親和力常數(shù)，量化分析了反向激動劑、激動劑和拮抗劑的特點，明確了各自作用的靶構象。二態(tài)模型認為G蛋白耦聯(lián)受體存在激活態(tài)（active，Ra）和靜息態(tài)（inactive，Ri）兩種構象，二者可相互轉(zhuǎn)化，并處于動態(tài)平衡，但只有Ra構象的受體可以激活下游信號通路并發(fā)揮生物效應。而反向激動劑對靜息態(tài)構象受體有高親和力［11］。目前看來，這是一種接近合理的假說，它使受體領域的若干謎團得以解開。

1．5 受體的固有活性是反向激動劑的作用基礎EHLERT在論述受體二態(tài)模型時，提出受體可能存在基礎活性［11］。G蛋白耦聯(lián)受體在活化狀態(tài)下，GTP酶活性增高，故GTP酶活性可作為G蛋白耦聯(lián)受體激活的標示。1989年，COSTA等［12］通過對GTP酶活性的檢測證實有些受體在沒有激動劑的情況下也具有一定活性，能自發(fā)性地產(chǎn)生效應。他通過H3PO4捕獲再用活性炭檢測的方法，發(fā)現(xiàn)在不加入激動劑的情況下，NG108-15細胞株胞膜上的δ-阿片受體能顯示活性，表現(xiàn)在與受體耦聯(lián)的G蛋白有GTP酶活性；用反向激動劑ICI 174孵育后，GTP酶活性明顯受到抑制，該實驗為反向激動劑的作用機制提供了實質(zhì)性證據(jù)。以無激動劑時GTP酶活性為分母，用GTP酶的活性比表示藥物效應，δ-阿片受體的激動劑DADLE和反向激動劑ICI 174分別呈現(xiàn)了大于1的S型和小于1的倒S型量效曲線（圖1）。圖1中y＝1的虛線即δ-阿片受體的固有活性。1993年SAMAMA等［13-14］以類似的方法證明了突變的β2-腎上腺素受體也存在固有活性，并將其提升為一種理論。

至此，反向激動的作用機制基本明朗，并逐步得到認可。認為反向激動劑通過與靜息態(tài)構象受體結合，拮抗受體的固有活性，使其向沒有活性的方向轉(zhuǎn)變，表現(xiàn)出與激動劑相反的效應。隨后繼續(xù)研究其他受體及其配體，例如感染人類巨細胞病毒后，促成US28受體在宿主細胞表達，該受體具有固有活性，可被其反向激動劑VUF2274拮抗［15］，拓展了反向激動劑的研究廣度。反向激動劑的普遍性及臨床價值得到廣泛關注，近年來研究較多的有大麻素受體、雌激素受體、5-羥色胺受體、組胺受體等相應的反向激動劑［16-19］。

圖1 NG108-15細胞膜δ-阿片受體的GTP酶活性［12］Fig．1 GTPase activity ofδ-opioid ligands in NG108-15cell membrane

2 反向激動劑的相關理論

2．1 受體固有活性 固有活性（constitutive activity），又名自發(fā)活性或組成性活性，是指G蛋白耦聯(lián)受體系統(tǒng)在無激動劑作用的情況下，部分受體處于活化狀態(tài)，能夠自發(fā)產(chǎn)生一定程度的基礎效應。拮抗劑也因此分為不影響受體固有活性的中性拮抗劑和可以抑制固有活性的反向激動劑。這里的中性拮抗劑即以往經(jīng)典的拮抗劑。然而，經(jīng)典的受體學說認為受體在無激動劑時，處于靜息態(tài)，不產(chǎn)生效應；當受體與激動劑結合后，被激動，受體活化，產(chǎn)生效應。固有活性概念的提出是對經(jīng)典受體學說的補充和完善。

從1989年COSTA等［12］首次證實了固有活性的存在，到1995年5種G蛋白耦聯(lián)受體被證實系固有活性受體，相應反向激動劑也被發(fā)現(xiàn)，分別是δ-阿片受體、β2腎上腺素受體、5-HT2C受體、緩激肽B2受體、M型乙酰膽堿受體［20］。之后大批的固有活性受體被證實。目前相信幾乎所有G蛋白耦聯(lián)受體，包括孤兒受體均具有固有活性，只是活性程度不同。

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已證實包括視紫紅質(zhì)受體、腎上腺素受體、谷氨酸受體在內(nèi)的多種G蛋白耦聯(lián)受體固有活性的生成源于對第Ⅲ、第Ⅴ、第Ⅵ和第Ⅶ跨膜螺旋兩兩之間氫鍵的破壞導致了跨膜螺旋的重排，受體活化的限制因素被解除［21］。另外，5-羥色氨受體則因帶正電荷的氨基酸產(chǎn)生的排斥力導致第Ⅲ跨膜區(qū)C末端的外移而活化［22］。簡而言之，受體固有活性的生成實際上是激動劑以及突變、自身抗體等病理因素介導下胞質(zhì)側(cè)G蛋白結合位點的暴露，涉及跨膜螺旋的移位，包括外化或內(nèi)化。

固有活性理論的提出均基于G蛋白耦聯(lián)受體，那么其他類型的受體，例如離子通道型受體是否存在固有活性？張厚利等［10］認為除G蛋白耦聯(lián)受體外，其余受體類型均屬靜態(tài)受體系統(tǒng)，即不具備固有活性，因而不存在反向激動劑的問題。然而，最近發(fā)現(xiàn)重組甘氨酸受體以及野生型甘氨酸受體具有固有活性［23］，甘氨酸受體是配體門控離子通道受體，介導中樞抑制性信號的傳導。

生理狀態(tài)下絕大多數(shù)受體固有活性處于低水平，病理狀態(tài)下受體固有活性可以增強。而受體高表達、受體基因突變、單核苷酸多態(tài)性、RNA剪接異常以及受體自身抗體等因素參與了病理性固有活性的調(diào)節(jié)［20］。受體高表達屬于受體的量變，在相加作用下固有活性更加明顯。而其他因素導致受體結構改變，加強了受體激活態(tài)構象的形成和維持，使受體的固有活性保持在較高水平。

2．2 反向激動劑的作用機制 反向激動劑是一種新的配體類別，其作用機制可以用受體的占領學說和二態(tài)模型學說來解釋。其作用的前提是受體固有活性。許多G蛋白耦聯(lián)受體在沒有配體作用的情況下，部分受體具有固有活性，即能自發(fā)地激動而產(chǎn)生效應。按照占領學說的理論，反向激動劑能與受體結合，拮抗受體的固有活性，從而產(chǎn)生與相應激動劑作用方向相反的效應。而受體二態(tài)模型理論認為受體效應取決于受體激活態(tài)（Ra）構象受體的數(shù)目，而配體能夠調(diào)節(jié)靜息態(tài)（Ri）與激活態(tài)間的比例。反向激動劑（I）與受體的作用可表示如下：

反向激動劑與受體靜息態(tài)構象結合，形成反向激動劑-受體靜息態(tài)（IRi）形式，靜息態(tài)構象被鎖定，不能轉(zhuǎn)化為激活態(tài)；與無配體結合時的固有狀態(tài)比較，此時未結合反向激動劑的游離型Ri減少，Ra和Ri之間的平衡被打破，一定量的Ra轉(zhuǎn)化為Ri，即激活態(tài)構象靜息態(tài)化，達成新的動態(tài)平衡；轉(zhuǎn)化來的Ri又被反向激動劑結合而鎖定，接著又有Ra向Ri轉(zhuǎn)化，如此循環(huán)往復，直至Ra構象的數(shù)目不同程度地接近0，固有活性降低甚至消失，表現(xiàn)出與激動劑相反的效應。反向激動劑也可分為完全型和部分型，完全反向激動劑可使Ra構象全部靜息態(tài)化，固有活性完全消失，受體處于無任何效應的零狀態(tài)；部分反向激動劑的效能較低，固有活性不同程度被減弱。

以首次發(fā)現(xiàn)的反向激動劑β-卡波啉乙酯為例，具體闡述反向激動劑的作用機制。γ-氨基丁酸-苯二氮受 體 復 合 物 （γ-aminobutyric acid-benzodiazepine receptor complex）是β-卡波啉乙酯發(fā)揮作用的受體系統(tǒng)，本質(zhì)上是一種離子通道受體，其核心結構是GABA受體和氯離子通道蛋白。GABA受體激活，則氯離子通道開放。該復合物還包括苯二氮受體、巴比妥類的結合位點等功能單位，用于輔助核心結構的功能。

圖2 苯二氮受體對GABA效應的調(diào)節(jié)Fig．2 Regulation of benzodiazepine receptor on GABAergic effect

圖3 完全激動劑、部分激動劑、拮抗劑和反向激動劑的濃度效應曲線Fig．3 Concentration-effect curve of full agonist，partial agonist，antagonist，and inverse agonist

2．3 反向激動劑的特性 完全激動劑、部分激動劑、拮抗劑和反向激動劑的濃度-效應曲線如圖3?？捎谜碱I學說解釋，完全激動劑能與受體結合，并激動受體，產(chǎn)生強的效應。拮抗劑與受體結合，但無內(nèi)在活性，不激動受體，因而不產(chǎn)生效應。反向激動劑與受體結合，拮抗受體的固有活性，使受體的固有活性降低，或不發(fā)揮作用，因而產(chǎn)生與激動劑作用方向相反的效應。也可用二態(tài)模型解釋，即激動劑與受體激活態(tài)構象結合，并激動受體，使構象平衡轉(zhuǎn)向激活態(tài)，產(chǎn)生遠高于固有活性的效應。拮抗劑與激活態(tài)和靜息態(tài)構象均能結合，沒有選擇性，使受體構象平衡回復并保持在無配體時的固有活性狀態(tài)。反向激動劑與受體靜息態(tài)構象結合，拮抗受體的固有活性，使受體不發(fā)揮作用。

2．3．1 反向激動劑與激動劑 激動劑與反向激動劑均能產(chǎn)生效應，但反向激動劑的效應與激動劑方向相反；二者的機制不同，激動劑因激動受體產(chǎn)生作用，而反向激動劑因拮抗受體固有活性，使受體去激活而產(chǎn)生作用。前者具有內(nèi)在活性，后者無內(nèi)在活性。

對同一受體，反向激動劑與激動劑可以在不同亞型之間以及野生型與突變型之間進行角色互換。ICI182780在小鼠子宮野生型雌激素受體上是反向激動劑，而在該受體的突變體表現(xiàn)激動劑的效應［25］。CANAL［26］發(fā)現(xiàn)了一種復合物（-）-MBP既是5-羥色氨2C受體特異性的激動劑，同時也是5-羥色氨2A受體的反向激動劑。同種受體的不同亞型之間以及野生型與突變型之間其配體的結合部位結構是極其相似的，同一配體作用于不同受體位點，通過不同形式的變構調(diào)節(jié)機制發(fā)揮不同性質(zhì)的效應，體現(xiàn)了配體的功能選擇性。

2．3．2 反向激動劑與拮抗劑 反向激動劑與拮抗劑均無內(nèi)在活性，對受體作用的實質(zhì)均是拮抗。反向激動劑通過拮抗受體的固有活性而產(chǎn)生效應；而拮抗劑單獨應用時不產(chǎn)生效應，可通過拮抗激動劑的作用而體現(xiàn)其效應。

反向激動劑是從拮抗劑中派生出來的，具有拮抗劑的特性。2004年的一項研究調(diào)查顯示，多達85%的反向激動劑曾被認為是拮抗劑［27］。由于在生理狀態(tài)下多數(shù)受體的固有活性處于低水平，即使有些藥物具有反向激動作用，也不易發(fā)現(xiàn)，此時反向激動劑以拮抗激動劑的效應為主導。只有在某些病理狀態(tài)下或采用分子生物學手段使固有活性顯著，其反向激動效應才顯現(xiàn)。

一部分拮抗劑在高濃度下可能具有反向激動劑的效應［8］。不難理解，雖說拮抗劑對受體靜息態(tài)和激活態(tài)沒有選擇性，但畢竟兩種構象存在結構差異，拮抗劑對它們的親和力并不絕對相同。當拮抗劑以很高濃度與受體結合時，對兩種構象親和力的細微差別便被擴大化，對激活態(tài)構象親和力稍高時便表現(xiàn)了部分激動效應。同理可推測，高濃度下另外一部分的拮抗劑可能表現(xiàn)部分反向激動效應。

3 反向激動劑的臨床應用

3．1 反向激動劑與受體固有活性增強性疾病 先天性靜止性夜盲是一種由遺傳因素引起的先天性眼病，暗視力差。黑暗環(huán)境中，視紫紅質(zhì)受體靜息態(tài)構象的維持對感光細胞保持高靈敏度有重要意義?；蛲蛔兛蓪е略撌荏w固有活性增強，感光細胞脫敏，形成先天性夜盲［28］。促黃體生成素受體突變致家族遺傳性男性性早熟，促甲狀腺激素受體突變致甲狀腺瘤或甲亢，鈣離子敏感受體突變可導致低鈣血癥和高尿鈣，均與受體固有活性增強有關。對于這類疾病，反向激動劑可拮抗固有活性介導的類內(nèi)源性激動劑的效應，緩解癥狀，改善病情。

腎移植患者發(fā)生同種異體移植排斥反應源于移植物刺激下產(chǎn)生血管緊張素Ⅱ1型（AT1）受體特異性的自身抗體［29］，造成血管緊張素Ⅱ樣作用使AT1受體的下游信號級聯(lián)放大。洛沙坦（losartan）可消除這種移植排斥反應，是腎移植排斥反應的特效藥；而血漿透析去除抗體以及注射免疫球蛋白僅能使排異反應得到一定程度改善［29］。洛沙坦被證實是AT1受體的反向激動劑。Graves病的發(fā)生與促甲狀腺激素受體刺激性抗體 （thyroid stimulating antibody，TSAb）有關，TSAb與促甲狀腺激素受體結合，促進甲狀腺細胞增生，增加甲狀腺激素的合成和分泌。上述兩種疾病的發(fā)病機制相似，抗體大幅度增加受體的固有活性，這種高固有活性表現(xiàn)出的效應與激動劑過度激動受體表現(xiàn)的亢進效應相同，反向激動劑為該類疾病提供了理想的治療策略。

3．2 反向激動劑上調(diào)和增敏固有活性受體 長期應用激動劑可使受體下調(diào)，表現(xiàn)為受體數(shù)量減少。在促甲狀腺激素釋放激素受體、β1腎上腺素受體、α1腎上腺素受體、組胺H2受體，已證實反向激動劑可逆轉(zhuǎn)受體固有活性的下調(diào)。受體失敏常由激酶引起，受體發(fā)生磷酸化或與抑制蛋白結合，抑制蛋白促進受體的內(nèi)化。2002年 MISEREY［30］發(fā)現(xiàn)AT1受體突變體經(jīng)反向激動劑洛沙坦孵育后，內(nèi)化的受體重新定位到細胞膜上，這個過程使AT1受體對激動劑敏感性增加并促進固有活性恢復。5-羥色氨受體、前列腺素受體上也存在反向激動劑的增敏作用［31-32］。但反向激動劑的這種增敏和上調(diào)作用是否具有普遍性，以及具體分子機制還有待研究。

反向激動劑上調(diào)和增敏固有活性受體的結果有利有弊。一方面，長期使用反向激動劑治療受體固有活性增強性疾病，會引起固有活性受體上調(diào)，并使其對激動劑的敏感性增加，對病情不利。要產(chǎn)生理想的效應，須增加反向激動劑的劑量，形成藥物耐受。但停用反向激動劑會導致疾病復發(fā)，甚至反跳。另一方面，這種上調(diào)和增敏作用是有益的。2002年LEVIN［33］發(fā)現(xiàn)有些心衰患者β1腎上腺素受體的密碼子發(fā)生突變，這種突變對心衰的治療有利。經(jīng)此突變的心衰患者β1腎上腺素受體具有更明顯的固有活性。用反向激動劑美托洛爾治療，并非因其抑制β1腎上腺素受體增高的固有活性，而是基于其上調(diào)受體的作用，受體的上調(diào)有利于內(nèi)源性兒茶酚胺更好地發(fā)揮興奮心臟效應，加之突變的β1腎上腺素受體本身具有較高的固有活性，因而，有此突變的心衰患者用美托洛爾治療后，長期存活率明顯提高。

3．3 內(nèi)源性反向激動劑維持特定生理功能 最新發(fā)現(xiàn)組胺是中樞甘氨酸受體的反向激動劑，作為內(nèi)源性的調(diào)節(jié)因子參與調(diào)控該受體的功能［23］。另外，黑皮質(zhì)素受體家族在生理情況下固有活性處于較高水平［34］，作為內(nèi)源性的反向激動劑，agouti相關肽以及它的小片段通過抑制黑皮質(zhì)素受體的固有活性，維持正常的攝食行為和色素沉著功能，防止黑色素瘤和肥胖的發(fā)生，說明反向激動劑承擔著一定的生理功能。

4 展 望

近30年來，反向激動劑的研究已經(jīng)取得了長足進展，其機制已基本清楚，研究的廣度增大，成批的反向激動劑被發(fā)現(xiàn)。但有些問題仍然有待解決，例如，與激動劑相比較，作用于同一受體的反向激動劑的結構有何特殊之處？其特異性結合的受體有何特殊結構？只有獲取了這方面信息才能合成、篩選，甚至高通量、高靶向地研發(fā)反向激動劑，更好地治療疾病。

反向激動劑及受體固有活性理論為固有活性增強性疾病的發(fā)病機制、診斷與治療提供了新的思路，深入研究反向激動劑及其機制，對于完善受體學說有重要的理論意義，對于固有活性增強性疾病的診斷和治療具有重要的臨床意義。

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